Epstein-Barr virus-specifici metilazione dei geni umani in cellule di cancro gastrico

Epstein-Barr metilazione specifici per il virus dei geni umani in cellule di cancro gastrico
Abstract
sfondo
Epstein-Barr Virus (EBV) si trova nel 10% di tutti gli adenocarcinomi gastrici, ma il suo ruolo nello sviluppo del tumore e resti di manutenzione poco chiaro. L'obiettivo di questo studio era di esaminare disregolazione EBV-mediata di fattori cellulari implicati nella carcinogenesi gastrica.
Metodi
espressione genica modelli sono stati esaminati in EBV-negativi e AGS cellule epiteliali gastriche EBV-positivo con un microarray a bassa densità, PCR trascrizione inversa, macchie istochimiche, e specifici metilazione del DNA sequencing. L'espressione di PTGS2 (COX2) è stata misurata in cellule AGS e nei tessuti con adenocarcinoma gastrico primarie.
Risultati
Negli studi di array, quasi la metà dei 96 geni umani testati, in rappresentanza di 15 differenti vie di trasduzione del segnale correlati al cancro, sono stati disregolato dopo l'infezione da EBV. La trascrizione inversa PCR ha confermato impatto significativo sui fattori che hanno diverse funzioni come la regolazione del ciclo cellulare (IGFBP3
, CDKN2A, CCND1, HSP70, ID2, ID4)
, la riparazione del DNA (BRCA1, TFF1
), adesione cellulare ( ICAM1
), infiammazione (COX2
), e l'angiogenesi (HIF1A
). Demetilazione usando 5-aza-2'-deossicitidina invertito la disregolazione EBV-mediata per tutti i 11 geni elencati qui. Per alcune sequenze del promotore, CpG isola metilazione e demetilazione si è verificato in un modello specifico per EBV come mostrato da bisolfito sequenziamento del DNA. L'immunoistochimica è stata meno sensibile di quanto non fosse Western Blot per la rilevazione sottoregolazione di COX2 sulla infezione da EBV. disregolazione legati ai virus dei livelli di COX-2 in vitro
non è stato ricapitolato in vivo
tra tessuti di cancro gastrico naturalmente infetti.
Conclusioni
EBV altera l'espressione del gene umano in modi che potrebbero contribuire alla patobiologia unico del virus cancro -associated. Inoltre, la frequenza e la reversibilità delle alterazioni trascrizionali di metilazione legati suggeriscono che gli agenti demetilanti hanno un potenziale terapeutico per la gestione del carcinoma EBV-correlati.
Sfondo
cancro gastrico è il quarto tipo più comune di cancro e la seconda causa di cancro morte nel mondo [1]. Una varietà di alterazioni genetiche nonché agenti ambientali infettivi e altri sembrano essere fattori nella carcinogenesi gastrica. virus di Epstein-Barr (EBV), un DNA gammaherpesvirus doppio filamento, si trova all'interno delle cellule maligne nel 10% degli adenocarcinomi gastrici, e l'infezione sembra precedere trasformazione maligna [2]. osservazioni di base e clinici suggeriscono che i tumori gastrici EBV-associati hanno un patobiologia diverso da tumori gastrici EBV-negativi [3-8]. progettazione razionale di terapia virus-diretto richiede una migliore comprensione del ruolo patogenetico di EBV nella carcinogenesi gastrica.
Studi precedenti hanno dimostrato la perdita di tre prodotti gene soppressore del tumore critici, CDH1 (E-caderina), p73, e CDKN2A (p16 ), nei tumori gastrici EBV-infettate [9-18]. Virus-associata metilazione di questi geni, insieme con la prova di metilazione del DNA globale nei tumori EBV-positivo, suggerisce che i tumori gastrici EBV-correlati sono un sottoinsieme di CpG isola methylator fenotipo (CIMP) tumori [4, 11, 19-26]. Un potenziale mediatore è DNA metiltransferasi 1 (DNMT1)
che è upregulated in tumori gastrici naturalmente infetti e potrebbe contribuire a stabilire modelli di metilazione propagate alle cellule figlie sulla divisione cellulare [21, 27-29]. Gli studi in corso sono volti a comprendere il ruolo di infezione da EBV e Helicobacter pylori nel causare infiammazione e hypermethylation globale associato durante lo sviluppo del cancro gastrico [22].
