Epstein-Barr Virus-spezifesch methylation vum mënschleche Genen vun gastric Kriibs Zellen

Epstein-Barr Virus-spezifesch methylation vum mënschleche Genen vun gastric Kriibs Zellen VerfÜgung méiglech VerfÜgung Background VerfÜgung Epstein-Barr Virus (EBV) ass zu 10% vun all gastric adenocarcinomas mä seng Roll an entholl Entwécklung an Ënnerhalt Iwwerreschter fonnt kloer. D'Zil vun dëser Etude war EBV-mediated dysregulation vun bewosst Facteuren zu gastric carcinogenesis agebonne ënnersicht. VerfÜgung Method VerfÜgung Gene Ausdrock Musteren an EBV-negativ iwwerpréift goufen an EBV-positiv AGS gastric epithelial Zellen eng niddreg Dicht microarray benotzt, ëmgekéierte Transkriptiouns Hinnen alleguer, histochemical eweg, an methylation-spezifesch DNA sequencing. Ausdrock vun PTGS2 (COX2) war an AGS Zellen an am primäre gastric adenocarcinoma Stoffer gemooss. VerfÜgung Resultater VerfÜgung An Partie Studien, bal d'Halschent vun de 96 mënschleche Genen getest, vertrëtt 15 verschiddene Kriibs-Zesummenhang Signal transduction Weeër, goufen dysregulated der EBV Wonn. Ëmgekéierte Transkriptiouns Hinnen alleguer bestätegt oss op Facteuren mussen verschiddenste Funktiounen wéi Zell Zyklus Regulatioun (IGFBP3 VerfÜgung, CDKN2A, CCND1, HSP70, ID2, ID4) VerfÜgung, DNA Reparatur (BRCA1, TFF1 VerfÜgung), Zell Haftung ( ICAM1 VerfÜgung), inflammation (COX2 VerfÜgung), an angiogenesis (HIF1A VerfÜgung). Demethylation mat 5-AZA-2'-deoxycytidine réckgängeg der EBV-mediated dysregulation fir all hei opgelëscht 11 Genen. Fir e puer Promoteur e Message, CpG Insel methylation an demethylation opgetrueden an eng EBV-spezifesch Muster wéi déi bisulfite DNA sequencing gewisen. Immunohistochemistry war manner sensibel wéi downregulation vun COX2 westlech blot war Harnweeër op EBV fir z'entdecken. Virus-Zesummenhang dysregulation vun COX2 Niveauen kënschtlech VerfÜgung war net recapitulated zu VIVO VerfÜgung dorënner natierlech gastric Kriibs Stoffer infizéiert. VerfÜgung Konklusiounen VerfÜgung EBV Mäe Mënsch Gentherapie Ausdrock an Weeër déi zu der eenzegaarteg pathobiology vun Virus droen hätt -associated Kriibs. Ausserdeem, proposéiere d'Frequenz an reversability vun methylation-Zesummenhang transcriptional hire Restaurant datt demethylating Agenten fir Verwalte EBV-Zesummenhang carcinoma therapeutesch Potential hun. VerfÜgung Background VerfÜgung Gastric Kriibs d'véiert stäerkste gemeinsam Typ vu Kriibs ass an der zweeter Virwaat Ursaach vum Kriibs Doud weltwäit [1]. Eng ganz Rei vun genetesch hire Restaurant souwéi ustiechend an aner Ëmweltproblemer Agenten schéngen Facteuren zu gastric carcinogenesis gin. Epstein-Barr Virus (EBV), en double-gekëmmert DNA gammaherpesvirus, ass bannent der malignant Zellen zu 10% vun gastric adenocarcinomas fonnt, an Wonn schéngt malignant Transformatioun zu marschéiert [2]. Basis a Krankheete Observatioune hindeit datt EBV-verbonne gastric Cancers enger anerer pathobiology aus EBV-negativ gastric Cancers hunn [3-8]. Rationalen Design vun Virus-Direkter Therapie verlaangt e bessert Verständnis vun der pathogenic Roll vun EBV zu gastric carcinogenesis. VerfÜgung Virum Studie berichten iwwer propedeutësch Verloscht vun dräi kritesch entholl suppressor Gentherapie Produiten, CDH1 (E-cadherin), p73, an CDKN2A (p16 ), gastric Cancers am EBV-Krankheet [9-18]. Virus-verbonne methylation vun dësen Genen, zesumme mat Beweiser vun global DNA methylation am EBV-positiv Cancers hindeit, datt EBV-Zesummenhang gastric Cancers engem Ziel vun CpG Insel methylator phenotype (CIMP) Cancers sinn [4, 11, 19-26]. A Potential Vermëttler ass DNA methyltransferase 1 (DNMT1) VerfÜgung datt an natierlech Krankheet gastric Cancers upregulated ass an konnt methylation Musteren ze Duechter Zellen op Zell Divisioun [21, 27-29] propagated hëllefen