Epstein-Barr vírus špecifické metylácie ľudských génov v karcinómu žalúdka cells

Epstein-Barr vírus špecifické metylácie ľudských génov v nádorových bunkách žalúdku
Abstract
pozadí
Epstein-Barrovej (EBV), sa nachádza v 10 % všetkých žalúdočných adenokarcinómov, ale jeho úlohu v rozvoji a udržiavaní nádoru zostáva nejasný. Cieľom tejto štúdie bolo zistiť, EBV sprostredkované dysregulácia bunkových faktorov, podieľajúcich sa žalúdočné rakoviny.
Metódy
Génová expresia vzory boli skúmané v EBV-negatívne a AGS epitelových buniek EBV pozitívne žalúdočnej použitím mikročipu s nízkou hustotou, reverznej transkripcii PCR, histochemické škvrny, a metylácie DNA špecifické pre sekvenovania. Vyjadrenie PTGS2 (COX2) bola meraná v AGS buniek a v primárnych adenokarcinóme žalúdka tkanivách.
Výsledky
V štúdiách poľa, takmer polovica z 96 testovaných ľudských génov, čo predstavuje 15 rôznych nádorových ochorení signálnych dráh, boli ich poškodeniu po EBV infekcii. Reverzný transkripciu PCR potvrdilo významný vplyv na faktoroch, ktoré majú rôzne funkcie, ako je napríklad regulácia bunkového cyklu (IGFBP3
CDKN2A, CCND1, HSP70, ID2, ID4)
, opravy DNA (BRCA1, TFF1
), bunkovej adhézie ( ICAM1
), zápal (COX2
) a angiogenézy (HIF1A
). Demetylácie za použitia 5-aza-2'-deoxycytidínu reverznej EBV sprostredkované dysregulácia pre všetkých 11 génov sú tu uvedené. U niektorých promotorových sekvencií, CPG ostrov metylácie a demetylácie nastala v vzore EBV-špecifické, ako je znázornené hydrogensiričitanovú sekvenovaním DNA. Imunohistochémia bola menej citlivé než bol western blot pre detekciu downregulaci COX2 po EBV infekcii. Vírus súvisiace s dysregulácia hladín COX2 in vitro
sa neopakuje in vivo
medzi prirodzene infikovaných rakovinou žalúdka tkanív.
Závery
EBV mení génovú expresiu ľudského spôsoby, ktoré by mohli prispieť k jedinečnému patobiologii vírusu rakovina -associated. Okrem toho, frekvencia a reversability metylácie súvisiace transkripčný zmeny naznačujú, že činidlá, demetyláciou majú terapeutický potenciál pre správu karcinóm EBV-súvisiace.
Pozadie
rakovina žalúdka je štvrtou najčastejšou typ rakoviny a druhou najčastejšou príčinou rakoviny úmrtí na celom svete [1]. Rôzne genetických zmien, ako aj infekčných chorôb a ďalších činidiel na životné prostredie Zdá sa, že faktory žalúdočnej karcinogenéze. Epstein-Barr vírus (EBV), DNA gammaherpesvirus dvojvláknová, sa nachádza vo vnútri nádorových buniek u 10% adenokarcinómov žalúdka, a infekcia sa zdá predchádzať malígny transformáciu [2]. Základné a klinické pozorovanie naznačujú, že žalúdočné rakoviny spojených s EBV majú odlišný patobiologie z karcinómov žalúdka EBV-negatívna [3-8]. Racionálne návrh terapia vírusovej riadené vyžaduje lepšie pochopenie patogénne úlohu EBV v žalúdočnej karcinogenéze.
Skoršie štúdie ukázali, stratu troch kritických nádorový supresor génových produktov, CDH1 (E-cadherin), P73, a CDKN2A (P16 ), v karcinómov žalúdku EBV-infikované [9-18]. Vírus-asociované metylácii týchto génov, spolu s dôkazmi o globálnom metylácie DNA v nádorových ochorení EBV pozitívne, naznačuje, že karcinómov žalúdka EBV-súvisiace sú podmnožinou (Cîmpu) rakoviny CPG ostrov methylator fenotyp [4, 11, 19-26]. Potenciálny Mediátor je DNA metyltransferáza 1 (DNMT1)
, ktorá je stimulovaná v prirodzene infikovaných karcinómov žalúdka a mohlo by pomôcť vytvoriť metylácie vzorov rozšírená do dcérskych buniek pri delení buniek [21, 27-29]. Prebiehajúce štúdie sú zamerané na pochopenie úlohy EBV a Helicobacter pylori infekcia spôsobujúca zápal a pridružené globálnej hypermetylace počas vývoja rakoviny žalúdka [22].
