Epstein-Barr virusas konkrečių metilinimas žmogaus genų skrandžio vėžio ląsteles

Epstein-Barr virusas konkrečių metilinimas žmogaus genų skrandžio vėžio ląstelių
tezės
Background pervežimas Epstein-Barr virusas (EBV) yra nustatyta 10% visų skrandžio adenokarcinomos, bet jos vaidmuo auglių vystymuisi ir palaikymas neaišku. Šio tyrimo tikslas buvo ištirti EBV tarpininkaujant reguliacijos sutrikimas mobiliųjų veiksnių padariusiems skrandžio kancerogenezėje.
Metodai
Genų ekspresijos modeliai buvo nagrinėjamas EBV-neigiamas ir EBV-teigiamas AGS skrandžio epitelinių ląstelių naudojant mažo tankio mikrogardeliq, atvirkštinės transkripcijos PGR, histocheminės dėmes ir metilinimas konkrečių DNR sekos. Išraiška PTGS2 (COX2) buvo matuojamas AGS ląstelių ir pirminių skrandžio adenokarcinoma audiniuose.
Rezultatai
išsirikiavo tyrimų, beveik pusė iš 96 tirtų žmogaus genų, atstovaujančių 15 skirtingų vėžio susijusių impulsų perdavimą, buvo dysregulated po EBV infekcija. Atvirkštinės transkripcijos PGR patvirtino didelę įtaką veiksniai, turintys skirtingas funkcijas, pavyzdžiui, ląstelių ciklo reguliavimo (IGFBP3 pervežimas, CDKN2A, CCND1, HSP70, ID2, ID4)
, DNR remontas (BRCA1, TFF1
), ląstelių sukibimą ( ICAM1
), uždegimas (COX2
) ir angiogenezę (HIF1A
). Demetilinimu naudojant 5-aza-2'-dezoksicitidino atstatomi EBV tarpininkaujant reguliacijos sutrikimas visiems 11 čia išvardytų genuose. Kai promotoriaus sekos, CpG salos metilinimas ir demetilinimas iu EBV-specifinis modelis, kaip parodyta pagal bisulfito DNR sekos. Imunohistocheminis buvo mažiau jautrūs nei buvo Vakarų dėmė aptikti downregulation iš COX2 nuo EBV infekcija. Virusas susijusių reguliacijos sutrikimas ir COX2 lygių in vitro
nebuvo kartojami in vivo
tarp natūraliai infekuotų skrandžio vėžio audiniuose.
Išvadas
EBV keičia žmogaus genų ekspresiją tokiais būdais, kurie galėtų prisidėti prie unikalaus Patobiologijos viruso -associated vėžys. Be to, dažnumas ir reversability nuo metilinimo susijusių transkripcijos pokyčių rodo, kad demetilinimą agentai turi gydomąjį potencialą valdyti EBV susijusių karcinoma.
Faktai
Skrandžio vėžys yra ketvirtas labiausiai paplitęs tipas vėžio ir antroji pagrindinė priežastis, dėl vėžio mirtis visame pasaulyje [1]. Genetinių pakitimų, taip pat infekcinių ir kitų aplinkos veiksnių rodomi įvairūs faktoriais, esantys skrandžio kancerogenezės. Epstein-Barr viruso (EBV), dvigrandė DNR gammaherpesvirus, randamas per piktybinių ląstelių 10% skrandžio adenokarcinomos, ir infekcija atrodo, kad prieš piktybinę transformaciją [2]. Pagrindiniai ir klinikiniai stebėjimai rodo, kad EBV susijusių skrandžio vėžio turėti skirtingą Patobiologijos nuo EBV-neigiamas skrandžio vėžio [3-8]. Racionalus dizainas viruso nukreiptas terapija reikalauja geriau suprasti patogeniškumo vaidmenį EBV skrandžio kancerogenezėje.
Išankstiniai tyrimai parodė nuostolį tris kritines navikas slopintuvas genų produktų, CDH1 (E-cad), P73, ir CDKN2A (16 psl ), ir EBV užsikrėtę skrandžio vėžio [9-18]. Virusas susijęs metilinimas šių genų, kartu su įrodymais pasaulio DNR metilinimo į EBV-teigiamas vėžio, teigia, kad EBV susijusių skrandžio vėžio yra CpG sala methylator fenotipas (CIMP) vėžio [4, 11, 19-26] poaibis. Galimas tarpininkas yra DNR metiltransferazė 1 (DNMT1)
kad yra aktyvinama natūraliai infekuotų skrandžio vėžio ir gali padėti nustatyti metilinimas modelius padaugintus į dukterinių ląstelių nuo ląstelių dalijimosi [21, 27-29]. Vykdomi tyrimai siekiama suprasti Baro ir Helicobacter pylori infekcijos vaidmenį sukelia uždegimą ir susiję pasaulinį hypermethylation metu skrandžio vėžio vystymosi [22].