etabléieren. Dräierkoalitioun Studien sinn op Versteesdemech der Roll vun EBV an Helicobacter pylori Wonn anzeschätzen an dauernd inflammation an verbonne global hypermethylation während gastric Kriibs Entwécklung [22]. VerfÜgung An Zell Linn Modeller, DNMT1 overexpression vun EBV LMP1 an LMP2 mediated ass [21, 28 -31]. EBV schéngt epigenetic Mechanismen ze beschäftegen de Provider transcriptome ze kontrolléieren an och Ausdrock vun hirem eegenen virally encoded Genen ze kontrolléieren [11, 12, 14, 15, 19, 21, 24, 29, 32, 33]. Beim éischte Wonn vun enger Zell, kann de unmethylated Haren Nepgen Haren Gedächtnis mat neie virion Produktioun hi, während engem Ziel vun infizéiert Zelle eng héich methylated Haren Nepgen uschafen Ausdrock vun auslänneschen Proteinen squelches an mediates langfristeg Haren Persistenz vun Manéier vun Uklang Wonn [23, 34]. Krankheet erhéijen tendéiert duerchaus methylated EBV DNA, an methylation-Zesummenhang silencing vun Haren Genen ze hunn hëlleft erklären wéi Krankheet erhéijen immun Zerstéierung flüchten. VerfÜgung Iwwerdeems methylation vun der Gentherapie Promoteuren normalerweis mat transcriptional downregulation VerfÜgung via selektiv bindend vun repressor Proteinen assoziéiert ass , déi éischt FAQ jee engem methylated Promoteur ze kruet an aktivéieren VerfÜgung gewise gouf EBV BZLF1, de Schlëssel Faktor der Säitewiessel Uklang zu replicative Formen vun Haren Wonn [35] Kontrollfunktioun. Et schéngt, datt de Virus huet sech iwwer e Mëttel vun bezwéngen Promoteur methylation zu sengem Virdeel Perséinlechkeeten [34, 35]. Antiviral Strategië gi fir hir antineoplastic Potential lant. Spannen, déi oft benotzt antiviral Agenten, acyclovir an ganciclovir, sinn effektiv um Haren Gedächtnis wëllen zou mee se do kënnten net Ausdrock vun Uklang fonnt an fréi lytic Haren Genen wéi LMP1, LMP2 an BZLF1. VerfÜgung D'Medeziner Implikatioune vun EBV- Zesummenhang methylation vun der Nepgen gastric Kriibs sinn Nol. Éischt, Beweiser enstanen weist d'Potenzial fir verbessert Diagnos vun gastric Kriibs vun gastric Mëtten fir Kriibs-spezifesch methylation Musteren Testen, vläicht am Concert mat Tester fir EBV d'Virus-Krankheet Ziel vun Cancers z'identifizéieren [36-40]. Ënnerscheedlecher Musteren vun Promoteur methylation zu Virus-positiv Verglach zu Virus-negativ Zellen [11, 21, 24] ënnersträichen brauchen methylation Musteren an enger Art ze Markenzeeche datt dat assay Sensibilitéit fir Kriibs ze erkennen Dr.. Béid Wonn a verännert DNA methylation schéngen fréi Evenementer zu carcinogenesis ginn [2, 41], eventuell Saachen ze erkennen precancerous lesions am Mo. Jus. VerfÜgung Eng zweet Medeziner deemno ass d'Potential fir verbessert Behandlung vun gastric Kriibs benotzt hun dass de Géigendeel Effet vum Promoteur hypermethylation [42, 43]. Besonnesch, demethylating Agenten datt DNA methyltransferase inhibit an entholl suppressor Gentherapie silencing oder oncogene Aktivéierung sinn potentiell antineoplastic Strategien [43] ëmgedréint. Contrepartie muss an den Effet vun demethylating Agenten Virus-positiv versus VerfÜgung Virus-negativ erhéijen zu méiglech Ënnerscheeder ginn [43-45]. Mir an anerer hunn dat natierlech Krankheet gastric Cancers hunn dës niddreg CDKN2A (p16) Ausdrock [14, 15]. An engem Medeziner Prozess vun fluorouracil (5FU) fir gastric Kriibs, CDKN2A VerfÜgung Promoteur methylation Zoustand war eng onofhängeg Estimatioun vun Iwwerliewe [46]. D'rationale fir mat demethylating Agenten wéi 5-AZA-2'-deoxycytidine zu Medeziner Prozesser stäipt op wëssenschaftlech Beweiser datt Therapie demethylating der tumorigenic Eegeschafte vun Kriibs Zellen geännert. VerfÜgung puer Enquêteuren erfollegräich Krankheet epithelial Zell Linnen mat EBV zu VerfÜgung hunn kënschtlech VerfÜgung [47, 48]. Hëllef niddereg-Dicht microarray Analyse