Nei modelli di linee cellulari, DNMT1 sovraespressione è mediata da EBV LMP1 e LMP2 [21, 28 -31]. EBV sembra di impiegare meccanismi epigenetici per controllare transcriptome host e anche per controllare l'espressione dei suoi geni codificati viralmente [11, 12, 14, 15, 19, 21, 24, 29, 32, 33]. Dopo l'infezione iniziale di una cella, il genoma virale non metilato può subire replicazione virale con nuova produzione virione, mentre un sottogruppo di cellule infette acquisire un genoma virale altamente metilato che squelches espressione di proteine ​​estranee e media persistenza virale a lungo termine mediante infezione latente [23, 34]. tumori infetti tendono ad avere il DNA EBV altamente metilato, e silenziamento metilazione relativi di geni virali aiuta a spiegare come i tumori infetto eludere la distruzione immunitario.
Mentre metilazione dei promotori di geni è tipicamente associato con trascrizionale sottoregolazione zona Via legame selettivo di proteine ​​repressore , la prima proteina mai mostrato di legarsi e attivare
promotore metilato era EBV BZLF1, il fattore chiave che controlla il passaggio da latente a forme replicative di infezione virale [35]. Sembra che il virus si è abilmente sviluppato un mezzo per superare metilazione del promotore a proprio vantaggio [34, 35]. strategie antivirali sono in fase di studio per il loro potenziale antineoplastica. È interessante notare che gli agenti antivirali più comunemente usati, aciclovir e ganciclovir, sono efficaci a spegnere la replicazione virale, ma non eliminano l'espressione di geni virali latenti litici e l'inizio, come LMP1, LMP2 e BZLF1.
Le implicazioni cliniche di EBV correlate metilazione del genoma del cancro gastrico sono immense. In primo luogo, prove emergenti mostra il potenziale per migliorare la diagnosi di cancro gastrico testando lavaggi gastrici per i modelli di metilazione cancro-specifica, magari in concerto con i test per EBV per identificare il sottoinsieme infetto da virus dei tumori [36-40]. Differenti modelli di metilazione del promotore nel virus-positive rispetto alle cellule virus-negativo [11, 21, 24] sottolineano la necessità di caratterizzare di metilazione in modo tale che massimizza sensibilità del test per il rilevamento del cancro. Sia l'infezione e la metilazione del DNA alterato sembrano essere eventi precoci nella carcinogenesi [2, 41], potenzialmente facilitare il rilevamento delle lesioni precancerose nel succo gastrico.
Una seconda implicazione clinica è il potenziale per migliorare il trattamento dei farmaci contro il cancro usando gastrico che invertire la effetto di ipermetilazione del promotore [42, 43]. In particolare, gli agenti che inibiscono demetilanti DNA metiltransferasi e invertire soppressore del tumore silenziamento genico o l'attivazione di oncogeni sono potenziali strategie antineoplastici [43]. È necessario tenere conto di eventuali differenze di effetto di agenti demetilanti nel virus-positivi rispetto
tumori virus-negativa [43-45]. Noi e altri hanno dimostrato che i tumori gastrici naturalmente infetti hanno CDKN2A inferiore (p16) espressione [14, 15]. In uno studio clinico di fluorouracile (5-FU) per il cancro gastrico, CDKN2A
stato promotore metilazione era un predittore indipendente di sopravvivenza [46]. Il razionale per l'utilizzo di agenti demetilanti come 5-aza-2'-deossicitidina negli studi clinici si basa su prove scientifiche che demetilanti terapia modifica le proprietà tumorali delle cellule tumorali.