Ląstelių linijos modelių, DNMT1 raiška yra sąlygotas EBV LMP1 ir LMP2 [21, 28 -31]. EBV, atrodo, dirba epigenetinius mechanizmus, skirtus kontroliuoti kompiuterio transcriptome o taip pat kontroliuoti išraiška savo viruso sąlygotas koduotų genų [11, 12, 14, 15, 19, 21, 24, 29, 32, 33]. Pirminio infekcijos Ląstelėje nemetilintas viruso genomo gali atlikti viruso replikaciją su nauja virionams gamybos, o iš infekuotų ląstelių poaibis įsigyti labai metilintas viruso genomui, kad squelches išraiška svetimų baltymų ir tarpininkauja ilgalaikį virusinį išsilaikymą būdu latentinės infekcijos [23, 34]. Užkrėsti navikai linkę turėti labai metilintas EBV DNR, ir metilinimo susijusių nutildymo virusinių genų padeda paaiškinti, kaip užkrėstas navikai išvengti imuninę sunaikinimo.
Nors metilinimas genų vykdytojų paprastai susijęs su transkripcijos downregulation
per selektyvus surišamas slopinančioje baltymų pirmasis baltymų kada nors įrodyta, kad privalomos ir aktyvuoti
yra metilintas rėmėjas buvo EBV BZLF1, pagrindinis veiksnys kontroliuojant pereiti nuo latentinio į replikacinis formų virusinės infekcijos [35]. Atrodo, kad virusas protingai vystėsi įveikti promotorių metilinimas savo naudai [34, 35] priemones. Antivirusiniai strategijos yra tiriamos jų priešnavikiniam potencialą. Įdomu tai, kad dažniausiai naudojami antivirusiniai agentai, acikloviras ir gancikloviro, yra veiksminga nutrūkusio virusų replikaciją, bet jie nepašalina išraišką latentinių ir ankstyvųjų lizės virusinių genų, pavyzdžiui, LMP1, LMP2 ir BZLF1.
Klinikinė reikšmė EBV- susiję metilinimo skrandžio vėžio genomo yra didžiulė. Pirma, atsiranda įrodymų rodo geresnio diagnozavimo skrandžio vėžio potencialą išbandyti skrandžio plauna vėžiu konkrečių metilinimas modelių, galbūt koncertą su testų EBV nustatyti viruso infekuotų poaibį vėžio [36-40]. Skirtingų modelius promotoriaus metilinimo į viruso teigiamos, palyginti su viruso-neigiamas ląstelių [11, 21, 24] pabrėžti, kad reikia apibūdinti metilinimo modelius tokiu būdu, kad, kuri padidina tyrimo jautrumas už vėžio nustatymo. Abi infekcijos ir pakitęs DNR metilinimas atrodo anksti įvykiai kancerogenezėje [2, 41], gali palengvinti aptikimas ikivėžinius pakitimus skrandžio sulčių.
Antrasis klinikinis POVEIKIS yra geresnės gydymo skrandžio vėžio naudojant vaistus, Reversas potencialo poveikis promotoriaus hypermethylation [42, 43]. Visų pirma, demetilinimą preparatais, kurie slopina DNR metiltransferazei ir atgaline navikas slopintuvas genų slopinimo arba onkogeno aktyvavimo yra potencialūs antinavikiniai strategijas [43]. Dėmesys turi būti kreipiamas į galimą skirtumų demetilinimą agentų poveikį virusų teigiamų palyginti
virusus neigiamas navikų [43-45]. Mes ir kiti parodė, kad natūraliai infekuotų skrandžio vėžio turi mažesnį CDKN2A (P16) išraišką [14, 15]. Klinikinio tyrimo su fluorouracilu (5FU) skrandžio vėžys, CDKN2A
rengėjas metilinimas statusas buvo nepriklausoma prognozuoti išlikimo [46]. Už naudojimąsi demetilinimą medžiagas, kaip 5-aza-2'-deoksicitidino klinikinių tyrimų pagrindimas remiasi moksliniais įrodymais, kad demetilinimą terapija modifikuoja tumorogeninį savybes vėžinių ląstelių.