vun der aktueller Etude, EBV-positiven an EBV-negativ AGS Zellen gastric Kriibs sech fir Differenzen an der Gentherapie Ausdrock Musteren iwwerpréift an Transkriptiouns polymerase Kette Reaktioun (rtPCR) ëmgedréint. AGS ass eng Zell Linn déi ursprénglech aus gastric adenocarcinoma Otemschwieregkeeten ugebaut gouf an elo dicht als Modell vun gastric Kriibs benotzt gëtt. D'Roll vun DNA methylation zu ausgewielt Effekter mediating war vun bisulfite DNA sequencing iwwerpréift an duerch d'Fäegkeet vun enger demethylating Agent Testen den Effet vun EBV op Gentherapie silencing zu ëmgedréint. Resultater réischt extensiv Gentherapie dysregulation op EBV Wonn am AGS Zellen mat Beweis datt Promoteur methylation ass responsabel, op d'mannst zu engem Deel. Reversal vun Virus-verbonne transcriptional Effekter hindeit datt demethylating Agenten sollten fir hiren Potential lant ginn malignancies zu Kontroll Wuesstem vun EBV-dinn. VerfÜgung Method VerfÜgung Gastric Cancer Zell zesummeféieren VerfÜgung D'AGS gastric Kriibs Zell Linn (ATCC CRL- 1739) huet zu Dulbecco d'geännert Eagle d'mëttlerer cultured wouvun 10% an et Bovine serum (Hëtzt-inactivated fir 20 Minutte bei 65 ° C) an 1% penicillin-streptomycin (10.000 Unitéiten penicillin, 10.000 μg /ml streptomycin, Gibco, Karlsbad CA) . D'Zellen sech mat engem recombinant EBV Deformatioun (e Geschenk vum Dr. Henri J. Delecluse) Krankheet [33, 49, 50] dat esou war gréng fluorescence FAQ (GFP) an hygromycin B Resistenz zu ausdrécklech vun deene Genen nees prototypic B95 Klone .8 Klischee vun EBV wou d'zweet Kopie vun oriLyt normalerweis vermaach. Ier Wonn, goufen AGS Zellen mat 1 μg vun Ausdrock Vecteure Zeechesaatz CD21 transfected (d'EBV receptor) an engem puromycin Resistenzgen vun Fugene mat 6 (Roche, Indianapolis, IN) wéi virdru beschriwwen [51]. Um 48 Stonnen Post-transfection, huet fir mat 0,5 μg /ml vun puromycin-HCl (Roche) CD21 Zellen mat positif ausgewielt. Haren Stock vun recombinant EBV waren an Niere 293 Zellen, eng mënschlech embryonal epithelial Zell Linn, entsteet duerch lytic Gedächtnis Pinguin 20 Dummeldéng /ML bor 12-tetradecanoate 13-acetate an 3 mm butyrate benotzt. Supernatants goufen 3 Deeg no Aféierungs- recoltéiert, Filter (0,8 μM), an bei -80 ° C bis benotzen gefruer. Puromycin-resistent AGS Zellen sech op 50% vun all d'Dicht vun 60-mm Otemschwieregkeeten Kultur Platen a Co-incubated mat 1 ml vu Bourse virions plated. Véier Deeg méi spéit, de EBV-Krankheet AGS Zellen (elo genannt AGS-B95-HygB) waren positiv mat 100 μg /ML hygromycin B (Roche) ausgewielt. VerfÜgung DNA fingerprinting confirméiert datt AGS Zellen an dëser Etude benotzt reagéiert der genotype vun AGS Zellen an der American Type Kultur Collection. Fingerprinting gemaach huet mat der PowerPlex 1.2 ierjend Kit (Promega) gefollegt vun electrophoresis op eng Abi 310 capillary gelies electrophoresis Instrument (Obwuel Biosystems). VerfÜgung Gene Expression vum Histochemical eweg VerfÜgung Paraffin Bleck sech bereet aus AGS an AGS-B95- HygB Zell Linnen, an paraffin Bleck vum primäre gastric adenocarcinoma sech vu Krankheete Archiver Sensor. De Reschtoffall Medeziner uplanzen vertrieden all sinn EBV positive gastric Cancers (n = 9) an engem zoufälleg Auswiel vun EBV-negativ gastric Cancers (n = 9). Histochemical eweg waren zu paraffin Rubriken applizéiert Wonn ze confirméieren an der Gentherapie Ausdrock ze diskutéieren. Ze preparéieren spären, goufen cultured Zellen éischt zu Dulbecco d'phosphate gefiermt Salins (Gibco, Invitrogen), recoltéiert mat 0,25% trypsin (Gibco, Invitrogen) rinsed, enmeshed zu enger Pipette benotzt Dade Ci-Trol Coagulation Control (Citrated) -Level 1 (Dade Behring, Marburg, Däitschland) an Thrombin 200 (Pazifik Hemostasis, Middletown, VA), zu 10% gefiermt formalin, Ënnerbewosstsinn paraffin