-Virus específica de metilación de genes humanos en células de cáncer gástrico Epstein-Barr

Epstein-Barr virus-metilación específica de genes humanos en células de cáncer gástrico
Abstract
Antecedentes
Virus Epstein-Barr (EBV) se encuentra en 10% de todos los adenocarcinomas gástricos pero su papel en el desarrollo de tumores y restos de mantenimiento poco claro. El objetivo de este estudio fue examinar la desregulación EBV mediada por factores celulares implicados en la carcinogénesis gástrica.
Métodos
los patrones de expresión génica se examinaron en las células epiteliales gástricas AGS EBV positivo utilizando un microarray de baja densidad VEB-negativo y, PCR de transcripción inversa, tinciones histoquímicas, y secuenciación de ADN específica de metilación. La expresión de PTGS2 (COX2) se midió en células AGS y en los tejidos de adenocarcinoma gástrico primario.
En: Resultados de la gama estudios, casi la mitad de los 96 genes humanos probados, lo que representa 15 diferentes vías de transducción de señales relacionadas con el cáncer, se desregula después de la infección por VEB. La transcripción inversa PCR confirmó impacto significativo sobre los factores que tienen diversas funciones, tales como la regulación del ciclo celular (IGFBP3
, CDKN2A, CCND1, HSP70, ID2, ID4)
, la reparación del ADN (BRCA1, TFF1
), la adhesión celular ( ICAM1
), inflamación (COX2
), y la angiogénesis (HIF1A
). La desmetilación usando 5-aza-2 'desoxicitidina invirtió la desregulación EBV mediada por los 11 genes enumerados aquí. Para algunas secuencias promotoras, la isla CpG metilación y desmetilación se produjeron en un patrón de VEB específicos como se muestra mediante secuenciación de ADN con bisulfito. La inmunohistoquímica fue menos sensible que era western blot para detectar la regulación a la baja de la COX2 a la infección por VEB. desregulación relacionada con el virus de los niveles de COX2 in vitro
no se recapitulan en vivo Estar entre cáncer gástrico tejidos infectados de forma natural.
Conclusiones
EBV altera la expresión de genes humanos en formas que podrían contribuir a la biopatología única de virus -asociado cáncer. Por otra parte, la frecuencia y la reversibilidad de las alteraciones de la transcripción relacionados con la metilación sugieren que los agentes demethylating tienen potencial terapéutico para el manejo de carcinoma relacionados con el VEB.
Antecedentes
El cáncer gástrico es el cuarto tipo de cáncer más común y la segunda causa principal de cáncer muerte en el mundo [1]. Una variedad de alteraciones genéticas, así como los agentes ambientales infecciosas y otros parecen ser factores en la carcinogénesis gástrica. virus de Epstein-Barr (EBV), un herpesvirus gamma de doble cadena de ADN, se encuentra dentro de las células malignas en 10% de los adenocarcinomas gástricos, y la infección parece preceder la transformación maligna [2]. observaciones básicas y clínicas sugieren que los cánceres gástricos asociados a EBV tienen un patobiología diferentes a los cánceres gástricos EBV negativo [3-8]. Diseño racional de la terapia dirigida virus-requiere una mejor comprensión del papel patogénico de EBV en la carcinogénesis gástrica.
