Epstein-Barr-vírus-specifikus metilezésével emberi gének gyomorrák sejtek

Epstein-Barr-vírus-specifikus metilezésével emberi gének gyomorrák sejtek
Abstract
alapon
Epstein-Barr-vírus (EBV) található 10% -a az összes gyomor adenokarcinómák de a szerepe a tumor fejlődését és karbantartási maradványok homályos. A cél az volt, hogy megvizsgálja az EBV által közvetített szabályozási zavarának celluláris faktorok játszanak a gyomor karcinogenezis.
Módszerek
génexpressziós mintázatok vizsgáltuk EBV-negatív és EBV-pozitív AGS gyomor hámsejtek felhasználásával kis sűrűségű microarray, reverz transzkripciós PCR, hisztokémiai foltok, és a metiláció-specifikus DNS-szekvenálással. Kifejeződése PTGS2 (COX2) mértük AGS sejteken és primer gyomor adenokarcinóma szövetekben. Katalógusa Eredmények
array vizsgálatok közel fele a 96 emberi gének tesztelt, ami 15 különböző rákkal összefüggő jelátviteli utak voltak megbomlik után EBV fertőzés. Reverz transzkripciós PCR megerősítette jelentős hatással tényezők különböző funkciók, mint például a sejtciklus szabályozásában (IGFBP3 katalógusa, CDKN2A, CCND1, 70, ID2 ID4) hotelben, a DNS-javítás (BRCA1, TFF1 katalógusa), sejtadhézió ( ICAM1 katalógusa), gyulladások (COX2 katalógusa), és az angiogenezis (HIF1A katalógusa). A demetilezési használva 5-aza-2'-dezoxicitidin fordított az EBV által közvetített szabályozási zavarának mind a 11 gén itt felsorolt. Egyes promoter szekvencia CpG-sziget metiláció és a demetileződés történt egy EBV-specifikus mintázat, amint biszulfit DNS-szekvenálás. Immunhisztokémia kevésbé volt érzékeny, mint volt western blot kimutatására downregulációját COX2 upon EBV fertőzés. Vírussal kapcsolatos zavara COX2 szintek in vitro katalógusa nem ismételjük in vivo katalógusa között természetesen fertőződött gyomorrák szövetekben. Katalógusa Következtetések katalógusa EBV megváltoztatja az emberi génexpresszió módon hozzájárulhat az egyedi patobiológiája vírus -asszociált rák. Továbbá, a frekvencia és a reversability metiláció kapcsolódó transzkripciós változások arra utalnak, hogy demetilezésével szerek terápiás potenciállal kezeléséért EBV kapcsolatos karcinóma.
Alapon
gyomorrák a negyedik leggyakoribb rák típusától, és a második vezető oka a rák halál világszerte [1]. A különböző genetikai eltérések, valamint a fertőző és egyéb környezeti hatások tűnnek tényezők gyomor kialakulásában. Epstein-Barr-vírus (EBV), egy kettős szálú DNS-gammaherpesvirus, belül található a malignus sejtek 10% -ában a gyomor adenokarcinómák, és a fertőzés úgy tűnik, hogy megelőzik a malignus transzformáció [2]. Alap- és klinikai megfigyelések arra utalnak, hogy az EBV-asszociált gyomorrák eltérő patobiológiája EBV-negatív gyomorrák [3-8]. Racionális tervezése vírus-irányított kezelés megköveteli jobb megértéséhez a patogén szerepét EBV a gyomor karcinogenezis.
Előzetes vizsgálatok kimutatták, veszteség három kritikus tumorszuppresszor géntermék Cdh1 (E-cadherin), P73, és CDKN2A (p16 ), az EBV-fertőzött gyomorrák [9-18]. Vírushoz kapcsolódó metiláció ezen gének együtt bizonyíték a globális DNS metilációjának EBV-pozitív rákok, azt sugallja, hogy az EBV kapcsolatos gyomor rákos megbetegedések egy részhalmaza CpG-szigetre metiláltsági fenotípus (CIMP) rákok [4, 11, 19-26]. A potenciális közvetítő DNS-metil 1 (DNMT1) hotelben, hogy megnövekszik az természetes úton fertőzött gyomorrák, és segíthet megállapítani metilációs mintázat szaporított leánysejtekbe upon sejtosztódás [21, 27-29]. Folyamatban lévő vizsgálatok célja a szerepének megértése EBV és Helicobacter pylori fertőzés a gyulladás és a kapcsolódó globális hipermetiláció során gyomorrák fejlesztés [22].