Numerosi ricercatori hanno linee di cellule epiteliali con successo infettate con EBV in
vitro
[47, 48]. Nel corso di studio, AGS cellule di cancro gastrico EBV-negativi EBV-positivo e sono stati esaminati per differenze nei pattern di espressione genica mediante microarray a bassa densità e trascrizione inversa reazione a catena della polimerasi (rtPCR). AGS è una linea cellulare che è stato originariamente coltivata dal tessuto adenocarcinoma gastrico e ora è ampiamente usato come modello di cancro gastrico. Il ruolo della metilazione del DNA nel mediare effetti selezionati è stata esaminata da bisolfito sequenziamento del DNA e testando la capacità di un agente demethylating per invertire l'effetto di EBV sul silenziamento genico. I risultati hanno rivelato vasta disregolazione genica su di infezione da EBV nelle cellule AGS con evidenza che metilazione del promotore è responsabile, almeno in parte. Storno effetti trascrizionali virus associato suggerisce che gli agenti demetilanti dovrebbero essere esplorate per il loro potenziale per controllare la crescita di neoplasie EBV-correlate
. Metodi
cancro gastrico linee cellulari
La linea di cellule di cancro gastrico AGS (ATCC CRL- 1739) è stato coltivato in Modified mezzo di Eagle Dulbecco contenente il 10% di siero fetale bovino (inattivato al calore per 20 minuti a 65 ° C) e 1% di penicillina-streptomicina (10.000 unità di penicillina, 10.000 mg /ml di streptomicina, Gibco, Carlsbad, CA) . Le cellule sono state infettate con un ceppo EBV ricombinante (un dono del Dr. Henri J. Delecluse) [33, 49, 50], che è stato progettato per esprimere la proteina verde fluorescente (GFP) e igromicina resistenza B clonando questi geni nel prototipo B95 .8 ceppo EBV in cui la seconda copia del oriLyt risiede normalmente. Prima di infezione, le cellule AGS sono state trasfettate con 1 pg di una codifica CD21 vettore di espressione (il recettore EBV) e un gene di resistenza puromicina utilizzando Fugene 6 (Roche, Indianapolis, IN) come precedentemente descritto [51]. A 48 ore dopo la trasfezione, le cellule che contengono CD21 sono stati selezionati positivamente per l'utilizzo di 0,5 mg /ml di puromicina-HCl (Roche). scorte virali di EBV ricombinante sono stati generati nel rene 293 cellule, una linea di cellule embrionali epiteliali umane, inducendo replica litico con 20 ng /mL forbolo 12-tetradecanoate 13-acetato e 3 mm butirrato. I surnatanti sono stati raccolti 3 giorni dopo induzione, filtrati (0,8 pM), e congelati a -80 ° C fino al momento dell'uso. cellule AGS puromicina-resistenti sono stati placcati al 50% del fondo densità da 60 mm piatti della cultura dei tessuti e co-incubate con 1 ml di virioni. Quattro giorni dopo, le cellule AGS EBV-infettate (ora chiamate AGS-B95-HygB) sono stati selezionati positivamente con 100 mg /ml igromicina B (Roche).
DNA fingerprinting ha confermato che le cellule AGS utilizzati in questo studio abbinati il ​​genotipo di cellule AGS della American Type Culture Collection. Le impronte digitali è stato fatto utilizzando il PowerPlex 1.2 STR kit (Promega) seguita da elettroforesi su un 310 capillare strumento di elettroforesi su gel ABI (Applied Biosystems).
Gene Expression da istochimici Stains
blocchi di paraffina sono stati preparati da AGS e AGS-B95- linee cellulari HygB, e blocchi di paraffina di adenocarcinoma gastrico primaria sono stati recuperati dagli archivi clinici. I campioni clinici residui rappresentano tutti i tumori EBV disponibili positivi gastrico (n = 9) e una selezione casuale di tumori gastrici EBV-negativi (n = 9). macchie istochimiche sono stati applicati alle sezioni di paraffina per confermare l'infezione e per valutare l'espressione genica. Per preparare i blocchi, le cellule in coltura sono stati risciacquati in fosfato di Dulbecco tamponata (Gibco, Invitrogen), raccolto con 0,25% tripsina (Gibco, Invitrogen), irretito in un coagulo con Dade Ci-Trol coagulazione Control (citrato) -Level 1 (Dade Behring, Marburg, Germania) e trombina 200 (Pacific emostasi, Middletown, VA), fissato in 10% formalina tamponata, inclusi in paraffina, e sezionato su vetrini rivestiti.