Estudios anteriores han demostrado la pérdida de tres productos de gen supresor de tumor críticos, CDH1 (E-cadherina), p73, y CDKN2A (p16 ), en los cánceres gástricos infectadas con EBV [9-18]. Virus asociada a la metilación de estos genes, junto con la evidencia de la metilación del ADN global en los cánceres de EBV positivo, sugiere que los cánceres gástricos relacionados con EBV son un subconjunto de la isla CpG methylator fenotipo (CIMP) tipos de cáncer [4, 11, 19-26]. Un mediador potencial es ADN metiltransferasa 1 (DNMT1) Windows que está regulada al alza en los cánceres gástricos infectados de forma natural y puede ayudar a establecer los patrones de metilación propagadas a las células hijas tras la división celular [21, 27-29]. Los estudios en curso están dirigidos a la comprensión del papel de la infección por VEB y el Helicobacter pylori en la causa de la inflamación y la hipermetilación global asociado durante el desarrollo de cáncer gástrico [22]. Hoteles en modelos de línea celular, DNMT1 sobreexpresión está mediada por VEB LMP1 y LMP2 [21, 28 -31]. EBV parece emplear mecanismos epigenéticos para controlar el transcriptoma de acogida y también para controlar la expresión de sus propios genes codificados viralmente [11, 12, 14, 15, 19, 21, 24, 29, 32, 33]. Tras la infección inicial de una célula, el genoma viral no metilado puede someterse a la replicación viral con la nueva producción del virión, mientras que un subconjunto de las células infectadas adquirir un genoma viral altamente metilada que silencia la expresión de proteínas extrañas y media la persistencia viral a largo plazo por medio de la infección latente [23, 34]. tumores infectados tienden a tener ADN EBV altamente metilado, y el silenciamiento relacionados con la metilación de genes virales ayuda a explicar cómo los tumores infectada evadir la destrucción inmunitaria.
Mientras metilación de promotores de genes se asocia típicamente con la regulación negativa de la transcripción
a través de la unión selectiva de proteínas represoras , la primera proteína vez demostrado que se unen y activar
un promotor metilado era EBV BZLF1, el factor clave que controla el cambio de latente a las formas replicativas de infección viral [35]. Parece ser que el virus ha evolucionado hábilmente un medio para superar la metilación del promotor a su favor [34, 35]. estrategias antivirales están siendo exploradas por su potencial antineoplásico. Curiosamente, los agentes antivirales utilizados más comúnmente, aciclovir y ganciclovir, son eficaces en el cierre de la replicación viral, pero no eliminan la expresión de los genes virales latentes líticas y principios tales como LMP1, LMP2 y BZLF1.
Las implicaciones clínicas de EBV metilación del genoma relacionadas con el cáncer gástrico son inmensas. En primer lugar, la evidencia emergente muestra el potencial para mejorar el diagnóstico de cáncer gástrico mediante pruebas de lavados gástricos de los patrones de metilación específicos de cáncer, tal vez en concierto con las pruebas de VEB para identificar el subgrupo infectado con virus de cáncer [36-40]. Diferentes patrones de metilación del promotor de virus-positivas en comparación con las células del virus-negativo [11, 21, 24] hacen hincapié en la necesidad de caracterizar los patrones de metilación de una manera que que maximiza la sensibilidad del ensayo para la detección de cáncer. Tanto la infección y la metilación del ADN alterado parecen ser los primeros eventos en la carcinogénesis [2, 41], la detección potencialmente facilitar de las lesiones precancerosas en el jugo de estómago.
Una segunda implicación clínica es el potencial para mejorar el tratamiento de cáncer de consumir drogas gástricos que revierten la efecto de la hipermetilación del promotor [42, 43]. En particular, los agentes, demethylating que inhiben la ADN metiltransferasa y revertir supresor tumoral silenciamiento génico o activación de oncogenes son posibles estrategias antineoplásicos [43]. Hay que prestar atención a las posibles diferencias en el efecto de los agentes de desmetilación en el virus-positiva frente a los tumores con virus negativo
[43-45]. Nosotros y otros han demostrado que los cánceres gástricos infectadas de forma natural tienen menor CDKN2A (p16) la expresión [14, 15]. En un ensayo clínico de fluorouracilo (5-FU) para el cáncer gástrico, CDKN2A
estado de metilación fue un predictor independiente de supervivencia [46]. La justificación del uso de agentes de desmetilación como 5-aza-2'- desoxicitidina en los ensayos clínicos se basa en evidencia científica de que la terapia desmetilación modifica las propiedades tumorigénicas de las células cancerosas.