Sejtvonal modellek DNMT1 túltermelése közvetítik EBV LMP1 és LMP2 [21, 28 -31]. EBV úgy tűnik, hogy alkalmaznak epigenetikus mechanizmusok, hogy ellenőrizzék a fogadó transcriptome és expressziójának szabályozására saját vírus által kódolt gének [11, 12, 14, 15, 19, 21, 24, 29, 32, 33]. Upon kezdeti fertőzés egy sejt, a nem metilált virális genom lehet alávetni a vírusreplikációt, új virion termelés, míg egy részhalmaza fertőzött sejtek szerezni egy nagyon metilezett virális genom hogy squelches expressziója idegen fehérjék és közvetíti a hosszú távú vírusos perzisztencia útján látens fertőzés [23, 34]. A fertőzött daganatok többnyire erősen denaturált EBV DNS és metiláció kapcsolatos hangtompító virális gének segít megmagyarázni, hogyan fertőzött tumorok kikerülni immunrendszer pusztítás.
Míg metilációját génpromotereket leggyakrabban a transzkripciós alulszabályozottsághoz katalógusa keresztül szelektív megkötése represszor fehérjék az első fehérje valaha kimutatták, hogy kötődik és aktiválja katalógusa metilezeit promoter EBV BZLF1, a legfontosabb tényező, ami meghatározza a kapcsolót a látens hogy replikatív formáit vírusfertőzés [35]. Úgy tűnik, hogy a vírus ügyesen fejlődött eszközeként leküzdésének promoter metiláció annak előnye [34, 35]. Vírusellenes stratégiák vizsgálnak azok daganatellenes lehetséges. Érdekes, hogy a leggyakrabban használt vírusellenes szerek, aciklovir és a ganciklovir, hatásosak leállításával vírusreplikáció de nem szünteti expresszióját látens és a korai litikus virális gének, mint például LMP1, LMP2 és BZLF1.
A klinikai vonatkozásait EBV- kapcsolatos metiláció a gyomorrák genom hatalmas. Először is, a feltörekvő bizonyítékok azt mutatják, a lehetséges javított diagnosztizálására gyomorrák tesztelésével gyomor mosások a rák-specifikus metilációs mintázat, talán összehangoltan vizsgálatok EBV, hogy azonosítsa a vírusfertőzött részhalmaza rákok [36-40]. Eltérő ütemben promoter metiláció vírus-pozitív képest vírus-negatív sejtek [11, 21, 24] hangsúlyozzák, jellemzésére metilációs mintázat oly módon, hogy, amely maximalizálja a vizsgálat érzékenysége a rák kimutatására. Mind a fertőzés és a megváltoztatott DNS-t metiláció tűnnek korai események a karcinogenezisben [2, 41], potenciálisan megkönnyítése kimutatására rákot megelőző elváltozások gyomor gyümölcslé.
Egy második klinikai következménye, a potenciális jobb kezelésére gyomorrák a drogok, hogy megfordítsa a hatása promóter hipermetilációt [42, 43]. Különösen demetilezésével szerek, amelyek gátolják a DNS metiltranszferáz és reverz tumorszuppresszor gén silencing vagy onkogén aktiválás potenciális daganatellenes stratégiák [43]. Figyelembe kell venni, hogy a lehető különbségek hatásának demetilációs ügynökök vírus pozitív versus katalógusa vírus-negatív tumorok [43-45]. Mi és mások kimutatták, hogy a természetben a fertőzött gyomor rákos megbetegedések alacsonyabb CDKN2A (p16) expressziós [14, 15]. Egy klinikai vizsgálatban a fluorouracil (5FU) gyomorrák, CDKN2A katalógusa promóter metilációs állapotát egy független előrejelzője a túlélés [46]. Ennek magyarázata használatának demetilező ágensek, mint a 5-aza-2'-dezoxicitidin a klinikai vizsgálatok során nyugszik tudományos bizonyíték arra, hogy demetilezésével terápia módosítja a tumorigén tulajdonságai a rákos sejtek.