V bunkových línií modelov, DNMT1 nadmerná expresia je sprostredkovaná EBV LMP1 a LMP2 [21, 28 -31]. Zdá sa, že EBV použiť epigenetických mechanizmov na ovládanie hostiteľa transcriptome a tiež k riadeniu expresie vlastných vírusovo kódovaných génov [11, 12, 14, 15, 19, 21, 24, 29, 32, 33]. Pri prvom infekcii bunky je nemethylovaný vírusový genóm môže podliehať replikáciu vírusu s novou produkciu viriónov, pričom podmnožina infikovaných buniek získať vysoko methylata vírusový genóm, ktorý squelches expresiu cudzích proteínov a sprostredkuje dlhodobé vírusovej perzistencie prostredníctvom latentnej infekcie [23, 34]. Infikované nádory majú tendenciu mať veľmi denaturovaný EBV DNA a metylácie súvisiace umlčanie vírusových génov pomáha vysvetliť, ako nakaziť nádory unikať imunitný deštrukcii.
Kým metylácie promotorov génov je obvykle spojená s transkripčný zníženie expresie
cez selektívnu väzbu represor proteínov prvý proteín kedy sa viažu a aktivujú
methylata promótor bol EBV BZLF1, kľúčovým faktorom ovládanie spínača z latentnej do replikačných formy vírusovej infekcie [35]. Zdá sa, že vírus je dômyselne vyvinul prostriedok na odstránenie promótorom metylácie na svoj prospech [34, 35]. Antivírusové stratégie sú skúmané pre ich protinádorovej potenciál. Je zaujímavé, že väčšina bežne používaných antivírusová činidlá, acyklovir a ganciklovir, sú účinné pri vypnutí replikáciu vírusu, ale neodstraňujú expresiu latentné a čoskoro lytických vírusových génov, ako je LMP1, LMP2 a BZLF1.
Klinické dôsledky EBV spojené metylácie žalúdočné rakoviny genómu sú obrovské. Po prvé, vznikajúce dôkaz ukazuje potenciál pre lepšiu diagnostiku rakoviny žalúdka testovacími žalúdočné umýva na rakovinové špecifické metylácie vzorov, možno v zhode s testami na EBV identifikovať s vírusom alebo podmnožinu rakoviny [36-40]. Rôznymi vzorci metylácie promótorom vírusu v pozitívnych v porovnaní s vírusom-negatívne bunky [11, 21, 24] zdôrazňujú, že je potrebné charakterizovať metylačnej vzorov tak, aby, ktorý maximalizuje citlivosť testu pre detekciu rakoviny. Ako infekcie a zmenenou DNA metylácie sa zdajú byť skoré udalosti v karcinogenéze [2, 41], prípadne uľahčenie detekcie prekanceróznych lézií v žalúdku šťavy.
Druhý klinický význam je potenciál pre zlepšenú liečbu liekmi na rakovinu žalúdka za použitia že zvrátiť účinok promótorom hypermetylace [42, 43]. Najmä, demetyláciou látky, ktoré inhibujú DNA metyltransferázy a reverznej nádorový supresorový gén tlmenia hluku alebo aktivácia onkogénu sú potenciálnymi antineoplastické stratégie [43]. Do úvahy treba venovať prípadné rozdiely v účinku demetylovaného látok v vírusom-pozitívnom proti
vírus-negatívne nádory [43-45]. My aj iní ukázali, že prirodzene infikované žalúdočné rakoviny majú nižšiu CDKN2A (p16) výraz [14, 15]. V klinickej štúdii fluorouracilu (5-FU) pre rakovinu žalúdka, CDKN2A
stav metylácie promótorom bol nezávislý prediktor prežitia [46]. Dôvodom pre použitie demetylovaného činidiel, ako je 5-aza-2'-deoxycytidínu v klinických štúdiách sa opiera o vedecké dôkazy, že demetyláciou liečbu modifikuje tumorigénny vlastnosti nádorových buniek.