Varios investigadores tienen líneas de células epiteliales infectadas con éxito con EBV en

vitro [47, 48]. En el estudio actual, células de cáncer gástrico AGS EBV negativo VEB-positivo y se examinaron las diferencias en los patrones de expresión de genes usando el análisis de microarrays de baja densidad y la inversa de la reacción en cadena de polimerasa de transcripción (rtPCR). AGS es una línea celular que se cultiva a partir de tejido originalmente adenocarcinoma gástrico y ahora se utiliza ampliamente como un modelo de cáncer gástrico. El papel de la metilación del ADN en la mediación de efectos seleccionados se examinó por secuenciación del ADN con bisulfito y ensayando la capacidad de un agente de desmetilación para neutralizar el efecto de EBV en el silenciamiento de genes. Los resultados revelaron una amplia desregulación de genes a la infección por VEB en las células AGS con evidencia de que la metilación del promotor es responsable, al menos en parte. Reversión de los efectos de la transcripción asociados a virus sugiere que los agentes demethylating deben explorarse por su potencial para controlar el crecimiento de tumores malignos relacionados con el VEB.
Métodos
líneas celulares de cáncer gástrico
La línea celular de cáncer gástrico AGS (ATCC CRL- 1739) se cultivó en Dulbecco medio de Eagle modificado que contenía suero bovino fetal al 10% (durante 20 minutos a 65 ° C) y 1% de penicilina-estreptomicina inactivado por calor (10.000 unidades de penicilina, 10.000 g /ml de estreptomicina, Gibco, Carlsbad, CA) . Las células fueron infectadas con una cepa recombinante VEB (un regalo del doctor Henri J. Delecluse) [33, 49, 50] que fue diseñado para expresar la proteína verde fluorescente (GFP) y la resistencia a la higromicina B mediante la clonación de estos genes en el prototipo B95 0.8 cepa del VEB en la segunda copia del oriLyt reside normalmente. Antes de la infección, las células AGS se transfectaron con 1 g de un vector de expresión que codifica CD21 (el receptor de EBV) y un gen de resistencia a puromicina usando Fugene 6 (Roche, Indianapolis, IN) como se describe anteriormente [51]. A las 48 horas después de la transfección, se seleccionaron positivamente las células que contienen CD21 para el uso de 0,5 g /ml de puromicina-HCl (Roche). stocks virales de EBV recombinante se generaron en células 293 de riñón, una línea de células epiteliales embrionarias humanas, mediante la inducción de la replicación lítica usando 20 ng /ml de forbol 12-tetradecanoato 13-acetato y butirato de 3 mM. Los sobrenadantes se recogieron 3 días después de la inducción, se filtraron (0,8 M), y se congelaron a -80 ° C hasta su uso. células AGS resistentes a la puromicina se sembraron a 50% de densidad completa en placas de cultivo de tejidos de 60 mm y co-incubaron con 1 ml de viriones de valores. Cuatro días después, las células AGS infectadas con EBV (ahora llamados AGS-B95-HygB) se seleccionaron positivamente con 100 mg /ml de higromicina B (Roche).
Huella de ADN confirmó que las células AGS utilizados en este estudio correspondía con el genotipo de células AGS en la American Type Culture Collection. Fingerprinting se realizó utilizando el PowerPlex 1,2 STR kit (Promega), seguido de electroforesis en un ABI 310 capilar instrumento de electroforesis en gel (Applied Biosystems). Expresión génica por
histoquímicos Stains
bloques de parafina se preparó a partir de AGS y AGS-B95- hygB líneas celulares, y los bloques de parafina de adenocarcinoma gástrico primario fueron recuperados de los archivos clínicos. Las muestras clínicas residuales representan todos los cánceres gástricos EBV positivos disponibles (n = 9) y una selección aleatoria de los cánceres gástricos EBV negativo (n = 9). Las tinciones histoquímicas se aplicaron a secciones de parafina para confirmar la infección y para evaluar la expresión génica. Para preparar los bloques, las células cultivadas se aclararon por primera vez en fosfato salino de Dulbecco tamponada (Gibco, Invitrogen), cosechadas con 0,25% de tripsina (Gibco, Invitrogen), enredados en un coágulo utilizando Dade Ci-Trol Control de Coagulación (Citrato) -Nivel 1 (Dade Behring, Marburg, Alemania) y trombina 200 (Pacific Hemostasis, Middletown, VA), fijado en formalina al 10%, embebidos en parafina y se seccionó en portaobjetos recubiertos.