Számos kutató sikeresen fertőzött epithelialis sejtvonal EBV in katalógusa vitro katalógusa [47, 48]. A jelenlegi vizsgálatban EBV-pozitív és EBV-negatív AGS gyomorrák sejteket megvizsgáltuk különbségek génexpressziós minták segítségével kis sűrűségű microarray és reverz transzkripciós polimeráz-láncreakció (rtPCR). AGS olyan sejtvonal, amelyet eredetileg termesztett gyomor adenokarcinóma szöveti és most széles körben használják, mint egy modellt gyomorrák. A szerepe a DNS metiláció közvetítésében kiválasztott hatásokat vizsgálta biszulfit DNS szekvenálás és tesztelésével képes egy demetilációs ügynök, hogy fordított a hatása EBV a géncsendesítéssel. Eredmények azt mutatták, kiterjedt gén diszreguláció upon EBV-fertőzés AGS sejtek bizonyíték, hogy a promoter metiláció a felelős, legalábbis részben. Visszafordítása vírushoz kapcsolódó transzkripciós hatások azt sugallja, hogy demetilezésével szereket kell tárni az a képességük, hogy ellenőrizzék a növekedés az EBV-rosszindulatú elváltozásokkal kapcsolatos.
Módszerek
Gyomor rákos sejtvonalak
A AGS gyomorrák sejtvonal (ATCC CRL- 1739) tenyésztünk Dulbecco-féle módosított Eagle-féle tápközeg, amely 10% magzati borjúszérumot (hővel inaktivált 20 percen át 65 ° C-on) és 1% penicillin-sztreptomicin (10.000 egység penicillinnel, 10,000 ng /ml sztreptomicin, Gibco, Carisbad, CA) . A sejteket fertőztünk rekombináns EBV törzs (ajándéka Dr. Henri J. Delecluse) [33, 49, 50], hogy úgy tervezték, hogy kifejezzék a zöld fluoreszcens fehérje (GFP), és higromicin B rezisztencia klónozásával ezeket a géneket a prototipikus B95 0,8 törzset EBV, ahol a második példányt a oriLyt általában tartózkodik. A fertőzés előtt, AGS sejteket transzfektáltunk 1 jig kódoló expressziós vektorral CD21 (az EBV-receptor), és egy puromicin-rezisztencia gén által Fugene 6 (Roche, Indianapolis, IN) a korábban leírtak [51]. A 48 órával a transzfekció után a sejteket tartalmazó CD21 pozitívan kiválasztva 0,5 ug /ml puromicin-HCl (Roche). Vírusos készletek rekombináns EBV képződött vese 293-sejtek, humán embrionális epiteliális sejtvonalból, indukálásával litikus replikációs használva 20 ng /ml forbol-12-tetradekanoát-13-acetát és 3 mM-butirát. A felülúszókat 3 nappal az indukció után, szűrjük (0,8 uM), és lefagyasztottuk -80 ° C hőmérsékleten tároltuk felhasználásig. A puromicinrezisztens AGS sejteket szélesztettünk 50% a teljes sűrűség 60 mm-es szövettenyésztő edényekbe és társ-on inkubáltuk 1 ml készlet virionok. Négy nappal később, az EBV-fertőzött AGS sejtek (most hívott AGS-B95-HygB) pozitívan kiválasztott 100 ng /ml higromicin B-t (Roche).
DNS ujjlenyomat megerősítette, hogy AGS sejtek ebben a vizsgálatban alkalmazott illeszkedik a genotípusa AGS sejtek az American Type Culture Collection. Ujjlenyomat alkalmazásával végeztük PowerPlex 1.2 STR készlet (Promega), majd elektroforézissel ABI 310 kapilláris gél elektroforézis eszköz (Applied Biosystems).
Gene Expression hisztokémiai Stains
parafintömböket készítettünk AGS és AGS-B95- HygB sejtvonalak és parafintömböket primer gyomor adenokarcinóma nyertük vissza a klinikai levéltár. A maradék klinikai minták képviselik az összes rendelkezésre álló EBV pozitív gyomor rák (n = 9) és egy véletlen kiválasztás az EBV-negatív gyomor rák (n = 9). Hisztokémiai foltok vittük paraffinos metszeteket megerősíteni fertőzést, és értékelje a génexpresszió. Hogy előkészítse blokkok, tenyésztett sejteket először leöblítettük Dulbecco-féle foszfáttal pufferolt sóoldattal (Gibco, Invitrogen), betakarított 0,25% tripszinnel (Gibco, Invitrogen), behálózta a vérrög használatával Dade Ci-Trol koagulációs vezérlés (citrátos) szintű 1 (Dade Behring, Marburg, Németország) és a trombin 200 (Pacific Haemostasis, Middletown, VA), fix 10% -os pufferolt formaiinban fixáltuk, paraffinba ágyaztuk, és metszeteket, bevonattal ellátott csúszdák.