Niektorí autori úspešne infikovaných epiteliálnych bunkových línií s EBV v
vitro
[47, 48]. V tejto štúdii, EBV-pozitívne a AGS buniek karcinómu žalúdka EBV-negatívne boli skúmané na rozdiely v génovej expresii vzorov pomocou microarray analýzy s nízkou hustotou a reverznej transkripčnej polymerázovú reťazovú reakciu (RT-PCR). AGS je bunková línia, ktorá bola pôvodne pestovaná z adenokarcinómu žalúdka tkaniva a teraz je široko používaný ako model rakoviny žalúdka. Úloha metylácie DNA v sprostredkovaní vybraných účinkov bola skúmaná bisulfitová sekvencovania DNA a testovanie schopnosti demethylačním činidlom zvrátiť účinok na EBV umlčanie génu. Výsledky ukázali, rozsiahle génu dysregulácia upon EBV infekcie v AGS buniek dôkaz, že metylácie promótorom je zodpovedný, aspoň čiastočne. Zvrat vírusu spojený transkripčných účinkov naznačuje, že demetyláciou látky by mali byť preskúmané za ich potenciálu ku kontrole rastu nádorových ochorení EBV-súvisiace.
Metódy
Žalúdočné nádorových bunkových línií
AGS žalúdočné rakovina bunkové línie (ATCC CRL 1739) bola kultivovaná v Dulbeccova modifikovanom Eaglovho médiu obsahujúcom 10% fetálne bovinné sérum (tepelne inaktivovaného počas 20 minút pri 65 ° C) a 1% penicilín-streptomycín (10.000 jednotiek penicilínu, 10000 ug /ml streptomycínu, Gibco, Carlsbad, CA) , Bunky boli infikované rekombinantným kmeňom EBV (dar od Dr. J. Henri Delecluse) [33, 49, 50], ktorý bol navrhnutý tak, aby expresiu zelený fluorescenčný proteín (GFP) a rezistenciu k hygromycinu B klonovaním týchto génov do prototypom B95 0,8 kmeňa EBV, kde je druhá kópia oriLyt obvykle zdržiava. Pred infekciou, AGS bunky boli transfekovány s 1 ug expresného vektora kódujúceho CD21 (EBV receptor) a gén rezistencie na puromycin pomocou Fügen 6 (Roche, Indianapolis, IN), ako bolo opísané skôr [51]. 48 hodín po transfekciu sa bunky, ktoré obsahujú CD21 boli pozitívne vybrané pre použitie 0,5 ug /ml puromycinu-HCl (Roche). Vírusové zásoby rekombinantný EBV boli vytvorené v obličkách buniek 293, ľudské embryonálne epiteliálne bunkové línie, indukciou lytické replikácie za použitia 20 ng /ml forbol-12-tetradecanoate 13-acetát a 3 mM butyrát. Supernatanty boli odobraté 3 dni po indukcii, filtruje (0,8 uM), a v zmrazenom stave pri -80 ° C až do použitia. Puromycin-rezistentné AGS bunky boli nanesené na 50% plnej hustoty v 60-mm misky pre tkanivové kultúry a spoločne inkubované s 1 ml zásobného viriónov. O štyri dni neskôr, EBV-infikované bunky (AGS teraz nazvaný AGS-B95-HygB) boli pozitívne vybrané 100 ug /ml hygromycinu B (Roche).
DNA fingerprinting bolo potvrdené, že AGS bunky použité v tejto štúdii uzavreté genotyp AGS bunky v American Type Culture Collection. Snímanie odtlačkov prstov sa vykonáva pomocou PowerPlex 1,2 STR kit (Promega), nasledované elektroforézou na ABI 310 kapilárnej gélovej elektroforézy s nástrojom (Applied Biosystems).
Expresiu génov histochemické škvrny
parafínové bloky boli pripravené z AGS a AGS-B95- HygB bunkové línie a parafínové bloky primárneho adenokarcinóme žalúdka boli získané z klinických archívov. Zvyškové klinických vzoriek predstavujú všetky dostupné EBV pozitívne karcinómov žalúdka (n = 9) a náhodný výber karcinómov žalúdka EBV-negatívne (n = 9). Histochemické škvrny boli aplikované na parafínových rezoch pre potvrdenie infekcie a na vyhodnotenie expresie génu. Na prípravu blokov, kultivované bunky boli najprv opláchne Dulbeccova fosfátom pufrovanom soľnom roztoku (Gibco, Invitrogen), zozbierané s 0,25% trypsínom (Gibco, Invitrogen), zamotali do zrazeniny pomocou Dade Ci-trol koagulačný Control (citrátovej) -úroveň 1 (Dade Behring, Marburg, Nemecko) a trombín 200 (Pacific hemostáza, Middletown, VA), fixované v 10% pufrovanom formalínu, vložené do parafínu a narezané na potiahnutých sklíčka.