EBER
in situ La hibridación se realizó
utilizando EBER
sonda marcada con fluoresceína y una sonda de oligo (d) de control T en un punto de referencia in situ
sistema de hibridación (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ). Las tinciones inmunohistoquímicas para las proteínas de EBV LMP1 y LMP2 se realizaron como se describe anteriormente [52] utilizando la recuperación de citrato de antígeno y el cóctel CS1-4 de anticuerpos monoclonales de ratón contra LMP1 (1: 100, Dako, capinteria, CA) y el anticuerpo monoclonal de rata contra E411 LMP2 (1 mg /ml, Asencion, Munich, Alemania). Las secciones en parafina de linfoma de Hodgkin relacionado con EBV y el trastorno linfoproliferativo postrasplante sirvieron como controles positivos
El análisis inmunohistoquímico de las proteínas de replicación del EBV BMRF1 y BZLF1 se realizó utilizando E31-G3 anti-BMRF1 clon (1:. 200 dilución, Research Diagnostics , Inc., Flanders, NJ) y anti-BZLF1 BZ.1 clon (dilución 1:25 Dako, Carpinteria, CA), mientras que PTGS2 humana (coloquialmente denominada ciclooxigenasa-2, COX2) se ensayó usando el anticuerpo monoclonal anti-COX2 ( dilución 1: 200, Cayman Chemical). Las secciones se incubaron con el anticuerpo primario durante 30 minutos a 37 ° C para los objetivos de EBV, o a 4 ° C durante la noche para COX2, utilizando los protocolos de bloqueo y de detección en el Kit de Super-Sensitive no biotina HRP detección (Biogenex). El anticuerpo unido se detectó usando el cromógeno diaminobencidina (Biogenex) y las células se contratiñeron con hematoxilina (Dako). Secciones de parafina de leucoplasia vellosa oral sirvieron como control positivo para EBV lítico, mientras que las amígdalas reactivo y tejidos de carcinoma nasofaríngeo sirvieron como controles para las manchas de COX2. Los resultados se interpretaron por puntuación microscópica de células malignas en ≥ 10 campos a un aumento de 400x produciendo una puntuación media proporción (0 = ninguno, 1 = < 1%, 2 = 1-10%, 3 = 10 a 33%, 4 = 33 -66%, 5 = > 66% de las células) y la puntuación de intensidad (0 = ninguno, 1 = débil, 2 = intermedio, 3 = fuerte tinción). Las puntuaciones totales fueron comparados en EBV positivo frente
tumores negativos utilizando una prueba t no pareada de Mann-Whitney.
Detección del genoma del VEB
Una batería de ensayos de PCR cuantitativa en tiempo real (Q-PCR) de orientación de seis dispares regiones del genoma EBV se utilizó para demostrar que la infección viral de las células AGS fue exitosa. Los productos amplificados se detectaron a través de ABI Prism 7500 instrumento de PCR en tiempo real con el software de sistema de detección de secuencias (Applied Biosystems) como se ha descrito anteriormente utilizando cebadores dirigidos a la BamH1W
, EBNA1
, LMP1, LMP2

, y BZLF1
regiones del genoma EBV [52] o EBER1
DNA [53]. Para comprobar la contaminación de amplificación, cada carrera contenía al menos dos controles "sin plantilla" en la que H2O libre de nucleasa fue sustituido por plantilla.