EBER
in situ
hibridizációt végeztünk fluoreszcein-jelzett EBER katalógusa szonda és oligo (d) T szabályzó szonda egy Benchmark in situ hibridizáció katalógusa rendszer (Ventana Medical Systems, Tucson, aZ). Immunhisztokémiai EBV LMP1 és LMP2 fehérjéket végeztük a korábban leírtak [52] alkalmazásával citrát antigén-visszanyerés és a CS1-4 koktél egér monoklonális antitestek ellen LMP1 (1: 100, Dako, Capinteria, CA), és az E411-es patkány monoklonális antitest ellen LMP2 (1 mg /ml-es, Asencion, München, Németország). Paraffin metszeteket EBV összefüggő Hodgkin-lymphoma és a transzplantáció utáni limfoproliferatív rendellenesség szolgált pozitív kontrollként.
Immunhisztokémiai vizsgálatát az EBV replikációs fehérjék BMRF1 és BZLF1 végeztünk anti-BMRF1 klón G3-E31 ​​(1: 200 hígítás, Research Diagnostics , Inc., Flanders, NJ) és az anti-BZLF1 klón BZ.1 (1:25 hígítás, Dako, Carpinteria, CA), míg az emberi PTGS2 (köznyelvben elemzi a ciklooxigenáz-2, COX2) vizsgáltuk anti-COX2 monoklonális antitesttel ( 1: 200 hígítás, Cayman Chemical). A metszeteket primer antitesttel inkubáltuk 30 percig 37 ° C-on az EBV célokat, vagy 4 ° C hőmérsékleten egy éjszakán számára COX2 segítségével a blokkoló és kimutatási protokollok a Super-érzékeny nem Biotin HRP Detection Kit (Biogenex). A kötődött ellenanyagot használva diaminobenzidin kromogén (Biogenex), és a sejteket hematoxilinnel ellenfestettük (Dako). Paraffin szakaszai orális leukoplakia szolgált pozitív kontrollként litikus EBV, míg a reaktív mandulában és orr-garat karcinóma szövetek szolgáltak kontrollként COX2 foltokat. Az eredményeket értelmezi mikroszkopikus pontozási rosszindulatú sejtek ≥10 mezők 400x nagyítással így egy átlagos aránya pontszám (0 = nincs, 1 = < 1%, 2 = 1-10%, 3 = 10-33%, 4 = 33 -66%, 5 = > 66% -a sejt) és intenzitása pontszám (0 = nincs, 1 = gyenge, 2 = közepes, 3 = erős festődés). Összesen pontszámokat hasonlítottuk össze EBV pozitív versus
negatív tumorok alkalmazásával Mann-Whitney-párosítatlan t-teszt.
Detektálása az EBV genom
egy akkumulátor kvantitatív valós idejű PCR (Q-PCR) vizsgálati eljárások célzási hat eltérő régióiban a EBV genom alkalmaztuk annak bizonyítására, hogy vírusfertőzés AGS sejtek sikeres volt. Amplifikált termékeket kimutatható az ABI Prism 7500 Real-Time PCR eszköz Sequence Detection System szoftver (Applied Biosystems) a korábban leírtak primereket használva megcélzó BamH1W katalógusa, EBNA1 katalógusa, LMP1 katalógusa, LMP2 katalógusa, és BZLF1
régióiban a EBV genom [52] vagy EBER1
DNS [53]. Hogy ellenőrizze fragmentum szennyeződés, minden futtatás tartalmazott legalább két "nincs sablon" ellenőrzés, amely nukleáz mentes H2O helyettesítettük sablon.