Eber
in situ hybridizácia bola vykonaná
použitím fluoresceínom značené Eber
sondu a oligo (d) regulačné T sondu na Benchmark in situ hybridizácia
systému (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ). Imunohistochemické farbenie na EBV LMP1 a LMP2 proteíny boli vykonané ako bolo opísané skôr [52] za použitia citrátu sprístupnenie antigénu a CS1-4 koktail myšiach monoklonálnych protilátok proti LMP1 (1: 100, Dako, Capinteria, CA) a E411 potkania monoklonálne protilátky proti LMP2 (1 mg /ml, Asencion, Mníchov, Nemecko). Parafínové rezy EBV-súvisiace Hodgkinovho lymfómu a post-transplantačnej lymfoproliferatívne poruchu slúžila ako pozitívne kontroly
imunohistochemické analýzu replikačných proteínov EBV BMRF1 a BZLF1 bola vykonaná s použitím anti-BMRF1 klon G3-E31 ​​(1 :. 200 riedenie, výskum Diagnostics , Inc., Flanders, NJ) a anti-BZLF1 klon BZ.1 (1:25 riedenie, Dako, Carpinteria, CA), zatiaľ čo ľudské PTGS2 (hovorovo s názvom cyklooxygenázy-2, COX2) bola testovaná za použitia anti-COX2 monoklonálne protilátky ( riedenie 1: 200, Cayman Chemical). Rezy boli inkubované s primárnou protilátkou počas 30 minút pri teplote 37 ° C počas cieľov EBV, alebo pri teplote 4 ° C cez noc pre COX2, pomocou blokovanie a detekcie protokoly v Super-Sensitive Non Biotín HRP Detection Kit (BIOGENEX). Naviazaná protilátka bola detekovaná s použitím Diaminobenzidine chromogén (BIOGENEX) a bunky boli kontrastne hematoxylínom (DAKO). Parafínové rezy orálny vlasatej leukoplakia slúžila ako pozitívna kontrola pre rozkladového EBV, zatiaľ čo reaktívne mandlí a nosohltanu karcinómu tkanivá slúžili ako kontroly pre COX2 škvŕn. Výsledky boli interpretované mikroskopickú bodovania malígnych buniek v ≥ 10 poliach pri 400x zväčšení poddajný má priemerný podiel skóre (0 = žiadna, 1 = menej ako 1%, 2 = 1-10%, 3 = 10 až 33%, 4 = 33 -66%, 5 = > 66% buniek) a intenzita skóre (0 = žiadna, 1 = slabá, 2 = stredný, 3 = silné farbenie). Celkové skóre boli porovnané v EBV pozitívne proti
negatívnymi nádormi s použitím nepárového t Mann-Whitneyho testu.
Detekcia EBV genómu
batérie kvantitatívnej real-time PCR (Q-PCR) testoch cielenie šesť nesúrodé regióny EBV genómu bola použitá na preukázanie, že vírusová infekcia AGS buniek bola úspešná. Amplifikované produkty boli detekované pomocou ABI Prism 7500 real-time PCR prístroj so softvérom Sequence Detection System (Applied Biosystems), ako je popísané vyššie za použitia primérov, ktoré cielia na BamH1W
EBNA1
LMP1, LMP2
a BZLF1
regióny EBV genómu [52] alebo EBER1
DNA [53]. Pre kontrolu kontaminácie amplikónu, každý beh obsahoval aspoň dva ovládacie prvky "žiadna šablóna", v ktorých sa nukleázy prosté H2O substituované na šablónu.
Nízku hustotou cDNA microarray Analysis
RNA bola izolovaná z AGS a AGS-B95- bunky HygB pomocou RNeasy Mini Kit RNA (Qiagen) po prvom použití spin kolóny QiaShredder ™ (Qiagen) pre lyžu buniek. Po potvrdení integrity RNA s použitím Agilent Bioanalyzer, analýza expresie microarray bolo vykonané SABiosciences Corporation (Frederick, MD) pomocou ich GEArray rady Q Ľudská signálne transdukcia v Cancer Gene Array. Tento low-density microarray sa skladá z 96 sond, ktoré testujú aktiváciu 15 signálnych transdukčných dráh zapojených do onkogenézy. (Cieľové transkripty sú uvedené vo výsledkoch.) Biotínom značené cDNA pripravenej z 10 ug každej vzorky RNA metódou AmpoLabeling-LPR (SABiosciences) bola hybridizována na pole, a chemiluminiscenčná detekcia bola vykonaná za použitia CCD kamery. Integrovanej hodnoty surovej intenzity pre každú škvrnu boli vytvorené softvérom GEArray Analysis Suite (SABiosciences), a ďalej analýza a normalizácia bola vykonaná pomocou Microsoft Excel. Najnižšia hodnota intenzity miesto na každé pole bolo považované za pozadie a bola odpočítaná od každej hodnoty surového intenzity pre každú sondu, a potom na mieste intenzity boli normalizované ako u housekeeping génu, glyceraldehydephosphate dehydrogenázy (GAPDH
). Pairwise porovnaní hladín génovej expresie bola uzavretá medzi EBV-pozitívnych buniek (AGS-B95-HygB) a rodičovských EBV negatívnu AGS buniek. V prípade, že pomer bol ≥2 alebo ≤0.5, gén bol považovaný za up-regulované alebo downregulated v infikovaných bunkách.