fix, an sectioned op Beschichtete drënner. VerfÜgung Bobby VerfÜgung zu situ VerfÜgung hybridization Leeschtung war fluorescein-Bezeechnung benotzt Bobby VerfÜgung Studiebäihëllefe an oligo (d) T Kontroll bis ewell op enger Ulass zu situ VerfÜgung hybridization System (Ventana Medical Systemer, Tucson, AZ). Immunohistochemical eweg fir EBV LMP1 an LMP2 Proteinen sech als virdru beschriwwen standing [52] citrate antigen retrieval benotzt an der CS1-4 Cocktail vun Maus monoclonal antibodies géint LMP1 (1: 100, Dako, Capinteria, CA) an der E411 Grenzwäerter monoclonal antibody géint LMP2 (1 mg /ml, Asencion, München, Däitschland). Paraffin Rubriken vun EBV-Zesummenhang Hodgkin lymphoma an Post-Transplantatioun lymphoproliferative Stéierungen als positive Kontrollen VerfÜgung Immunohistochemical Analyse vun der EBV replicative Proteinen BMRF1 an BZLF1 Leeschtung war mat anti-BMRF1 Klon G3-E31 ​​(1:. 200 dilution, Research kinnt Galaxy, Flandern, NJ) an Anti-BZLF1 Klon BZ.1 (1:25 dilution, Dako, Carpinteria, CA), während Mënsch PTGS2 (Volleksmond cyclooxygenase-2 benannt, COX2) war anti-COX2 monoclonal antibody assayed benotzt ( 1: 200 dilution, Cayman chemesche). Sektiounen sech op 37 ° C fir d'EBV Ziler mat der Primärschoul antibody fir 30 Minutten incubated, oder bei 4 ° C Iwwernuechtung fir COX2, déi Spären an erkennen Ëmwelt- an der Super-empfindlech Non Biotin HRP Detektioun Kit (Biogenex) benotzt. Bound antibody war mat diaminobenzidine chromogen (Biogenex) fonnt ginn an Zellen sech counterstained mat hematoxylin (Dako). Paraffin Rubriken vun mëndlech liicht leukoplakia als eng positiv Kontroll fir lytic EBV, iwwerdeems reaktiv tonsil an nasopharyngeal carcinoma Stoffer wéi Kontrollen fir COX2 eweg fiert. Resultater goufen duerch microscopic ukomm vun malignant Zellen zu ≥10 Felder bei 400x Vergréisserung noginn Moyenne Undeel stoung (0 = keent, interpretéiert 1 = &Si besteet; 1%, 2 = 1-10%, 3 = 10-33%, 4 = 33 -66%, 5 = > 66% vun Zellen) an Intensitéit stoung (0 = keent, 1 = schwaach, 2 = Zuelen, 3 = staark staining). Total Fändelen waren am EBV Verglach positive versus VerfÜgung negativ erhéijen engem Mann-Whitney unpaired t Test mat. VerfÜgung Detektioun vun der EBV Nepgen VerfÜgung enger Batterie vun grouss real-Zäit Hinnen alleguer (Q-Hinnen alleguer) assays gezielt sechs disparate Regioune vun der EBV Nepgen datt Haren Wonn vun AGS Zellen war Erfolleg vermëttelt gouf benotzt. Implikatioune Produite fonnt goufen d'Abi Prism 7500 Real-Time Hinnen alleguer Instrument mat liichtkraaftarm Detektioun System Software (Obwuel Biosystems) benotzt ëmschriwwen virdrun primers benotzt gezielt BamH1W VerfÜgung, EBNA1 VerfÜgung, LMP1 VerfÜgung, LMP2 VerfÜgung, an BZLF1 VerfÜgung Regioune vun der EBV Nepgen [52] oder EBER1 VerfÜgung DNA [53]. Ze kontrolléieren fir amplicon kontaminéierte, aus all Course op d'mannst zwee "kee Skelett" Kontrolle vun deenen nuclease-gratis H2O fir Skelett agesprong war. VerfÜgung Low-Densitéit cDNA Microarray Analys VerfÜgung RNS vom AGS an AGS-B95- HygB Zellen der RNeasy RNS Mini Kit (QIAGEN) mat der éischter d'QiaShredder ™ spin Kolonne (QIAGEN) benotzen d'Zellen ze Lyse. RNS Integritéit mat engem Agilent Bioanalyzer, Ausdrock microarray Analyse gouf vun SABiosciences Corporation (Friedrich, MD) standing doropper GEArray Q Serie Mënscherechter Signal Transduction am Cancer Gene Singular No confirméiert. Dës héich-Dicht microarray besteet aus 96 Ämter datt zu oncogenesis Équipe Aktivatioun vun 15 Signal transduction Weeër Test. (Target gët sinn am Bilan opgezielt.) Biotin-Label cDNA aus 10 μg vun all RNS Prouf bereet mat der AmpoLabeling-LPR Method (SABiosciences) war fir d'Partie hybridized, an chemiluminescent erkennen ass mat enger CCD Kamera gesuergt. Integréiert Matière Intensitéit Wäerter fir all Fleck sech