Baja densidad de cDNA análisis de microarrays
RNA fue aislado de AGS y AGS-B95- células hygB utilizando el Kit RNeasy RNA Mini (Qiagen) después de la primera usando la columna de centrifugación QIAshredder ™ (Qiagen) para lisar las células. Después de confirmar la integridad del ARN mediante un Bioanalyzer Agilent, el análisis de microarrays de expresión se realizó por SABiosciences Corporation (Frederick, MD) utilizando su GEArray Q Serie Humano transducción de señales en gen del cáncer de matriz. Este microarrays de baja densidad consiste en 96 sondas que ponen a prueba la activación de las vías de transducción de señal 15 que participan en la oncogénesis. (objetivo transcripciones se enumeran en los resultados.) cDNA marcados con biotina preparados a partir de 10 g de cada muestra de ARN utilizando el método de AmpoLabeling-LPR (SABiosciences) se hibridó a la matriz, y detección quimioluminiscente se llevó a cabo utilizando una cámara CCD. valores de intensidad primas integradas para cada punto fueron generados por el software GEArray Analysis Suite (SABiosciences), y su posterior análisis y la normalización se realizó utilizando Microsoft Excel. El valor de intensidad punto más bajo en cada matriz se considera que es de fondo y se restó de cada valor de intensidad prima para cada sonda, y luego las intensidades de terreno se normalizaron a la del gen de mantenimiento, glyceraldehydephosphate deshidrogenasa (GAPDH
). Una comparación del par de niveles de expresión génica se realizó entre las células EBV positivo (AGS-B95-hygB) y células AGS con EBV negativa de los padres. Si la relación era ≥2 o ≤0.5, se consideró el gen que se upregulated o downregulated en las células infectadas.
SYBR Green semicuantitativo rtPCR
Para confirmar microarrays seleccionado resultados de la expresión de genes, rtPCR se realizó mediante Real-Time RT 2 cebadores de PCR específicos de genes (SABiosciences). El Kit ™ ReactionReady Primera Strand cDNA Synthesis (SABiosciences) se utilizó para convertir 3 g de ARN a ADNc, y el ADNc se diluyó 1:10 antes del análisis PCR. Los siguientes 38 ADNc fueron blanco: GAPDH, A2M, ABCB1, Bcl2l1, BIRC1, BIRC2, BIRC3, EN1, GADD45, HIF1A, ID2, IGFBP3, BRCA1, TMEPAI, IRF1, BCL2, BMP4, CDKN2A (p16), FN1, HK1, ICAM1, IL2, CCND1, MDM2, COX2 (PTGS2), TFRC, WISP1, TRAF1, CDK2, VCAM1, CDKN2C (p18), CDKN1A (p21), dusp1, HSP70, NFKB1, TNFSF10, TRIM25
, y FOSL1
. Las reacciones se realizaron en un volumen total de 25 l que contenía 1X TaqMan ® universal Mix (ABI), RT 2 mix conjunto de cebadores de genes específicos (10 mM de cada cebador, SABiosciences), 2,5 solución verde l 5X SYBR ( molecular Probes, Eugene, OR), y 5 l de cDNA plantilla. condiciones de termociclado fueron: 50 ° C durante 2 minutos, 95 ° C durante 10 minutos, y 40 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos y 60 ° C durante 1 minuto en un instrumento ABI 7500 con software de sistema de detección de secuencias (Applied Biosystems). El mismo umbral se utilizó para cada gen y la placa evaluado por el protocolo "cuantificación relativa Plate". Cada reacción de PCR se realizó por triplicado para cada muestra en dos placas separadas de 96 pocillos, y los resultados se promediaron para determinar diferencias relativas en el nivel de expresión de cada gen en el EBV positivo frente
línea celular EBV-negativas.
Minor surco de unión de la sonda semicuantitativo rtPCR
Para evaluar la expresión de cinco genes seleccionados que no estaban en el microarray se ha descrito anteriormente, los ensayos de RT-PCR semi-cuantitativos se realizaron (ensayos-on Demand, Applied Biosystems), utilizando sondas de unión al surco menor orientación de transcripción helicasa-como los factores (HLTF
), factor-1 de trébol (TFF1
), cremallera factor de transcripción ATF-como-leucina básica (BATF
), inhibidor de la proteína de unión a ADN-4 (ID4
), y nucleostemin (NU
). Estos cinco fueron seleccionadas porque son los informes, dysregulated en una proporción sustancial de los adenocarcinomas gástricos o cánceres relacionados con el VEB [32, 54-59]. GAPDH
sirvió como control endógeno para fines de cuantificación relativa. El ARN se convirtió en ADNc utilizando la alta capacidad de cDNA Archivo Kit (Applied Biosystems), y el ADNc se diluyó 1:10 con agua libre de nucleasa. Cada reacción de PCR contenía 50 l: 1X TaqMan ® Universal Master Mix, ensayo de Expresión del Gen Objetivo 1X o GAPDH
mezcla control endógeno, y 10 l de cDNA. Para comprobar la contaminación de amplificación, cada expresión de ensayo en cada placa contenía al menos dos controles "sin plantilla" en el que fue sustituido agua libre de nucleasa para la plantilla. condiciones y análisis de datos de termociclado fueron como se describe anteriormente para la.