SYBR Green semikvantitatívny RT-PCR
K potvrdeniu vybraný microarray výsledky génovej expresie, RT-PCR bola vykonaná pomocou Real-time RT 2 génovo špecifické primery PCR (SABiosciences). ReactionReady ™ First Strand cDNA Synthesis Kit (SABiosciences) bol použitý pre konverziu 3 ug RNA do cDNA a cDNA bola nariedená 1:10 pred PCR analýzou. Nasledujúce 38 cDNA boli zamerané: GAPDH, A2M, ABCB1, BCL2L1, BIRC1, BIRC2, BIRC3, CZ1, GADD45, HIF1A, ID2, IGFBP3, BRCA1, TMEPAI, IRF1, BCL2, BMP4, CDKN2A (p16), FN1, HK1, ICAM1, IL2, CCND1, MDM2, COX2 (PTGS2), TFRC, WISP1, TRAF1, CDK2, VCAM1, CDKN2C (P18), CDKN1A (p21), DUSP1, HSP70, NFKB1, TNFSF10, TRIM25 stroje a FOSL1
. Reakcie boli vykonávané v celkovom objeme 25 ul obsahujúcich 1X TaqMan ® Universal Mix (ABI), RT 2 gén špecifický primer set mix (10 uM každého primeru, SABiosciences), 2,5 ul 5X SYBR zelený roztok ( molecular Probes, Eugene, OR) a 5 ul templátu cDNA. Termocyklingu podmienky boli nasledovné: 50 ° C po dobu 2 minút, 95 ° C počas 10 minút a 40 cyklov 95 ° C počas 15 sekúnd a 60 ° C po dobu 1 minúty na ABI 7500 prístroj so softvérom Detection System Sequence (Applied Biosystems). Rovnaký prah bol použitý pre každý gén a tanier hodnotila pomocou protokolu "Relatívna kvantifikácia Plate". Každá reakcia PCR bola vykonaná trikrát pri každej vzorke na dvoch oddelených doskách s 96 jamkami, a výsledky boli spriemerované pre stanovenie relatívnych rozdielov v úrovni expresie každého génu v EBV-pozitívne proti
EBV-negatívne bunkovej línii.
Minor groove Väzba Probe semikvantitatívny RT-PCR
na vyhodnotenie expresie piatich vybraných génov, ktoré neboli uvedené na mikročipe je popísaný vyššie, semi-kvantitatívnej RT-PCR testy boli vykonané (testy-on-demand, Applied Biosystems) s použitím malom záreze záväzné sondy zamerané helikáza-like transkripciu faktor (HLTF
), trojlístok faktor-1 (TFF1
), základné leucín zips ATF-like transkripčný faktor (BATF
), inhibítor DNA viažuci proteín-4 (ID4
), a nucleostemin (NU
). Týchto päť boli vybrané preto, že sú údajne ich poškodeniu v podstatnej časti žalúdočného adenokarcinómu alebo rakoviny s EBV-súvisiace [32, 54-59]. GAPDH
slúžila ako vnútorná kontrola na účely relatívnej kvantifikácie. RNA bola prevedená na cDNA pomocou veľkokapacitné cDNA Archive Kit (Applied Biosystems) a cDNA sa zriedi v pomere 1:10 s vodou bez nukleázy. Každá reakcia obsahovala 50 ul PCR: 1x TaqMan ® Universal Master Mix, 1x expresia cieľového génu testom alebo GAPDH
endogénne kontrolné zmesi a 10 ul cDNA. Pre kontrolu kontaminácie amplikónu, každý výraz test na každej doske obsahovala aspoň dva ovládacie prvky "žiadna šablóna", v ktorom bol nukleázy prosté vody nahrádzajúci šablóny. Termocyklingu podmienok a analýza dát boli, ako je popísané vyššie pre liečbu demetyláciu SYBR Green RT-PCR.