Keli tyrėjai sėkmingai užkrėstus epitelio ląstelių linijas su EBV į
in vitro
[47, 48]. Atsižvelgiant į dabartinę studijų, EBV teigiamas ir EBV-neigiamas AGS skrandžio vėžio ląstelės buvo išnagrinėti skirtumus genų išraiškos būdus, naudojant mažo tankio mikrogardeliq analizę ir atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandininė reakcija (rtPCR). AGS yra ląstelių linija, kad iš pradžių buvo auginamos iš skrandžio adenokarcinomos audinio ir dabar yra plačiai naudojamas kaip skrandžio vėžio modelį. DNR metilinimo vaidmuo tarpininkauti pažymėtus poveikį išnagrinėjo bisulfito DNR sekos ir testuojant A demetilinimą agentas gebėjimą atvirkštinę EBV poveikį genai yra nuslopinami. Rezultatai atskleidė didelę genų reguliacijos sutrikimas ant EBV infekcijos AGS ląstelių su įrodymais, kad rengėjas metilinimas yra atsakingas, bent jau iš dalies. Atstatymas virusus susijęs transkripcijos poveikis rodo, kad demetilinimą agentai turėtų būti ištirta jų potencialą kontroliuoti augimą EBV susijusių piktybinių navikų.
Metodai
skrandžio vėžio ląstelių linijų
AGS skrandžio vėžio ląstelių linijos (ATCC CRL- 1739) buvo kultivuojamas Dulbecco modifikuota Eagle terpė, kurių sudėtyje yra 10% vaisiaus jaučio serumo (šilumos-inaktyvuota 20 minučių esant 65 ° C) ir 1% penicilinui streptomicino (10,000 vienetų penicilino, 10000 mikrogramai /ml streptomicino, Gibco, Carlsbad, CA) , Ląstelės buvo užsikrėtę rekombinantinės EBV štamo (dovana dr Henri J. Delecluse) [33, 49, 50], kuris buvo suprojektuotas taip, kad išreikšti žalia fluorescencijos baltymų (GFP) ir higromicino B pasipriešinimą klonavimo šiuos genus į prototypic B95 0,8 padermės EBV kur antras egzempliorius oriLyt paprastai gyvena. Prieš infekcijos, AGS ląstelės buvo transfekuota su 1 mikrogramų ekspresijos vektoriaus kodavimo CD21 (EBV receptorių) ir puromicino atsparumo geno naudojant Fugene 6 (Roche, Indianapolis, IN) kaip aprašyta anksčiau [51]. Praėjus 48 valandoms po-transfekcijos, elementai, kurių sudėtyje CD21 buvo teigiamai pasirinktas naudojant 0,5 mikrogramai /ml puromicino-HCl (Roche). Virusinės atsargos rekombinantinės EBV buvo sugeneruotas per inkstus 293 ląstelių, žmogaus embriono epitelio ląstelių linijos, stimuliuoja lizės replikaciją naudojant 20 ng /ml phorbol 12-tetradecanoate 13-acetato ir 3 mm butiratas. Supernatantų, buvo surinktos 3 dienas po to, kai indukcijos, filtruojamas (0,8 mkm), ir užšaldyti iki -80 ° C temperatūroje, kol naudojimo. Puromicino atsparus AGS ląstelės buvo padengtas 50% visos tankio 60 mm audinio kultūrų patiekalų ir bendro inkubuojami su 1 ml akcijų virusų dalelėms. Po keturių dienų, EBV-užsikrėtę AGS ląstelių (dabar vadinamas "AGS-B95-HygB) buvo teigiamai pasirinktas su 100 mikrogramų /ml higromicino B (Roche).
DNR pirštų atspaudų patvirtino, kad AGS ląstelės, naudojamos šiame tyrime atitiko genotipo AGS ląstelės American Type Culture Collection. Pirštų atspaudų buvo padaryta naudojant PowerPlex 1.2 STR komplektas (PROMEGA) po elektroforezės ABI 310 kapiliarų gelio elektroforezės priemonės (Applied Biosystems).
Genų ekspresiją histocheminės dėmes
Parafino blokų buvo ruošiamas iš AGS ir AGS-B95- HygB ląstelių linijos ir parafino blokai pirminės skrandžio adenokarcinoma buvo gauti iš klinikinių archyvuose. Liekamasis klinikinių mėginių atstovauti visų laisvų EBV teigiamų skrandžio vėžio (n = 9) ir atsitiktine tvarka atrenka EBV-neigiamas skrandžio vėžio (n = 9). Histocheminės dėmės buvo taikomi parafino skyriuose patvirtinti infekcija ir įvertinti genų ekspresiją. Parengti blokus, išauginti ląstelės buvo pirmasis perskalauti Dulbecco fosfatinio buferio druskų tirpalu (Gibco, Invitrogen), derlius su 0,25% tripsino (Gibco, Invitrogen), įsipainioję į krešulio naudojant Dade Ci-Trol koaguliacijos kontrolę (citruotą) -Level 1 (Dade Behringas, Marburg, Vokietija) ir trombino 200 (Ramiojo vandenyno hemostazę, Middletown, V.), nustatyta 10% buferiniame formalino, įterptųjų parafinu ir suskirstyta į padengtos skaidres.