EBER
in situ
ibridazione è stata eseguita utilizzando EBER
sonda marcato con fluoresceina e sonda oligo (d) controllo T su un benchmark in situ
sistema di ibridazione (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ). macchie immunoistochimica per EBV LMP1 e LMP2 proteine ​​sono state eseguite come descritto in precedenza [52] usando il citrato recupero antigene e il cocktail CS1-4 di anticorpi monoclonali murini contro LMP1 (1: 100, Dako, Capinteria, CA) e l'anticorpo monoclonale contro il topo E411 LMP2 (1 mg /ml, Asencion, Monaco di Baviera, Germania). Sezioni in paraffina di EBV-correlate linfoma di Hodgkin e malattia linfoproliferativa post-trapianto serviti come controlli positivi
analisi immunoistochimica delle proteine ​​replicative EBV BMRF1 e BZLF1 è stata effettuata utilizzando anti-BMRF1 clone G3-E31 ​​(1:. 200 diluizione, Diagnostica di ricerca , Inc., Flanders, NJ) e anti-BZLF1 clone BZ.1 (01:25 diluizione, Dako, Carpinteria, CA), mentre PTGS2 umana (colloquialmente chiamato cicloossigenasi-2, COX2) è stato analizzato utilizzando anti-COX-2 anticorpo monoclonale ( diluizione 1: 200, Cayman Chemical). Le sezioni sono state incubate con l'anticorpo primario per 30 minuti a 37 ° C per gli obiettivi EBV oppure a 4 ° C durante la notte per COX2, utilizzando i protocolli di blocco e di rilevazione nel Super-Sensitive biotina HRP Detection Kit Non (Biogenex). anticorpo legato è stato rilevato usando cromogeno diaminobenzidina (Biogenex) e le cellule sono state di contrasto con ematossilina (Dako). Sezioni in paraffina di leucoplachia pelosa orale servito come controllo positivo per EBV litico, mentre tonsille reattivo e tessuti di carcinoma nasofaringeo serviti come controlli per le macchie della COX-2. I risultati sono stati interpretati da scoring microscopica delle cellule maligne in ≥10 campi a 400x ottenendo un punteggio medio percentuale (0 = nessuno, 1 = < 1%, 2 = 1-10%, 3 = 10-33%, 4 = 33 -66%, 5 = > 66% delle cellule) e il punteggio intensità (0 = nessuno, 1 = debole, 2 = intermedio, 3 = forte colorazione). punteggi totali sono stati confrontati in EBV positivo rispetto
tumori negativi utilizzando un test t spaiato Mann-Whitney.
rilevamento del genoma EBV
Una batteria di quantitative real-time PCR (Q-PCR) saggi di mira sei disparate regioni del genoma EBV è stato utilizzato per dimostrare che l'infezione virale delle cellule AGS ha avuto successo. prodotti amplificati sono stati rilevati utilizzando l'ABI Prism 7500 strumento di Real-Time PCR con il software Sequence Detection System (Applied Biosystems) come descritto in precedenza utilizzando primer rivolte al
BamH1W, EBNA1
, LMP1
, LMP2
, e BZLF1
regioni del genoma EBV [52] o EBER1
DNA [53]. Per verificare la presenza di contaminazione da ampliconi, ogni corsa conteneva almeno due controlli "Nessun modello", in cui H2O priva di nucleasi, sostituito da modello.
A bassa densità cDNA microarray analisi
RNA è stato isolato da AGS e AGS-B95- cellule HygB utilizzando il RNeasy RNA Mini Kit (Qiagen) dopo il primo utilizzando la colonna di spin QiaShredder ™ (Qiagen) per lisare le cellule. Dopo aver confermato l'integrità dell'RNA utilizzando un Agilent Bioanalyzer, analisi di espressione microarray è stata eseguita da SABiosciences Corporation (Frederick, MD) utilizzando il loro GEArray Q Series umana trasduzione del segnale in Cancer Gene Array. Questo microarray a bassa densità è costituito da 96 sonde che test di attivazione di vie di trasduzione del segnale 15 coinvolti nella oncogenesi. (trascrizioni di destinazione sono elencati in Risultati.) cDNA biotina marcata con preparati da 10 mg di ogni campione di RNA con il metodo AmpoLabeling-LPR (SABiosciences) è stato ibridato alla matrice, e la rilevazione chemiluminescente è stata eseguita utilizzando una telecamera CCD. valori di intensità prime integrati per ogni spot sono stati generati da un software GEArray Analysis Suite (SABiosciences), e ulteriori analisi e la normalizzazione è stata effettuata utilizzando Microsoft Excel. Il più basso valore di intensità posto su ogni array è stato considerato come sfondo ed è stato sottratto da ogni valore di intensità prima per ciascuna sonda, e poi intensità Spot stati normalizzati a quella del servizio di pulizia gene, deidrogenasi glyceraldehydephosphate (GAPDH
). Un confronto a coppie dei livelli di espressione genica è stato effettuato tra le cellule EBV-positivo (AGS-B95-HygB) e le cellule AGS parentali EBV-negativi. Se il rapporto fosse ≥2 o ≤0.5, il gene è stato considerato per essere upregulated o downregulated nelle cellule infette.