A sekvenovania bisulfitového modifikovanej DNA
Pre štúdium účinku demethyláciou, AGS a AGS-B95-HygB bunkové línie karcinómu žalúdka boli pestované do 75% zhlukovania a potom počas troch po sebe nasledujúcich dňoch 1 uM čerstvého 5-aza-2'-deoxycytidínu (5aza, Sigma) bol pridaný každý deň. Štvrtý deň, RNA a DNA boli zozbierané z ošetrených a neošetrených kultúr. RNA bola hodnotená na úrovni génovej expresie a DNA bola vyšetrená na metylácie po sodný bisulfitového (EZ metylácie DNA Kit, Zymo Research, Orange, CA) previesť nemethylované cytozín na uracil, pri zachovaní denaturovaný cytozín bezo zmeny [60]. Pozitívna kontrola bola CpGenome Universal methylata DNA (Chemicon) podrobia rovnakému bisulfitová konverzie, a kontrolné primery zamerané na C8orf4
bunkový promótor génu potvrdené úspešnú konverziu bisulfitového každej vzorky DNA [61]. CPG ostrovy boli identifikované pomocou CPG Plot pre každý z piatich ľudských genes-- ICAM1
(RefSeq # NM_00201), CDKN2A (P16)
(RefSeq # NM_000077.3), ID4
(RefSeq # NM_001546), COX2
(RefSeq # NM_000963), a TFF1
(RefSeq225,2) -, pre ktoré promotorové sekvencie (3000 párov báz proti smeru od miesta počiatku transkripcie cez exóne 1), boli stiahnuté z GenBank. Boli použité nasledovné parametre pre identifikáciu CPG ostrov: minimálnu dĺžku 200 bp, minimálne priemerné percento C + G o 50%, a minimálny priemerný pomer medzi pozorovanými a očakávanými c + g 0,6 [62]. Pre identifikáciu CPG husté oblasti pre COX2 stroje a TFF1
, parameter minimálna dĺžka bola znížená na 50 bp, [61]. Sekvencie primérov sú uvedené v tabuľke 1. Každý 50 ul PCR reakcie obsahovala: 1x PCR pufor, 2 mM MgCl 2, 1 jednotka Platinum Taq DNA Polymerase (Invitrogen, Carlsbad CA), 0,2 mM dNTP (ABI) a 30 pmol každého primeru. Termocyklingu podmienky boli nasledovné: 94 ° C po dobu 2 minút, 40 cyklov pri teplote 94 ° C počas 30 sekúnd, 55 ° C počas 30 sekúnd, a 72 ° C po dobu 1 minúty, 72 ° C počas 10 minút. Na sledovanie kontaminácie amplikónu, každý beh obsahoval ovládanie "žiadna šablóna", v ktorom bolo prosté nukleázy voda nahrádzajúci templateTable 1 hydrogensiričitanovú konvertovaných gén špecifický primer Sekvencia
ICAM1

Forward
5'-TGG GGG TGG TTG TTT TAG TT-3 '
Reverse
5'-CTC CCT CCA CTA AAA AC-3'
veľkosť amplikónu
412 bp
CDKN2A (p16)
Forward
5'-AGA TGT TTT GTG GTT GTT GTG A-3 '
Reverzný
5'-CAA AAA TCT TCC ATT CTT CAA AC -3 '
Amplicon veľkosť
418 bp
ID4
Forward
5'-TTT TTT GGG TAT ATA TTA GTT TGG-3'
Reverzný
5'-TAT SCS AAT CAC TCC CTT C-3 '
veľkosť amplikónu
477 bp
COX2
Forward
5'-TAT GTG TTG TAT ATA GAG TAG A-3'
Reverse
5'-AAA AAA TAA TCC CCA CTC TC -3 '
veľkosť amplikónu
399 bp
TFF1
Forward
5'-TTA GGT TGG AGT GTA GTA GG-3'
reverznej
5'-CCT ACT CAT ATC TAA AAA ACC C-3 '
Amplicon veľkosť
489 bp
kontrolu C8orf4
Forward
5'-GAA TTA AAA TAT AAG GAG AGT TTT-3 '
Reverse
5'-AAC ATT ACC CAA ACA TAA AAC AA-3'
veľkosť amplikónu
328 bp
sekvenovanie bolo vykonané na amplikónov hydrogensiričitanom ošetreného šablón na stanovenie methylata a nemethylované CPG s alebo bez 5aza liečby. Po prvé, každý PCR produkt bol klonovaný do pGEM-T vektora za použitia pGEM-T Easy Vector System II (Promega) a transformuje vo vysoko účinných kompetentných buniek JM109. Biele kolónie, ktoré obsahujú inzerty boli vybrané a kultivované cez noc a plazmidovej DNA bola extrahovaná za použitia QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen). Sekvenovanie bolo vykonané na ABI 3100 Genetic Analyzer pomocou ABI PRISM ™ BigDye ™ Version 1.1 Terminátor Cycle Ready Reaction Kit s AmpliTaq DNA polymerázy a základovým M13R3. Výsledky boli stiahnuté do Sequencher softvér (Gene Codes, Ann Arbor, MI) k získaniu opačného kompliment každej sekvencii, a dopredu i dozadu sekvencie boli vyrovnané a boli analyzované odlíšiť nemethylované cytozín z metylovaných cytozinov.