duerch GEArray Analys Suite Software (SABiosciences) entsteet, an weider Analyse an normalization war mat Microsoft Excel gesuergt. Déi déifst Plaz Intensitéit Wäert op all Partie war als Hannergrond ze ginn a gouf vun all Matière Intensitéit Wäert fir all Studiebäihëllefe subtracted, an da waren Plaz intensities normalized fir datt de housekeeping Gentherapie, glyceraldehydephosphate dehydrogenase (GAPDH VerfÜgung). A pairwise Verglach vun der Gentherapie Ausdrock Niveauen war tëscht der EBV-positiv Zellen (AGS-B95-HygB) an Elteren EBV-negativ AGS Zellen feieren. Wann d'Verhältnis ≥2 oder ≤0.5 war, war d'Gentherapie considéréiert zu infizéiert Zelle upregulated oder downregulated gin. VerfÜgung SYBR Green Semiquantitative rtPCR VerfÜgung ausgewielt microarray Gentherapie Ausdrock Resultater ze confirméieren, war rtPCR standing Real-Time RT benotzt 2 Gentherapie-spezifesch Hinnen alleguer primers (SABiosciences). D'ReactionReady ™ Éischt Strand cDNA Synthes Kit (SABiosciences) war benotzt ze konvertéieren 3 μg vun RNS zu cDNA, an der cDNA war 1:10 virun Hinnen alleguer Analyse verdënntem. Déi folgend 38 cDNAs sech geziilte: GAPDH, A2M, ABCB1, BCL2L1, BIRC1, BIRC2, BIRC3, EN1, GADD45, HIF1A, ID2, IGFBP3, BRCA1, TMEPAI, IRF1, BCL2, BMP4, CDKN2A (p16), FN1, HK1, ICAM1, IL2, CCND1, MDM2, COX2 (PTGS2), TFRC, WISP1, TRAF1, CDK2, VCAM1, CDKN2C (p18), CDKN1A (p21), DUSP1, HSP70, NFKB1, TNFSF10, TRIM25 VerfÜgung, an FOSL1
. Reaktioune waren am Ganzen Volume vun 25 μL wouvun 1x TaqMan ® Universal Mix (Abi) gesuergt, RT 2 Gentherapie-spezifesch primer Formatioun Mëschung (10 μM all primer, SABiosciences), 2,5 μL 5X SYBR gréng Léisung ( molekulare Ämter, Eugene, OR), a 5 μL vun cDNA Schablounen. Thermocycling ware: 50 ° C fir 2 Minutten, 95 ° C fir 10 Minutten an 40 Zykle vun 95 ° C fir 15 Sekonnen an 60 ° C fir 1 Minutt op eng Abi 7500 Instrument mat liichtkraaftarm Detektioun System Software (Obwuel Biosystems). D'selwecht loung war fir all Gentherapie an Plack vun der "Relativ Quantification Käerz" Protokoll bewäert ginn. All Hinnen alleguer Reaktioun war zu triplicate fir all Prouf op zwou getrennte 96-gutt Placke lafen, an Resultater averaged sech zu all Gentherapie d'Ausdrock Niveau vun der EBV-positiv versus VerfÜgung EBV-negativ Zell Linn relativ Ënnerscheeder ze bestëmmen. VerfÜgung Minor Gréngs bindend Studiebäihëllefe Semiquantitative rtPCR VerfÜgung Ausdrock vu fënnef ausgewielt Genen ze diskutéieren, datt net op der microarray uewen beschriwwen huet, semi-grouss rtPCR assays sech standing (Assays-iwwert réicht, Obwuel Biosystems) benotzt minor Gréngs bindend Ämter gezielt helicase-wëll Transkriptiouns Faktor (HLTF VerfÜgung), trefoil Faktor-1 (TFF1 VerfÜgung), Basis-leucine kridd ATF-wëll Transkriptiouns Faktor (BATF VerfÜgung), inhibitor vun DNA bindend FAQ-4 (ID4 VerfÜgung), an nucleostemin (Nu VerfÜgung). Dës fënnef sech ausgewielt well si Berichter zu enger grousser Unzuel vun gastric adenocarcinomas oder EBV-Zesummenhang Cancers dysregulated sinn [32, 54-59]. GAPDH VerfÜgung als eng endogenous Kontroll fir famill quantification Zwecker. RNS war bis cDNA mat der Héich- Kapazitéit cDNA Archive Kit (Obwuel Biosystems) witzeg, an der cDNA war 1:10 mat nuclease-gratis Waasser verdënntem. All 50 μL Hinnen alleguer Reaktioun enthale: 1x TaqMan ® Universal Master Mix, 1x Target Gene Expression assay oder GAPDH VerfÜgung Endogenous Control Mix, an 10 μL cDNA. Ze fir amplicon kontaminéierte kontrolléieren, war fir Skelett wuel all Ausdrock assay op all Plack op d'mannst zwee "kee Skelett" Kontrolle vun deenen nuclease-gratis Waasser aus. Thermocycling Konditiounen an Daten Analyse uewen fir d'SYBR Green rtPCR. VerfÜgung Demethylation Prefabrizéierten an Sequencing vun Bisulfite-geännert DNA VerfÜgung ëmschriwwen huet sech ze studéieren