SYBR Green semiquantitativa rtPCR
Per confermare microarray selezionato risultati di espressione genica, rtPCR è stata effettuata utilizzando in tempo reale RT <sup>2 primer PCR gene-specifici (SABiosciences). Il kit ReactionReady ™ First Strand cDNA Synthesis (SABiosciences) è stato utilizzato per convertire 3 mg di RNA in cDNA, e il cDNA è stato diluito 1:10 prima dell'analisi PCR. I seguenti 38 cDNA stati presi di mira: GAPDH, A2M, ABCB1, BCL2L1, BIRC1, BIRC2, BIRC3, EN1, GADD45, HIF1A, ID2, IGFBP3, BRCA1, TMEPAI, IRF1, BCL2, BMP4, CDKN2A (p16), FN1, HK1, ICAM1, IL2, CCND1, MDM2, COX2 (PTGS2), TFRC, WISP1, TRAF1, CDK2, VCAM1, CDKN2C (p18), CDKN1A (p21), DUSP1, HSP70, NFKB1, TNFSF10, TRIM25
, e FOSL1
. Le reazioni sono state eseguite in un volume totale di 25 ml contenente 1X TaqMan ® universale Mix (ABI), RT 2 mix primer gene-specifica (10 micron ciascuna di primer, SABiosciences), 2,5 ml 5X SYBR soluzione verde ( sonde molecolari, Eugene, OR), e 5 ml di cDNA. Condizioni termociclico erano: 50 ° C per 2 minuti, 95 ° C per 10 minuti, e 40 cicli di 95 ° C per 15 secondi e 60 ° C per 1 minuto su uno strumento ABI 7500 con software Sequence Detection System (Applied Biosystems). La stessa soglia è stata utilizzata per ogni gene e la piastra valutate dal protocollo "quantificazione relativa Plate". Ogni reazione di PCR è stato eseguito in triplicato per ogni campione su due distinte piastre a 96 pozzetti, ed i risultati sono stati in media per determinare le differenze relative a livello di espressione di ciascun gene in EBV-positivo contro
linea cellulare EBV-negativi.
Minore Groove Binding sonda semiquantitativa rtPCR
Per valutare l'espressione di cinque geni selezionati che non erano sul microarray descritto in precedenza, le analisi semi-quantitative rtPCR sono stati eseguiti (Assays-on Demand, Applied Biosystems) utilizzando solco minore sonde vincolanti di targeting trascrizione elicasi simile factor (HLTF
), trilobata fattore-1 (TFF1
), cerniera fattore di trascrizione ATF-come base-leucina (BATF
), inibitore della DNA binding protein-4 (ID4
), e nucleostemin (NU
). Questi cinque sono stati selezionati perché sono riferito deregolazione in una parte sostanziale degli adenocarcinomi gastrici o tumori EBV-correlata [32, 54-59]. GAPDH
servito come controllo endogeno per scopi di quantificazione relativi. RNA è stato convertito in cDNA utilizzando l'alta capacità Kit cDNA Archive (Applied Biosystems), e il cDNA è stato diluito 1:10 con acqua priva di nucleasi. Ogni reazione 50 microlitri PCR conteneva: 1X TaqMan ® universale Master Mix, saggio Espressione 1X target del gene GAPDH
mix endogeno di controllo e 10 microlitri cDNA. Per verificare la presenza di contaminazione da amplicon, ogni saggio di espressione su ogni piatto conteneva almeno due controlli "Nessun modello", in cui l'acqua priva di nucleasi, sostituito da modello. Termocicli condizioni e analisi dei dati erano come descritto sopra per la
. Trattamento e sequenziamento del DNA bisolfito modificato
Per studiare l'effetto di demetilazione SYBR Green rtPCR Demetilazione, le AGS e le linee di cellule di cancro gastrico AGS-B95-HygB erano cresciuto al 75% di confluenza e poi per tre giorni consecutivi 1 pM di 5-aza-2'-deossicitidina fresco (5aza; Sigma) è stato aggiunto al giorno. Il quarto giorno, RNA e DNA sono state raccolte da colture trattate e non trattate. RNA è stato valutato per livelli di espressione genica, e il DNA è stato esaminato per la metilazione dopo il sodio bisolfito trattamento (EZ metilazione del DNA Kit, Zymo Ricerca, Orange, CA) per convertire cytosines non metilato di uracile, pur mantenendo invariate cytosines denaturato [60]. Il controllo positivo era CpGenome universale metilato del DNA (Chemicon) sottoposto alla stessa conversione bisolfito e primer di controllo rivolte al C8orf4