Western Blot na AGS bunkové línie
Vzhľadom k možnosti liečby inhibítory COX2 na prekonanie COX2 účinky, ktoré boli vybrané výsledky RNA-based pre COX2 pre štúdium nadväzujúce na proteínové úrovni. Splývajúci AGS bunky s alebo bez EBV zozbieraného s 0,25% trypsínom, premyté dvakrát vo fosfátom pufrovanom fyziologickom roztoku, a odstreďovaním. Bunky boli resuspendované v 500 ul NP-40 buniek lyzačného pufra (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1% NP-40, pH 8,0), inkubovaná na ľade počas 30 minút, a odstreďovanie pri 12000 otáčkach za minútu počas 15 minút pri 4 ° C ° C. Alikvótne lysátu (50, 100, 150 ug proteínu na jamku) boli rozdelené pomocou SDS-PAGE na 4-20% gradientu gélu Tris-glycín (Invitrogen) a prenesené na nitrocelulózové membránu. COX2 bol detekovaný s 1: 5000 riedenie monoklonálne protilátky a následne 1: 10,000 riedenie sekundárnej protilátky konjugovanej s alkalickou fosfatázou (Amersham Biosciences) a vizualizácia s Typhoon Phosphorimager (Molecular Dynamics). Hustota pásmo merať semikvantitatívne a normalizované na beta-aktínu (ACTB) bola porovnávaná medzi nakazenými a nenakazenými AGS buniek.
Výsledky
EBV infekcie AGS Žalúdočné nádorových buniek
úspešné EBV infekcie AGS rakoviny žalúdka buniek bola potvrdená pomocou šiestich Q-PCR testy zamerané na rozdielne segmenty EBV genómu. Eber
in situ hybridizácia
nevykazoval Eber
výraz v rodičovského AGS "EBV-negatívny" bunky, zatiaľ čo viac ako 90% AGS-B95-HygB bunky boli Eber
-pozitívne a bol aktivovaný -appearing jadrovej morfológia (obrázok 1). Rýchlosť proliferácie bola zvýšená, ako je znázornené sútokom kultivovaných buniek AGS-B95-HygB tri dni pred rodičovských AGS bunky. Infekcia pretrváva po dobu aspoň 4 mesiacov, ako je znázornené na GFP a Eber
histochemické škvŕn. EBV latentný (LMP1 a LMP2) a lytické (BZLF1 a BMRF1) proteíny neboli vyjadrené v neinfikovaných AGS bunkách, vzhľadom k tomu, ~ 10% infikovaných buniek vyjadrené LMP1, polovica bunky exprimovali LMP2, a ~ 35%, vyjadrené BMRF1 a BZLF1 proteíny vyznačujúca aktívny replikácie vírusu (pozri obrázok 1). Obrázok 1 AGS-B95-HygB bunky exprimujú latentné a lytické vírusové gény. A) Imunohistochemické farbenie pre GFP vyplýva, hygromycin B ošetrené AGS bunky boli rovnomerne nakazení inžinierstva B95.8 EBV genómu. B) Eber In situ hybridizácia indikuje
latentnú infekciu u viac ako 90% buniek. Jadrové Eber
farbenie šetrí jadierok a zväčšené jadierka sú markerom aktivácie buniek. Latentné vírusové proteíny LMP1 (C) a LMP2 (D) boli vyjadrené fokálne. Lytické vírusové proteíny, BMRF1 (E) a BZLF1 (F), boli vyjadrené v značnej časti AGS-B95-HygB buniek. (GFP a BMRF1 škvrny, 800x, LMP1, LMP2, Eber stroje a BZLF1 škvrny, hodnoty 1200x)
celulárnej génovej expresie Rozdiely v EBV-pozitívne proti EBV negatívnu AGS buniek
úrovne expresie 96 bunkových génov boli analyzované v bunkách AGS a AGS-B95-HygB s využitím nízkej hustote analýzu microarray s chemiluminiscenčná detekciou (obrázok 2). Po normalizácii na GAPDH