Alacsony sűrűségű cDNS microarray katalógusa RNS-t izoláltunk AGS AGS-B95- HygB sejtek az RNeasy RNS Mini Kit (Qiagen), miután először használja a QiaShredder ™ Spin Column (Qiagen), hogy lizáljuk a sejteket. Miután meggyőződtünk RNS integritását Agilent Bioanalyzer, expressziós microarray analízist SABiosciences Corporation (Frederick, MD) segítségével a GEArray Q Series emberi jelátviteli Cancer Gene Array. Ez az alacsony sűrűségű csip áll 96 próbákkal, teszt aktiválása 15 jelátviteli utak részt onkogenezis. (Cél transzkriptumok vannak felsorolva végeredményre.) Biotin-jelzett cDNS készített 10 ug az egyes RNS-minta felhasználásával AmpoLabeling-LPR módszer (SABiosciences) hibridizáljuk a tömb és a kemilumineszcens detektálás segítségével végeztük egy CCD-kamera. Integrált nyers intenzitás értékek minden egyes foltra generáltunk GEArray Analysis Suite software (SABiosciences), és a további elemzés és normalizálás végeztünk Microsoft Excel. A legalacsonyabb folt intenzitása értéket minden egyes tömb ítélték meg, háttér, és kivonjuk az egyes nyers intenzitás értéket minden egyes szonda, majd spot intenzitások normalizáltuk, hogy a háztartási gén, glyceraldehydephosphate dehidrogenáz (GAPDH katalógusa). A páronkénti összehasonlítása gén expressziós szint között végezték az EBV-pozitív sejtek (AGS-B95-HygB) és a szülői EBV-negatív AGS sejteket. Ha az arány volt ≥2 vagy ≤0.5, a gén úgy gondolták, hogy serkentett vagy downregulált a fertőzött sejtekben.
SYBR Green Szemikvantitatív rtPCR
Annak igazolására kiválasztott microarray génexpresszió eredménye, rtPCR végeztünk real-time RT 2 gén-specifikus PCR-primereket (SABiosciences). A ReactionReady ™ First Strand cDNA Synthesis Kit (SABiosciences) használtunk átalakítására 3 ug RNS cDNS-t és a cDNS-t 1:10 arányban hígítottuk, mielőtt a PCR elemzést. A következő 38 cDNS-eket célzott: GAPDH, A2M, ABCB1, BCL2L1, BIRC1, BIRC2, BIRC3, EN1, GADD45, HIF1A, ID2 IGFBP3, BRCA1, TMEPAI, IRF1, BCL2, BMP4, CDKN2A (p16), FN1, HK1, ICAM-1, IL-2-, CCND1, MDM2, COX2 (PTGS2), TFRC, WISP1, TRAF1, CDK2, VCAM1, CDKN2C (P18), CDKN1A (p21), DUSP1, 70, NFKB1, TNFSF10, TRIM25 katalógusa, és FOSL1
. Reakciókat hajtottunk végre össztérfogatban 25 ul tartalmazó 1X TaqMan ® Universal Mix (ABI), RT 2 gén-specifikus primer keverék (10 uM mindegyik primerből, SABiosciences), 2,5 ul 5X SYBR zöld oldatot ( Molecular Probes, Eugene, OR), és 5 mikroliter cDNS-sablon. Termocikiusos feltételek a következők voltak: 50 ° C-on 2 percig, 95 ° C-on 10 percig, és 40 ciklus 95 ° C-on 15 másodpercig és 60 ° C-on 1 percig az ABI 7500 eszköz Sequence Detection System szoftverének (Applied Biosystems). Ugyanez küszöb használni minden gén és a lemezt értékelték a "relatív mennyiségi Plate" protokoll. Mindegyik PCR-reakciót futni három párhuzamosban minden egyes minta a két különálló, 96 lyukú lemezekre, és az eredményeket átlagoltuk, hogy meghatározzák a relatív különbségek az egyes gén expressziós szintjét az EBV-pozitív versus
EBV-negatív sejtvonalban.
Minor Groove Binding Probe szemikvantitatív rtPCR katalógusa értékelni kifejeződése öt kiválasztott gének, amelyek nem voltak a microarray fent leírt szemikvantitatív rtPCR vizsgálatot végeztünk (esszék-on Demand, Applied Biosystems) alkalmazásával minor groove kötési próbák célzó helikáz-szerű transzkripciós faktor (HLTF
), lóhere faktor-1 (TFF1
), bázikus-leucin cipzár ATF-szerű transzkripciós faktor (BATF
), inhibitor DNS-kötő fehérje-4 (ID4
), és nucleostemin (NU katalógusa). Ez az öt választottuk, mert azok állítólag diszreguláit egy jelentős hányada gyomor adenokarcinómák vagy EBV-vel kapcsolatos rákok [32, 54-59]. GAPDH katalógusa szolgált endogén kontroll relatív mennyiségi célokra. Az RNS-t alakítjuk cDNS-sé a nagykapacitású cDNS Archive Kit (Applied Biosystems), és a cDNS-t 1:10 arányban hígítjuk nukleázzal-mentes vízzel. Mindegyik 50 pl PCR reakció tartalmazta: 1X TaqMan ® Universal Master Mix, 1X génexpresszió vizsgálattal vagy GAPDH katalógusa endogén kontroll mix, és 10 pl cDNS. Hogy ellenőrizze fragmentum szennyeződés, minden kifejezés vizsgálati minden lemezen szereplő legalább két "nincs sablon" ellenőrzés, amely nukleáz-mentes vízzel helyettesítettük sablon. Termocikiusos feltételek és az adatok elemzése volt, mint fentebb az a SYBR Green rtPCR.