promotore del gene cellulare confermato la conversione bisolfito di successo di ogni campione di DNA [61]. isole CpG sono stati identificati usando CpG Parcella in ciascuno dei cinque umana genes-- ICAM1
(RefSeq # NM_00201), CDKN2A (p16)
(RefSeq # NM_000077.3), ID4
(RefSeq # NM_001546), COX2
(RefSeq # NM_000963), e TFF1
(RefSeq.225,2) - per cui le sequenze promotore (3000 paia di basi a monte del sito di inizio della trascrizione attraverso esone 1) sono stati scaricati da GenBank. I seguenti parametri per CpG identificazione isola sono stati usati: lunghezza minima di 200 bp, percentuale media minima di C + G del 50%, e il rapporto medio minimo di osservato previsto C + G di 0,6 [62]. Per identificare CpG regioni dense di COX2
e TFF1
, il parametro di lunghezza minima è stata ridotta a 50 punti base [61]. sequenze primer sono mostrati nella Tabella 1. Ciascuno 50 microlitri reazione PCR conteneva: 1X PCR Buffer, 2 mM MgCl <sub>2, 1 unità Platinum Taq DNA Polymerase (Invitrogen, Carlsbad CA), 0,2 mM dNTP (ABI), e 30 pmol di ciascun primer. Condizioni termociclico erano: 94 ° C per 2 minuti, 40 cicli di 94 ° C per 30 secondi, 55 ° C per 30 secondi, e 72 ° C per 1 minuto, 72 ° C per 10 minuti. Per monitorare la contaminazione da amplicon, ogni corsa conteneva un controllo "non modello" in cui l'acqua priva di nucleasi, sostituito da templateTable 1 bisolfito fabbricato di Gene-Specific PCR Primer Sequenze
ICAM1

Inoltra
5'-TGG GGG TTG TGG TTT TAG TT-3 '

Reverse
5'-CTC CCT CCA CTA AAA AC-3'
dimensioni Amplicon
412 bp
CDKN2A (p16)
Forward
5'-AGA TGT TTT GTG GTT GTT GTG A-3 '
Reverse
5'-CAA AAA TCT TCC ATT CTT CAA AC -3 '
Amplicon dimensioni
418 bp
ID4
Forward
5'-TTT TTT GGG TAT ATA TTA GTT TGG-3'
Reverse
5'-TAT CCT AAT CAC TCC CTT C-3 '
dimensioni Amplicon
477 bp
COX2
Forward
5'-TAT GTG TTG TAT ATA GAG TAG A-3'
Reverse
5'-AAA AAA TAA TCC CCA CTC TC -3 '
dimensioni Amplicon
399 bp
TFF1
Forward
5'-TTA GGT TGG AGT GTA GTA GG-3'
Reverse
5'-CCT ACT CAT ATC TAA AAA ACC C-3 '
Amplicon dimensioni
489 bp
controllo C8orf4
Forward
5'-GAA TTA AAA TAT AAG GAG AGT TTT-3 '
Reverse
5'-AAC ATT ACC CAA ACA TAA AAC AA-3'
dimensioni Amplicon
328 bp
il sequenziamento è stato effettuato su ampliconi di modelli bisolfito trattati per identificare le CPGs metilato e non metilato con o senza 5aza trattamento. In primo luogo, ogni prodotto di PCR è stato clonato in pGEM-T vettore utilizzando il pGEM-T Facile Vector System II (Promega) e trasformata in alta efficienza cellule competenti JM109. colonie bianche contenenti inserti sono stati selezionati e colto durante la notte, e plasmide DNA è stato estratto utilizzando il kit Miniprep QiaPrep Spin (Qiagen). Il sequenziamento è stato fatto su un ABI 3100 Genetic Analyzer utilizzando il kit di reazione ABI PRISM ™ BigDye ™ Versione 1.1 Terminator Cycle Ready con AmpliTaq DNA polimerasi e un primer M13R3. I risultati sono stati scaricati in un software Sequencher (gene codifica, Ann Arbor, MI) per ottenere il complimento inverso di ogni sequenza, e entrambe le sequenze in avanti e all'indietro sono stati allineati e analizzati per distinguere cytosines non metilato da cytosines denaturato.