párového porovnania úrovne génovej expresie medzi EBV pozitívnych a EBV negatívnu AGS buniek odhalilo, že z 96 génov na mikročipe, 43 bolo ich poškodeniu pri najmenej dvojnásobnej po EBV infekcii. Prekvapivo, bolo pozorované zvýšenie EBV-súvisiace expresie iba 6 génov (IGFBP3
, GADD45, IRF1, Grp78 /HSPB1, GLUT1 /SLC2A1, TMEPAI
), zatiaľ čo znížená expresia bola pozorovaná u zvyšných 37 génov dysregulovaný (ABCB1, BCL2L1, BIRC2, BMP2, CDKN2A, DUSP1, HIF1A, ICAM1, ID2, NFKB1, COX2, TFRC, VCAM1, WISP1, TRIM25, IL2, BMP4, MDM2, CCND1, CDK2, BAX, p57, P19, CSN2, CXCL9 , IL4, jún, KLK3, LTA, MMP7, PPARG, TNFRSF10B, WIG1, WNT2, PTCH2
). Obrázok 2 génovej expresie vzory sú pozmenené EBV infekciu AGS buniek. Biotín-značené cDNA sondy oblečená štyroch na nylonovú membránu hybridizovat s RNA, izolované z AGS a AGS-B95-HygB buniek. Chemoluminiscenčný signály udávajú dysregulácia vybraných génov medzi 96 na pole v porovnaní s kontrolnými génmi v posledných dvoch radoch.
SYBR Green RT-PCR bola použitá pre kontrolu zistenie microarray pre 26 z ich poškodenia génov a 12 ďalších génov, v ktorých žiadne významné zmeny neboli pozorované na mikročipu. Väčší ako dvojnásobné zmene hladiny mRNA v infikovaných proti
neinfikovaných buniek bol zistený u 16/26 génov (tabuľka 2). Gény najsilnejšie zasiahnuté boli IGFBP3
, ktorá bola stimulovaná 42-krát, a COX2, BMP4 a ICAM1
, ktoré boli downregulated od 35-, 32- a 22-krát, resp. Zvyšných desať zmeny microarray báze neboli potvrdené RT-PCR, čo naznačuje, že EBV-súvisiace dysregulácia z týchto faktorov bola nižšia ako dvojnásobne. V jednom prípade došlo k výraznému rozpor: Hladiny expresie BCL2L1
podľa microarray analýzy ukázali dvojnásobný pokles
v infikovaných bunkách, zatiaľ čo RT-PCR opakovane ukázal päťnásobný nárast
BCL2L1
mRNA hladiny v infikovaných bunkách. Menej dramatické rozdiely bolo pozorované, keď bola ďalších 12 génov analyzované pomocou RT-PCR, s významný (viac ako 2-násobné), zmeny nájdené v expresiu génov, 5/12, pre ktoré bola pozorovaná žiadna zmena na mikročipe (tabuľka 2) 2 .Table gény ich poškodeniu v EBV-pozitívne AGS buniek
Gene Meno
Génové Symbol
násobnú zmenu *
Downregulated gény
základné leucín-zips transkripčný faktor ATF-like
BATF
-38
cyklooxygenázy-2
COX2
-35
kostnej morfogenetické proteín-4
BMP4
-32
intercelulárnej adhézny molekula-1
ICAM1
-22
trojlístok faktor-1
TFF1
-21
inhibítor DNA viazanie-2
ID2
-14
proteín tepelného šoku 70
HSP70
-10
cyklin-dependentný kinázu-2
CDK2
-9
cyklin D1
CCND1
-9
hypoxii vyvolávajúceho faktora-1A
HIF1A
-9
rakovinou prsníka 1
BRCA1
-7
nucleostemin
NU
-7
cyklin-dependentný kináza inhibítor-2A
CDKN2A /p16
-6
inhibítor DNA väzbové 4
ID4
-6
engrailed-1
EN1
-5
ATP-viažuci kazeta, sub-rodina B, člen 1
ABCB1
-3
MDM2 p53 proteín viažuci
MDM2
-3
up-regulovaná gény
viažuci inzulínu podobný rastový faktor proteín-3
IGFBP3
40
TNF receptor-spojený faktor-1
TRAF1
20
transmembránový prostaty androgén-indukovanej proteín
TMEPAI
10
faktor nádorovej nekrózy, člen nadčeľade-10
TNFSF10
8
B bunkového lymfómu-2-like

• Detekcia promótor hypermetylace z CPG ostrova e-cadherinu v žalúdku srdcovej adenokarcinóm
• Zmeny lipidov profilov po radikálnej gastrektómii u pacientov s karcinómom žalúdka