Demetilezését kezelése és szekvenálása biszulfittal átalakított DNS
Ahhoz hatásának vizsgálatára demetilezési, a AGS és AGS-B95-HygB gyomorrák sejtvonalak voltak növesztjük 75% -os összefolyásig, majd három egymást követő napon 1 umol friss 5-aza-2'-dezoxicitidin (5aza; Sigma) adtunk naponta. A negyedik napon, RNS és DNS-t összegyűjtöttük a kezelt és a kezeletlen tenyészetekben. RNS-t értékeltük gén expressziós szinteket, és a DNS-t vizsgáltuk metilációs után nátrium-hidrogén-szulfit kezelés (EZ DNS metiláció Kit, Zymo Research, Orange, CA) átalakítani metilálatlan citozin uracillá, miközben metilezett citozinok változatlan [60]. A pozitív kontroll volt CpGenome Universal Denaturált DNS-t (Chemicon) vetjük alá, ugyanazt a biszulfit átalakítás, és a kontroll láncindítók megcélzó C8orf4
celluláris gén promoter megerősítette sikeres biszulfit konverzió minden egyes DNS-minta [61]. CpG-szigetek azonosítottak CPG Plot mind az öt emberi genes-- ICAM1 katalógusa (RefSeq # NM_00201), CDKN2A (p16) hotelben (RefSeq # NM_000077.3), ID4 katalógusa (RefSeq # NM_001546) COX2
(RefSeq # NM_000963) és TFF1 katalógusa (RefSeq.225,2) -, melyek promoter szekvenciákat (3000 bázispár upstream a transzkripciós start hely keresztül exon 1) letöltött GenBank. A következő paraméterek CpG-szigetre azonosítás használtuk: minimális hossza 200 bp, minimális átlagos aránya a C + g 50% -os, és a minimális átlagos aránya a megfigyelt a várt C + G 0,6 [62]. Azonosítani CpG sűrű régiókat COX2 katalógusa és TFF1 katalógusa minimális hossza paraméter csökkent 50 bp [61]. Primer szekvenciákat 1. táblázatban mutatjuk be minden egyes 50 ul PCR reakció tartalmazta: 1X PCR-puffer, 2 mM MgCI 2, 1 egység Platinum Taq DNS-polimerázt (Invitrogen, Carlsbad, CA), 0,2 mM dNTP-k (ABI), és 30 pmol mindegyik primerből. Termocikiusos feltételek a következők voltak: 94 ° C-on 2 percig, 40 ciklus 94 ° C-on 30 másodpercig, 55 ° C-on 30 másodpercig és 72 ° C 1 perc, 72 ° C-on 10 percig. Figyelemmel kíséri fragmentum szennyeződés, minden futtatás tartalmazott egy "no sablon" kontroll, amelyben nukleáz-mentes vízzel helyettesítettük templateTable 1 biszulfittal átalakított gén-specifikus PCR primer szekvenciák katalógusa ICAM1 katalógusa
Forward Matton 5'-TGG GGG TTG TGG TTT TAG TT-3 'katalógusa
Fordított katalógusa 5'-CTC CCT CCA CTA AAA AC-3' katalógusa Amplicon méret
412 bp katalógusa CDKN2A (p16) hotelben Előre katalógusa 5'-AGA TGT TTT GTG GTT GTT GTG A-3 "
Fordított katalógusa 5'-CAA AAA TCT TCC ATT CTT CAA AC -3 'katalógusa fragmentum méret katalógusa 418 bp katalógusa ID4
Előre katalógusa 5'-TTT TTT GGG TAT ATA TTA GTT TGG-3'
Fordított katalógusa 5'-TAT CCT AAT CAC TCC CTT C-3 'katalógusa fragmentum méret katalógusa 477 bp katalógusa COX2
Előre katalógusa 5'-TAT GTG TTG TAT ATA GAG TAG-3'
Fordított katalógusa 5'-AAA AAA TAA TCC CCA CTC TC -3 'katalógusa fragmentum méret katalógusa 399 bp katalógusa TFF1 katalógusa Előre
5'-TTA GGT TGG AGT GTA GTA GG-3' katalógusa Fordított
5'-CCT ACT CAT ATC TAA AAA ACC C-3 '
fragmentum méret
489 bp
C8orf4 kontroll
Forward
5'-GAA TTA AAA TAT AAG GAG AGT TTT-3 '
Fordított
5'-AAC ATT ACC CAA ACA TAA AAC AA-3'
fragmentum méret
328 bp