tratamiento y secuenciación de ADN modificado con bisulfito
Para estudiar el efecto de desmetilación desmetilación SYBR Green rtPCR, los AGS y líneas celulares de cáncer gástrico AGS-B95-hygB eran crecido a 75% de confluencia y luego durante tres días consecutivos 1 M de fresco 5-aza-2 'desoxicitidina (5Aza; Sigma) se añaden diariamente. En el cuarto día, ARN y el ADN se recogieron a partir de cultivos tratados y no tratados. ARN se evaluó para los niveles de expresión de genes, y el ADN se examinó para la metilación después de tratamiento con bisulfito de sodio (EZ metilación del ADN Kit, Zymo Research, Orange, CA) para convertir las citosinas no metiladas en uracilo, mientras se mantiene sin cambios citosinas metiladas [60]. El control positivo era el ADN metilado universal CpGenome (Chemicon) sometido a la misma conversión de bisulfito, y cebadores de control dirigidas a la C8orf4
promotor del gen celular confirmó el éxito de conversión de bisulfito de cada muestra de ADN [61]. islas CpG se identificaron utilizando CpG Parcela en cada uno de los cinco humana ICAM1 genes-- gratis (RefSeq # NM_00201), CDKN2A (p16) gratis (RefSeq # NM_000077.3), ID4 gratis (RefSeq NM_001546 #), COX2 gratis (RefSeq # NM_000963), y TFF1 gratis (RefSeq.225,2) - para el que se han descargado las secuencias de promotor (3000 pares de bases aguas arriba del sitio de inicio de transcripción a través de exón 1) a partir de GenBank. Se utilizaron los siguientes parámetros para la identificación de islas CpG: longitud mínima de 200 pb, el porcentaje promedio mínimo de C + G de 50%, y la relación media mínima de al observado esperado C + G de 0,6 [62]. Para identificar CpG regiones densas de COX2 Opiniones y TFF1
, el parámetro de longitud mínima se redujo a 50 pb [61]. Las secuencias de cebadores se muestran en la Tabla 1. Cada 50 l de reacción de PCR contenía: 1X tampón PCR, MgCl 2 mM 2, 1 unidad de Taq ADN polimerasa Platinum (Invitrogen, Carlsbad CA), 0,2 mM dNTPs (ABI), y 30 pmol de cada cebador. condiciones de termociclado fueron: 94 ° C durante 2 minutos, 40 ciclos de 94 ° C durante 30 segundos, 55 ° C durante 30 segundos, y 72 ° C durante 1 minuto, 72 ° C durante 10 minutos. Para controlar la contaminación por amplicones, cada carrera contenía un control "sin plantilla" en la que se sustituyó el agua libre de nucleasa para templateTable 1 bisulfito Modificada de genes específicos de PCR Primer secuencias
ICAM1

Reenviar
5'-TGG TTG GGG TGG TTT TAG TT-3 '
Invertir
5'-CTC CCT CCA CTA AAA AC-3' El tamaño del amplicón

412 pb
CDKN2A (p16): perfil Delantero
5'-AGA TGT TTT GTG GTG GTT GTT A-3 '
inversa
5'-CAA AAA TCT TCC ATT CTT CAA AC -3 '
amplicón tamaño
418 pb
ID4
Delantero
5'-TTT TTT TAT ATA GGG TTA GTT TGG-3'
inversa
5 'TAT CCT AAT TCC CAC CTT C-3 'El tamaño del amplicón

477 pb
COX2
Delantero
5' TAT TAT GTG TTG GAG ATA TAG A-3 '
Invertir
5'-AAA AAA TAA TCC CCA CTC TC -3 'El tamaño del amplicón

399 pb
TFF1
Delantero
5'-TTA GGT TGG AGT GTA GTA GG-3'

revertir 5'-CCT ACT CAT ATC TAA AAA ACC C-3 '
amplicón tamaño
489 pb
de control C8orf4
Delantero
5'-GAA TTA AAA TAT AAG GAG AGT TTT-3 '
Reverse
5'-AAC AAC AAC ATT CAC ACA TAA AA-3' el tamaño del amplicón

328 pb