den Effet vun demethylation, déi AGS an AGS-B95-HygB gastric Kriibs Zell Linnen ugebaut zu 75% confluency an da fir dräi hannereneen Deeg 1 μM vun frësch 5-AZA-2'-deoxycytidine (5aza; Fläch) war deeglech notéiert. Op der véierten Dag, goufen RNS an DNA aus behandelt an onbehandelt Kulturen recoltéiert. RNS war fir Gentherapie Ausdrock Niveauen évaluéiert, a war DNA fir methylation iwwerpréift der Natrium bisulfite Behandlung (EZ DNA Methylation Kit, Zymo Fuerschung, Orange, CA) zu unmethylated cytosines zu uracil geflunn, iwwerdeems methylated cytosines dropp [60] hält. De positiven Kontroll war CpGenome Universal Methylated DNA (Chemicon) zu der selwechter bisulfite Konversioun ënnerworf, a Kontroll primers der C8orf4 VerfÜgung bewosst Gentherapie Promoteur bestätegt erfollegräich bisulfite Ëmbau vun all DNA Prouf [61] gezielt. CpG Insele mat CpG Plot fir jiddereng vun fënnef Mënsch genes-- ICAM1 VerfÜgung (RefSeq # NM_00201), CDKN2A (p16) VerfÜgung (RefSeq # NM_000077.3), ID4 VerfÜgung (RefSeq # NM_001546) identifizéiert, COX2 VerfÜgung (RefSeq # NM_000963), an TFF1 VerfÜgung (RefSeq225.2) - fir dee Promoteur Message (3000 basepairs Offloss vun der Transkriptiouns Start Site duerch Exon 1) sech aus GenBank erofgeluede. Déi folgend Parametere fir CpG Insel Identifikatioun sech benotzt: minimum Längt vun 200 BP, minimum Duerchschnëtt Prozentsaz vun C + G vun 50%, an minimum Duerchschnëtt Verhältnis vun observéiert C + G vun 0.6 [62] zu erwaart. Z'identifizéieren war CpG dichten Regioune fir COX2 VerfÜgung an TFF1 VerfÜgung, de Minimum Längt Parameter zu 50 BP reduzéiert [61]. Primer Message sinn an Table 1. All 50 μl Hinnen alleguer Reaktioun dës Texter: 1x Hinnen alleguer Respektiv, 2 mm MgCl _{2, 1 Eenheet Platin Taq DNA Polymerase (Invitrogen, Karlsbad CA), 0,2 mm dNTPs (Abi), an 30 pmol vun all primer. Thermocycling ware: 94 ° C fir 2 Minutten, 40 Zykle vun 94 ° C fir 30 Sekonnen, 55 ° C fir 30 Sekonnen, an 72 ° C fir 1 Minutt, 72 ° C fir 10 Minutten. Fir amplicon kontaminéierte kontrolléieren, aus all Course e "nee Skelett" Kontroll an déi nuclease-gratis Waasser war fir templateTable Aen 1 Bisulfite ëmgerechent Gene-Spezifësch Hinnen alleguer Primer Message VerfÜgung ICAM1 VerfÜgung
Stiermer
5'-TGG GGG TTG TGG Eenzelzäitfueren Tag TT-3 "
Réckproduktioun VerfÜgung 5'-CTC CCT CCA cta AAA AC-3" VerfÜgung Amplicon Gréisst
412 BP VerfÜgung CDKN2A (p16) VerfÜgung Stiermer VerfÜgung 5'-Agées TGT Eenzelzäitfueren GTG GTT GTT GTG E-3 "VerfÜgung 5'-CAA AAA TCT tcc ATT CTT CAA AC Réckproduktioun VerfÜgung -3 'VerfÜgung Amplicon Gréisst VerfÜgung 418 BP VerfÜgung ID4 VerfÜgung Stiermer VerfÜgung 5'-Eenzelzäitfueren Eenzelzäitfueren GGG Stoffel ATA TTA GTT TGG-3 "VerfÜgung 5'-Stoffel CCT Réckproduktioun VerfÜgung AAT CAC tcc CTT C-3 "VerfÜgung Amplicon Gréisst VerfÜgung 477 BP VerfÜgung COX2 VerfÜgung Stiermer VerfÜgung 5'-Stoffel GTG TTG Stoffel ATA Série Tag E-3" VerfÜgung Réckproduktioun VerfÜgung 5'-AAA AAA TAA tcc CCA CTC TC -3 'VerfÜgung Amplicon Gréisst VerfÜgung 399 BP VerfÜgung TFF1 VerfÜgung Stiermer 5'-TTA GGT TGG Agt GTA GTA GG-3 VerfÜgung' VerfÜgung ëmgekéierte VerfÜgung 5'-CCT ACT CAT ATC TAA AAA zu Enn C-3 "VerfÜgung Amplicon Gréisst VerfÜgung 489 BP VerfÜgung C8orf4 Kontroll VerfÜgung Stiermer VerfÜgung 5'-GAA TTA AAA Stoffel AAG Série Agt Allerdéngs, 3 'VerfÜgung Réckproduktioun VerfÜgung 5'-AAC ATT zu Enn CAA ACA TAA AAC AA-3 "VerfÜgung Amplicon Gréisst VerfÜgung 328 BP VerfÜgung Sequencing war op amplicons vun bisulfite-behandelt Skeletter standing z'identifizéieren der methylated an unmethylated CpGs mat oder ouni 5aza Behandlung. Éischt, war all Hinnen alleguer Produit gekloonten an pGEM-T Vecteure der pGEM-T Easy Vecteure System II (Promega) an transforméiert zu JM109 héich Effizienz zoustännegen Zellen benotzt. White