szekvenálást végeztünk amplikonok biszulfit-kezelt sablonok azonosítani a metilált és metilálatlan CpGs vagy anélkül 5aza kezelést. Először is, minden PCR-terméket pGEM-T-vektorba a pGEM-T Easy vektor rendszer II (Promega), és átalakult JM109 nagy hatásfokú kompetens sejtek. Fehér telepeket inszerteket tartalmazó választottak ki, és egy éjszakán át tenyésztettük, és a plazmid DNS-t extraháljuk a QIAprep Spin Miniprep kit (Qiagen). Szekvenálás végeztük ABI 3100 Genetic Analyzer az ABI PRISM ™ BigDye ™ Version 1.1 Terminator Cycle Ready Reaction Kit AmpliTaq DNS polimeráz és M13R3 alapozó. Az eredményeket letöltött Sequencher szoftver (gén kódolja, Ann Arbor, MI), hogy a fordított bók minden sorozatra, és mind előre és hátra szekvenciák illesztését és elemezték megkülönböztetni metilálatlanok citozineket metiiezett citozineket.
Western blot az AGS sejtvonal
Mivel fennáll a lehetősége a COX2-gátló terápia leküzdeni COX2 hatását, az RNS-alapú eredménye COX2 választottunk követéses vizsgálatban a fehérje-szinten. Az összefolyó AGS sejtek vagy anélkül EBV gyűjtöttünk 0,25% tripszin, kétszer mossuk foszfáttal pufferolt sóoldattal, majd centrifugálással üledékbe visszük. A sejteket újra szuszpendáljuk 500 ul NP-40-sejt-lízis pufferben (50 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI, 1% NP-40, pH = 8,0), jégen inkubáljuk 30 percen át, és centrifugáltuk 12.000 rpm-en, 15 percig 4 ° C-on. Alikvotjait lizátum (50, 100, 150 ug protein mérőhelyenként) megoldódott SDS-PAGE-on trisz-glicin 4-20% gradiens gélen (Invitrogen), és átvittük nitrocellulóz membránra. COX2 detektáltuk 1: 5000 hígításban a monoklonális antitesttel, majd egy 1: 10000 hígítású szekunder antitesttel, alkalikus foszfatázzal konjugált (Amersham Biosciences), és megjelenítési egy Typhoon Phosphorlmager (Molecular Dynamics). Sávban mért sűrűséget félkvantitatíven normált béta aktin (ACTB) hasonlították között fertőzött és nem fertőzött sejtek AGS. Katalógusa Eredmények katalógusa EBV fertőzés AGS gyomorkarcinóma sejtek
sikeres EBV fertőzés AGS gyomorrák sejtek megerősítették használva hat Q-PCR-vizsgálatokhoz célzási eltérő szegmenseit az EBV genom. EBER
in situ
hibridizáció nem mutatott EBER
expresszió a szülői "EBV-negatív" AGS sejtek, míg a nagyobb, mint 90% -a AGS-B95-HygB sejteket EBER
-pozitív és azt aktiválva -appearing nukleáris morfológia (1. ábra). A proliferációs ráta növekedett, amint azt torkolatánál tenyésztett AGS-B95-HygB sejtek három nappal megelőzően szülői AGS sejteket. A fertőzés fennálló legalább 4 hónap, amint azt GFP és EBER katalógusa hisztokémiai foltokat. EBV látens (LMP1 és LMP2A) és litikus (BZLF1 és BMRF1) fehérjéket nem kifejezett fertőzött AGS sejtekben, míg ~ 10% -a fertőzött sejtek kifejezett LMP1, a sejtek fele fejezte LMP2A, és ~ 35% fejezte BMRF1 és BZLF1 fehérjék ami aktív virális replikáció (1. ábra). 1. ábra AGS-B95-HygB sejtek kifejezni látens és litikus virális géneket. A) immunhisztokémiai festés GFP sugallja higromicin kezelt AGS sejteket egyenletesen fertőzött géntechnológiai B95.8 EBV genom. B) EBER in situ