La secuenciación se realizó en amplicones de plantillas tratado con bisulfito para identificar los CpG metilados y no metilados con o sin 5Aza tratamiento. En primer lugar, cada producto de PCR se clonó en el vector pGEM-T utilizando el pGEM-T Easy Vector System II (Promega) y se transformó en células competentes JM109 de alta eficiencia. Se seleccionaron las colonias blancas que contenían insertos y se cultivaron durante la noche, y el ADN plasmídico se extrajo utilizando el Kit QIAprep Spin Miniprep (Qiagen). La secuenciación se realizó en un ABI 3100 Genetic Analyzer utilizando el Terminator Cycle Listo Reacción Kit ABI PRISM BigDye ™ ™ versión 1.1 con AmpliTaq ADN polimerasa y un cebador M13R3. Los resultados se descargan en el software Sequencher (Gene Codes, Ann Arbor, MI) para obtener el complemento inverso de cada secuencia, y las dos secuencias de avance y retroceso fueron alineadas y analizadas para distinguir citosinas no metiladas de citosinas metiladas.
Western Blot en el AGS línea celular
Debido a la posibilidad de que la terapia con inhibidores de la COX2 para superar los efectos de la COX2, se eligieron los resultados basados ​​en ARN para COX2 para el estudio de seguimiento a nivel de proteína. células confluentes AGS con o sin EBV fueron cosechadas con 0,25% de tripsina, se lavaron dos veces en solución salina tamponada con fosfato, y se sedimentaron por centrifugación. Las células se resuspendieron en 500 ul de tampón de lisis-NP 40 celular (50 mM Tris-HCl, NaCl 150 mM, 1% NP-40, pH 8,0), se incubaron en hielo durante 30 minutos, y se centrifugó a 12.000 rpm durante 15 minutos a 4 DO. Partes alícuotas de lisado (en 50, 100, 150 ug de proteína por pocillo) se resolvieron mediante SDS-PAGE en un gel de gradiente de tris-glicina al 4-20% (Invitrogen) y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. COX2 se detectó con una dilución 1: 5000 del anticuerpo monoclonal siguió una dilución 1: 10.000 de anticuerpo secundario conjugado con fosfatasa alcalina (Amersham Biosciences), y la visualización con un Typhoon PhosphorImager (Molecular Dynamics). banda de densidad se mide de forma semicuantitativa y se normalizó para la beta actina (ACTB) se comparó entre las células infectadas y no infectadas AGS.
Resultados
EBV Infección de células AGS cáncer gástrico
infección por EBV con éxito de células de cáncer gástrico AGS se confirmó utilizando seis ensayos Q-PCR dirigidos a segmentos diferentes del genoma del VEB. EBER
in situ
la hibridación no mostraron EBER
expresión en las células de los padres AGS "EBV negativo", mientras que más del 90% de las células AGS-B95-hygB eran EBER
-positivo y había activado la morfología nuclear -que consta (figura 1). La tasa de proliferación se aumentó como se muestra por la confluencia de las células AGS-B95-hygB cultivadas tres días anteriores a las células AGS parentales. La infección persistió durante al menos 4 meses como se muestra por GFP y EBER
tinciones histoquímicas. proteínas de EBV latente (LMP1 y LMP2A) y líticas (BZLF1 y BMRF1) no se expresaron en células AGS no infectadas, mientras que ~ 10% de las células infectadas expresaba LMP1, la mitad de las células expresaron LMP2A, y ~ 35% expresaron proteínas BMRF1 y BZLF1 implican activo la replicación viral (Figura 1). Figura 1 células AGS-B95-hygB expresan los genes virales latentes como líticos. A) tinción inmunohistoquímica para GFP sugiere que las células AGS higromicina B-tratadas se infectan de manera uniforme por el genoma de EBV B95.8 ingeniería. B) EBER in situ
hibridación indica una infección latente en > 90% de las células. Nuclear EBER