Western Blot sul AGS linea cellulare
a causa del potenziale per la terapia con inibitori della COX-2 per superare gli effetti COX2, i risultati di RNA-based per COX2 sono stati scelti per lo studio di follow-up a livello di proteine. cellule confluenti AGS con o senza EBV sono state raccolte con 0,25% tripsina, lavate due volte in PBS e pellettizzati per centrifugazione. Le cellule sono state risospese in 500 ul tampone di lisi NP-40 cellule (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1% NP-40, pH 8,0), incubato in ghiaccio per 30 minuti e centrifugata a 12.000 rpm per 15 minuti a 4 ° C. Aliquote di lisato (50, 100, 150 ug di proteine ​​per pozzetto) sono stati risolti tramite SDS-PAGE su un gel gradiente di tris-glicina 4-20% (Invitrogen) e trasferiti su una membrana di nitrocellulosa. COX2 è stata rilevata con una diluizione 1: 5.000 dell'anticorpo monoclonale seguita una diluizione 1: 10.000 di anticorpo secondario coniugato con fosfatasi alcalina (Amersham Biosciences), e la visualizzazione di un Typhoon PhosphorImager (Molecular Dynamics). densità di banda misurata semi-quantitativamente e normalizzati per il beta actina (ACTB) è stata confrontata tra le cellule AGS infetti e non infetti.
Risultati
EBV l'infezione delle cellule AGS cancro gastrico
infezione da EBV successo delle cellule del cancro gastrico AGS è stata confermata utilizzando sei saggi Q-PCR di targeting segmenti diversi del genoma EBV. EBER
in situ
ibridazione non ha mostrato alcuna EBER
espressione nelle cellule parentali AGS "EBV-negativi", mentre più del 90% delle cellule AGS-B95-HygB erano EBER
-positivo e aveva attivato morfologia nucleare -appearing (Figura 1). Il tasso di proliferazione è stata aumentata, come dimostrato dalla confluenza di coltura cellule AGS-B95-HygB tre giorni prima per le cellule AGS parentali. L'infezione persiste per almeno 4 mesi, come indicato dalla GFP e EBER
macchie istochimiche. EBV latente (LMP1 e LMP2A) e litici (BZLF1 e BMRF1) le proteine ​​non sono stati espressi nelle cellule AGS non infette, mentre circa il 10% delle cellule infette espresso LMP1, la metà delle cellule espresso LMP2A e ~ 35% espresso proteine ​​BMRF1 e BZLF1 che implicano attiva replicazione virale (Figura 1). La figura 1 le cellule AGS-B95-HygB esprimono geni virali latenti e litici. A) macchia immunoistochimica per GFP suggerisce cellule AGS Hygromycin B-trattati sono stati uniformemente infettati dal genoma B95.8 EBV ingegnerizzato. B) EBER in situ ibridazione
indica infezione latente in > il 90% delle cellule. Nucleare EBER
colorazione risparmia i nucleoli, e nucleoli allargate sono un marker di attivazione cellulare. Latente virale proteine ​​LMP1 (C) e LMP2 (D) sono state espresse focally. proteine ​​virali litiche, BMRF1 (E) e BZLF1 (F), sono stati espressi in una frazione significativa di cellule AGS-B95-HygB. (GFP e BMRF1 macchie, 800x, LMP1, LMP2, EBER
e BZLF1 macchie, 1200x)
cellulare Gene differenze di espressione in EBV-positivi rispetto AGS Celle EBV-negativi
livelli di espressione di 96 geni cellulari sono stati analizzati nelle cellule AGS e AGS-B95-HygB utilizzando l'analisi a bassa densità microarray con rivelazione chemiluminescente (Figura 2). Dopo la normalizzazione di GAPDH