hibridizáció azt jelzi, latens fertőzés > 90% sejteket. Nukleáris EBER katalógusa festéssel megkíméli a nucleolusok és kibővített nucleolusok egy marker celluláris aktiválást. Látens virális fehérjék LMP1 (C) és LMP2 (D) fejeztük fokálisan. Litikus virális fehérjék, BMRF1 (E) és BZLF1 (F), fejeztük egy jelentős hányada AGS-B95-HygB sejteket. (GFP és BMRF1 foltok, 800x, LMP1, LMP2, EBER katalógusa és BZLF1 foltok, 1200x) hotelben Cellular Gene Expression különbségek EBV-pozitív versus EBV-negatív AGS Cells katalógusa expressziós szintjét 96 celluláris gének elemeztük AGS és AGS-B95-HygB sejtekben alacsony sűrűségű csip analízis kemilumineszcens detektálással (2. ábra). Normalizálás után GAPDH katalógusa, páros összehasonlítása alapján génexpressziós szinten az EBV-pozitív és EBV-negatív AGS sejtek kiderült, hogy a 96 gén a microarray, 43. számú megbomlik legalább két-szeresére EBV fertőzés. Meglepő módon, egy EBV-vel összefüggő expresszió fokozódása volt megfigyelhető csak 6 gén (IGFBP3 katalógusa, GADD45, IRF1, GRP78 /HSPB1, GLUT1 /SLC2A1, TMEPAI
), míg a csökkent expressziója volt megfigyelhető, a fennmaradó 37 szabályozatlan gének (ABCB1, BCL2L1, BIRC2, BMP2, CDKN2A, DUSP1, HIF1A, ICAM-1, ID2 NFKB1, COX2, TFRC, VCAM1, WISP1, TRIM25, IL2, BMP4, MDM2, CCND1, CDK2, BAX, p57, p19, CSN2, CXCL9 , IL-4, június, KLK3, LTA, MMP7, PPARg, TNFRSF10B, WIG1, WNT2, PTCH2 katalógusa). 2. ábra A génexpressziós mintázatok megváltoznak az EBV fertőzés AGS sejteket. Biotin-jelzett cDNS próbákkal elrendezve négy párhuzamos egy nylon membránon hibridizálnak izolált RNS AGS és AGS-B95-HygB sejteket. Kemilumineszcens jelek mutatják szabályozási zavarának kiválasztott gének közül 96 a tömb, mint a kontroll gének az utolsó két sorban.
SYBR Green rtPCR használták, hogy ellenőrizze a mikroarray megállapítások 26. hibásan szabályozott gének és 12 további géneket, amelyben nincs jelentős változás volt megfigyelhető a microarray. Nagyobb, mint két-szeres módosulása mRNS szintje a fertőzött versus
fertőzetlen sejtekben találtunk 16/26 gén (2. táblázat). A gének legerősebben érintett volt IGFBP3 katalógusa, amelyet túlszabályozott 42-szeres, és COX2, BMP4, és ICAM-1 katalógusa amelyek downregulált által 35-, 32-, és 22-szeres volt. A fennmaradó tíz microarray-alapú elváltozások nem voltak megerősítette rtPCR, ami arra utal, hogy az EBV kapcsolatos szabályozási zavarának ezen tényezők alacsonyabb volt, mint a két-szeres. Az egyik esetben volt egy jelentős eltérés: expressziós szintjét BCL2L1 katalógusa által microarray elemzés azt mutatta, egy két-szeres csökkenést
a fertőzött sejtekben, míg rtPCR többször mutatott ötszörös növekedés
BCL2L1
mRNS szintek a fertőzött sejtekben. Kevésbé drámai eltérések voltak, amikor egy további 12 gén analizáltuk rtPCR, jelentős (> 2-szeres) megállapított változások a kifejezés a 5/12 gének, amelyekre nem megváltoztatás volt megfigyelhető a microarray (2. táblázat) .table 2 gének megbomlik EBV-pozitív AGS Cells katalógusa Gene Név Matton Gene Symbol Matton Fold Change * Matton játszó gének katalógusa alap leucin-cipzár transzkripciós faktor ATF-szerű katalógusa BATF Matton -38 katalógusa ciklooxigenáz-2

• Kimutatása promoter hipermetiláció CpG sziget E-cadherin a gyomor szív adenocarcinoma
• Változások a lipid profilok után radikális gastrectomián betegeknél gyomor cancer