Kolonien Text mat sech ausgewielt an cultured iwwernuecht, an plasmid DNA huet mat der QiaPrep Spin Miniprep Kit (QIAGEN) ofgebaut. Sequencing war op en Abi 3100 genetesch Organer gemaach d'Abi PRISM benotzt ™ BigDye ™ Version 1.1 Terminator Cycle Ready Reaktioun Kit mat AmpliTaq DNA Polymerase an eng M13R3 primer. Resultater goufen an Sequencher Software (Gene haale, Ann Arbor, MI) erofgeluede de Géigendeel ergänzen vun all Haaptrei ze kréien, an souwuel vir an ëmgedréint Message goufen ageriicht an analyséiert unmethylated cytosines aus methylated cytosines fir z'ënnerscheeden. Western Blot op der AGS VerfÜgung Zell Linn VerfÜgung Well vun der Potential fir COX2 inhibitor Therapie COX2 Effekter ze iwwerwannen, huet sech den RNS-baséiert Resultater fir COX2 dëse Match gaangen fir ze studéieren Suivi an d'FAQ-Niveau. Spuenien wär AGS Zellen mat oder ouni EBV sech mat 0,25% trypsin, recoltéiert zweemol am phosphate-gefiermt Salins gewäsch, a vun centrifugation pelleted. Zellen sech zu 500 ech NP-40 Zell lysis Prellbock (50 mm Tris-HCl, 150 mm NaCl, 1% NP-40, pH 8.0), incubated op Äis fir 30 Minutten resuspended, an op 12.000 Ziichter fir 15 Minutten op 4 iwwerdroe ° C. Aliquots vun lysate (bei 50, 100, 150 ug FAQ pro gutt) waren SDS-PAGE op engem Tris-glycine 4-20% packt gelies (Invitrogen) an transferéiert op engem nitrocellulose Membran anhand. COX2 war mat engem 1 fonnt: 5.000 dilution vun der monoclonal antibody duerno eng 1: 10.000 dilution vum Secondaire antibody conjugated mat alkaline phosphatase (Amersham Biosciences), an visualization mat engem erweisen PhosphorImager (cuisine Dynamik). Band Dicht gemooss semi-quantitativ a normalized fir Beta actin (ACTB) war Verglach tëscht Krankheet an uninfected AGS Zellen. VerfÜgung Resultater VerfÜgung EBV Wonn vun AGS Gastric Cancer BTS VerfÜgung erfollegräich EBV Wonn vun AGS gastric Kriibs Zellen bestätegt gouf mat sechs Q-Hinnen alleguer assays disparate Segmenter vun der EBV Nepgen gezielt. Bobby VerfÜgung zu situ VerfÜgung hybridization zougedréckt keen Ausdrock VerfÜgung Bobby vun der Elternhaus "EBV-negativ" AGS Zellen, am Ufank méi wéi 90% vun AGS-B95-HygB Zellen Bobby huet VerfÜgung -positive an hat ageschalt -appearing nuklear Wirklechkeet (Dorënner 1). Der Prolifératioun Taux war vun Niewebaach vun cultured AGS-B95-HygB Zellen dräi Deeg virun Elteren AGS Zellen wéi dës fräi. D'Wonn persisted fir op d'mannst 4 Méint als vun GFP a Bobby VerfÜgung histochemical eweg gewisen. Uklang EBV (LMP1 an LMP2A) an lytic (BZLF1 an BMRF1) Proteinen sech zu uninfected AGS Zellen net ausdrécke hierkommen ~ 10% vum Personal Zellen LMP1 ausgedréckt, Halschent d'Zellen ausgedréckt LMP2A, an ~ 35% ausgedréckt BMRF1 an BZLF1 Proteinen ausgeluegt aktiv Haren Gedächtnis (Dorënner 1). Figur 1 AGS-B95-HygB Zellen auszedrécken Uklang fonnt an lytic Haren Genen. A) Immunohistochemical stain fir GFP mobiliséiert hygromycin B-behandelt AGS Zellen vun de esou B95.8 EBV Nepgen uniform infizéiert goufen. B) Bobby zu situ VerfÜgung hybridization beweist Uklang Wonn an > 90% vun den Zellen. Nuclear Bobby VerfÜgung staining leisen der nucleoli, an vergréissert nucleoli sinn e Bewaacher vun bewosst Aktivéierung. Uklang Haren Proteinen LMP1 (C) an LMP2 (D) goufen focally ausgedréckt. Lytic Haren Proteinen, BMRF1 (E) an BZLF1 (F), huet sech zu engem groussen Ëmwandlung vun AGS-B95-HygB Zellen ausgedréckt. (GFP an BMRF1 eweg, 800x; LMP1, LMP2, Bobby VerfÜgung an BZLF1 eweg, 1200x) VerfÜgung bewosst Gene Expression Oneenegkeet EBV-positiv versus EBV-negativ AGS BTS VerfÜgung Expression Niveau vun 96 bewosst Genen goufen analyséiert zu AGS an AGS-B95-HygB Zellen niddreg Dicht microarray Analyse mat chemiluminescent erkennen (Dorënner 2) benotzen. No normalization zu GAPDH VerfÜgung, Teamchef pairwise Verglach vun der