, confronto a coppie dei livelli di espressione genica tra le cellule AGS EBV-positivi e EBV-negativi rivelato che dei 96 geni sul microarray, 43 sono stati disregolato almeno due volte dopo l'infezione da EBV. Sorprendentemente, con un incremento EBV-associato di espressione è stata osservata per soli 6 geni (IGFBP3
, GADD45, IRF1, GRP78 /HSPB1, GLUT1 /SLC2A1, TMEPAI
), mentre la diminuzione è stata osservata espressione per i restanti 37 geni sregolati (ABCB1, BCL2L1, BIRC2, BMP2, CDKN2A, DUSP1, HIF1A, ICAM1, ID2, NFKB1, COX2, TFRC, VCAM1, WISP1, TRIM25, IL2, BMP4, MDM2, CCND1, CDK2, Bax, p57, p19, CSN2, CXCL9 , IL4, jun, KLK3, LTA, MMP7, PPARG, TNFRSF10B, WIG1, WNT2, Ptch2
). Figura 2 modelli di espressione genica sono alterati da infezione da EBV di cellule AGS. sonde di cDNA biotina marcata con schierati in quadruplicato su una membrana di nylon ibridano a RNA isolato dalle cellule AGS e AGS-B95-HygB. segnali indicano chemiluminescente disregolazione dei geni selezionati tra i 96 sulla matrice rispetto ai geni di controllo negli ultimi due righe.
SYBR Green rtPCR è stato utilizzato per controllare i risultati di microarray per 26 dei geni sregolati e per 12 geni supplementari in cui nessuna variazione significativa è stata osservata sul microarray. Maggiore di alterazione doppio del livello di mRNA in infetto contro
cellule non infette è stato trovato per 16/26 geni (Tabella 2). I geni maggiormente colpite sono state IGFBP3
che è stato sovraregolati da 42 volte, e COX2, BMP4, e ICAM1
che sono stati downregulated da 35-, 32-, e 22 volte, rispettivamente. I restanti dieci alterazioni microarray-based non sono stati confermati da rtPCR, suggerendo che la disregolazione EBV-correlata di questi fattori è stato inferiore di due volte. In un caso, c'è stata una notevole discrepanza: livelli di espressione di BCL2L1
da analisi di microarray hanno evidenziato una duplice riduzione
nelle cellule infette, mentre rtPCR più volte ha mostrato un aumento di cinque volte
in BCL2L1
mRNA livelli nelle cellule infette. discrepanze meno drammatici sono stati trovati quando altri 12 geni sono stati analizzati mediante rtPCR, con un significativo (> 2 volte) i cambiamenti hanno trovato l'espressione di geni 5/12 per i quali è stata osservata alcuna alterazione sul microarray (Tabella 2) .table 2 I geni deregolazione in EBV-positivo cellule AGS
Nome Gene
Gene Symbol
fold change *
geni inibiti
base fattore di trascrizione leucina-cerniera, ATF-come
BATF
-38
morphogenic cicloossigenasi-2
COX2
-35
proteina ossea-4
BMP4
-32
molecola di adesione intercellulare-1
ICAM1
-22
trifoglio fattore-1
TFF1
-21
inibitore della DNA scossa-2 vincolante
ID2
-14
calore proteina-70
HSP70
-10
ciclina-dipendente chinasi-2
CDK2
-9
ciclina-D1
CCND1
-9
ipossia inducibile fattore-1A
HIF1A
-9
cancro al seno-1
BRCA1
-7
nucleostemin
NU
-7
ciclina-dipendente chinasi inibitore-2A
CDKN2A /P16
-6
inibitore di legame al DNA-4
ID4
-6
ENGRAILED-1
EN1
-5
ATP-binding cassette, sub-famiglia B, 1 membri
ABCB1
-3
MDM2 p53 legame con le proteine ​​
MDM2
-3
geni upregulated
vincolante insulino-simile del fattore di crescita della proteina-3
IGFBP3
+40
fattore di necrosi tumorale del recettore-associata factor-1
TRAF1
+20
transmembrana prostatico androgeno-indotta proteina
TMEPAI
+10
fattore di necrosi tumorale, superfamiglia membro-10
TNFSF10
+8
B cellule di linfoma-2-like -1
BCL2L1
+7
baculoviral IAP ripetere contenente 3-
BIRC3
+5
esochinasi-1
HK1</sub></sup>