tinción perdona los nucleolos, y nucleolos agrandados son un marcador de la activación celular. Latent proteínas LMP1 viral (C) y LMP2 (D) se expresaron de manera focal. proteínas virales líticas, BMRF1 (E) y BZLF1 (F), se expresaron en una fracción significativa de células AGS-B95-hygB. Se analizaron
celular de genes diferencias de expresión de EBV positivas frente a las células AGS con EBV negativo
niveles de expresión de 96 genes celulares; (LMP1, LMP2, EBER
y BZLF1 manchas, 1200x GFP y BMRF1 manchas, 800x) en células AGS y AGS-B95-hygB utilizando el análisis de microarrays de baja densidad con detección quimioluminiscente (Figura 2). Después de la normalización a GAPDH
, comparación del par de los niveles de expresión génica entre las células AGS EBV positivos y negativos EBV reveló que de los 96 genes en el microarray, 43 fueron mal regulada por lo menos dos veces después de la infección por VEB. Sorprendentemente, se observó un aumento asociado al EBV en la expresión de sólo 6 genes (IGFBP3
, GADD45, IRF1, GRP78 /HSPB1, GLUT1 /SLC2A1, TMEPAI
), mientras que se observó una disminución de expresión de los 37 genes restantes dysregulated (ABCB1, Bcl2l1, BIRC2, BMP2, CDKN2A, dusp1, HIF1A, ICAM1, ID2, NFKB1, COX2, TFRC, VCAM1, WISP1, TRIM25, IL2, BMP4, MDM2, CCND1, CDK2, BAX, p57, p19, CSN2, CXCL9 , IL-4, Jun, KLK3, LTA, MMP7, PPARg, TNFRSF10B, WIG1, WNT2, PTCH2
). Figura patrones de expresión de genes 2 son alterados por la infección por VEB de células AGS. sondas de ADNc marcadas con biotina dispuestos por cuadruplicado en una membrana de nylon se hibridan con ARN aislado de células AGS y AGS-B95-hygB. señales quimioluminiscentes indican la desregulación de los genes seleccionados entre los 96 en la matriz, en comparación con los genes de control en las dos últimas filas.
SYBR Green rtPCR fue utilizado para comprobar los resultados de microarrays para el 26 de los genes desregulados y por 12 genes adicionales en la cual no se observó cambio significativo en el microarray. Mayor que la alteración de dos veces en el nivel de ARNm en los infectados en relación
células no infectadas se encontraron resultados para 16/26 genes (Tabla 2). Los genes más fuertemente afectados fueron IGFBP3 Windows que se reguló por 42 veces, y COX2, BMP4, y ICAM1 Windows que se downregulated de 35-, 32-, y 22 veces, respectivamente. Los diez alteraciones basadas en microarrays restantes no fueron confirmados por rtPCR, lo que sugiere que la desregulación relacionados con EBV de estos factores fue menor de dos veces. En un caso, había una discrepancia importante: Los niveles de expresión de Bcl2l1 fotos: por el análisis de microarrays mostraron una disminución de dos veces
en las células infectadas, mientras que rtPCR mostró en repetidas ocasiones un aumento de cinco veces en
Bcl2l1
ARNm los niveles en las células infectadas. Se encontraron discrepancias menos dramáticos cuando un 12 genes adicionales se analizaron por rtPCR, con significativa (> 2 veces) cambios encontrados en la expresión de genes 5/12 para los que no se observó alteración en el microarray (Tabla 2) .Tabla 2 Los genes mal regulada en células AGS con EBV positivo
Gen
gene Symbol
doble cambio *
genes downregulated
factor de transcripción básica cremallera de leucina, ATF-como
BATF
-38
morfogenética ciclooxigenasa-2
COX2
-35
hueso proteína-4
BMP4
-32
molécula de adhesión intercelular-1

• La detección de hipermetilación de promotores de la isla CpG de E-cadherina en el adenocarcinoma gástrico cardiaco
• Cambios en los perfiles de lípidos después de la gastrectomía radical en pacientes con cambios cancer