Gentherapie Ausdrock Niveau tëscht der EBV-positiven an EBV-negativ AGS Zellen, datt vun der 96. Genen op d'microarray, 43 op d'mannst zwee-Weeër an der EBV Wonn dysregulated goufen. Verwonnerlech, war en EBV-verbonne Erhéijung vun Ausdrock fir nëmmen 6 Genen (IGFBP3 VerfÜgung, GADD45, IRF1, Grp78 /HSPB1, GLUT1 /SLC2A1, TMEPAI VerfÜgung) observéiert, iwwerdeems Ausdrock rofgaang war fir déi reschtlech 37 dysregulated Genen observéiert (ABCB1, BCL2L1, BIRC2, BMP2, CDKN2A, DUSP1, HIF1A, ICAM1, ID2, NFKB1, COX2, TFRC, VCAM1, WISP1, TRIM25, IL2, BMP4, MDM2, CCND1, CDK2, Bax, p57, p19, CSN2, CXCL9 , IL4, Jun, KLK3, LTA, MMP7, PPARG, TNFRSF10B, WIG1, WNT2, PTCH2 VerfÜgung). Figur 2 Gene Ausdrock Musteren vun EBV Wonn vun AGS Zellen verännert. Biotin-Label cDNA beklot Ämter an quadruplicate op engem Nylon Membran un RNS aus AGS an AGS-B95-HygB Zellen isoléiert hybridize. Chemiluminescent Signaler uginn dysregulation vun ausgewielt Genen ënnert de 96 op der vill sou Verglach mat Kontroll Genen an de leschten zwou Reien. VerfÜgung SYBR Green rtPCR benotzt gouf de microarray Conclusiounen fir 26 vun der dysregulated Genen a fir 12 zousätzlech Genen an déi ze kontrolléieren kee groussen Ännerung gouf op der microarray observéiert. Groussregioun wéi zwee-Weeër Verfall vun mRNA Niveau vun Krankheet versus VerfÜgung uninfected Zellen war fir 16/26 Genen (Table 2) fonnt. D'Genen stäerkste staark betraff waren IGFBP3 VerfÜgung dass déi 42-fantastesch upregulated war, an COX2, BMP4, an ICAM1 VerfÜgung déi vun 35- downregulated waren, 32- a 22-fantastesch, bzw.. Déi reschtlech ten microarray-baséiert hire Restaurant goufen net vun rtPCR confirméiert, datt EBV-Zesummenhang dysregulation vun deene Facteure suggeréiert niddreg wéi zwee-Weeër. An ee Beispill, gouf et eng grouss Ënnerscheeder: Expression Niveau vun BCL2L1 VerfÜgung vun microarray Analyse eng zwee-Weeër erofgoen VerfÜgung zu infizéiert Zelle zougedréckt iwwerdeems rtPCR ërem e fënnef-fantastesch Erhéijung VerfÜgung zu BCL2L1 VerfÜgung mRNA zougedréckt Niveau vun Krankheet Zellen. Manner dramatesch Vigel fonnt goufen, wann eng zousätzlech 12 Genen vun rtPCR, mat däitlech analyséiert goufen (> 2-fantastesch) Ännerunge fonnt an den Ausdrock vun 5/12 Genen fir déi kee Verfall op der microarray (Table 2) .Table observéiert gouf 2 Genen am EBV-positiv AGS BTS Dysregulated VerfÜgung Gene Numm
Gene Symbol
falen Uertschaft *
Downregulated Genen VerfÜgung Basis leucine-kridd Transkriptiouns Faktor, ATF-wëll VerfÜgung BATF
-38 VerfÜgung cyclooxygenase-2 VerfÜgung COX2
-35 VerfÜgung Schanken morphogenic FAQ-4
BMP4
-32 VerfÜgung intercellular Haftung Protein-1 VerfÜgung ICAM1
-22 VerfÜgung trefoil Faktor-1 VerfÜgung TFF1
-21
inhibitor vun DNA bindend-2 VerfÜgung ID2
-14 VerfÜgung Hëtzt Schock FAQ-70 VerfÜgung HSP70
-10 VerfÜgung cyclin-ofhängeg kinase-2
CDK2
-9 VerfÜgung cyclin-D1 VerfÜgung CCND1
-9 VerfÜgung hypoxia inducible Faktor-1A VerfÜgung HIF1A
-9
Broscht Kriibs-1 VerfÜgung BRCA1
-7 VerfÜgung nucleostemin VerfÜgung Nu
-7 VerfÜgung cyclin-ofhängeg kinase inhibitor-2A VerfÜgung CDKN2A /p16
-6 VerfÜgung inhibitor vun DNA bindend-4 VerfÜgung ID4
-6 VerfÜgung engrailed-1 VerfÜgung EN1
-5 VerfÜgung ATP-verbindlech Kassett, Sous-Famill B, Member 1 VerfÜgung ABCB1
-3 VerfÜgung MDM2 p53 bindend FAQ VerfÜgung MDM2
-3 VerfÜgung Upregulated Genen
Insulin-wëll Wuesstem Faktor bindend FAQ-3 VerfÜgung IGFBP3
+40 VerfÜgung entholl necrosis Faktor receptor-verbonne Faktor-1 VerfÜgung TRAF1
+20 VerfÜgung transmembrane Aarbecht androgen-entschlof FAQ VerfÜgung TMEPAI
+10 VerfÜgung entholl necrosis Faktor, superfamily Member-10 VerfÜgung TNFSF10
+8 VerfÜgung B Zell lymphoma-2-wëll -1 VerfÜgung BCL2L1
+7 VerfÜgung baculoviral IAP widderhuelen wouvun-3 VerfÜgung BIRC3
+5 VerfÜgung hexokinase-1 VerfÜgung HK1 VerfÜgung}