Ebera
in situ hibridizacijos
buvo atliktas naudojant fluoresceino žymėto Ebera
zondo ir oligo (d), T kontrolės zondą ant in situ hibridizacijos
sistemos (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) etalonas. Imunohistocheminiais dėmės dėl EBV LMP1 ir LMP2 baltymų buvo atliekamas kaip aprašyta anksčiau [52], naudojant citrato antigeno priėmimas ir į CS1-4 kokteilis pelės monokloniniai antikūnai prieš LMP1 (1: 100, DaKo, Capinteria, Ca) ir E411 žiurkė monokloniniai antikūnai prieš LMP2 (1 mg /ml, Asencion, Munich, Vokietija). Parafino skyriai EBV susijusių Hodžkino limfoma ir po transplantacijos limfinio audinio sutrikimas tarnavo kaip teigiamą kontrolę
Imunohistocheminiais analizę EBV replikacinis baltymų BMRF1 ir BZLF1 buvo atliekama naudojant anti-BMRF1 klonas G3-E31 ​​(1:. 200 atskiesti, mokslinių tyrimų diagnostika , Inc, Flandrija, NJ) ir anti-BZLF1 klonas BZ.1 (01:25 praskiedimo, Dako, Carpinteria, Kalifornija), o žmogaus PTGS2 (šnekamojoje kalboje pavadintas ciklooksigenazės-2, COX2) buvo tiriami naudojant anti-COX2 monokloninis antikūnas ( 1: 200 praskiedimą, Kaimanų Chemijos). Dalys buvo inkubuotos su pirminiais antikūnais 30 minučių 37 ° C temperatūroje, EBV tikslų, arba, esant 4 ° C temperatūroje per naktį dėl COX2, naudojant blokavimo ir aptikimo protokolų Super-jautriai Ne biotinas HRP aptikimo Kit (Biogenex). Antikūniai buvo aptiktas naudojant diaminobenzidinas Chromogenas (Biogenex) ir ląstelės buvo counterstained hematoksilinu (Dako). Parafino skyriai burnos gauruotas leukoplakia tarnavo kaip teigiama kontrolė lizės EBV, o reaktyvioji tonzilių ir nosiaryklės audinių tarnavo kaip valdiklių COX2 dėmes. Rezultatai buvo aiškinama, mikroskopu balais piktybinių ląstelių ≥10 laukus 400X padidinimu duoda vidutiniškai proporcija rezultatą (0 = Nėra, 1 = < 1%, 2 = 1-10%, 3 = 10-33%, 4 = 33 -66%, 5 = > 66% ląstelių) ir intensyvumas balas (0 = nėra, 1 = silpnas, 2 = tarpinis, 3 = stipri dėmių atsiradimas). Iš viso balų buvo palyginti EBV teigiamas palyginti
neigiamų navikų naudojant Mann-Whitney neporinis t testą.
Aptikimas EBV genomo
kiekybinių realaus laiko PGR (Q-PGR) tyrimų baterija taikymo šešis skirtingą regionai EBV genomo buvo įrodyti, kad virusinė infekcija AGS ląstelių buvo sėkmingas. Amplifikuoti produktai buvo aptikta naudojant ABI PRISM 7500 Realaus laiko PGR priemonę su seka aptikimo sistemos programinė įranga (taikomoji BIOSYSTEMS), kaip aprašyta anksčiau, naudojant pradmenis, skirtoms BamH1W
, EBNA1
, LMP1
, LMP2
, ir BZLF1
regionus EBV genomo [52] arba EBER1
DNR [53]. Norėdami patikrinti, ar amplikono užteršimo, kas paleisti pateikta bent du "Ne šabloną" kontrolę, kuri nukleazes be H2O buvo pakeisti šabloną.
Mažo tankio kDNR mikrogardeliq analizė
RNR buvo išskirta iš AGS ir AGS-B95- HygB ląstelės naudojant RNeasy RNR Mini Kit (Qiagen) po pirmos naudojant QiaShredder ™ gręžimo kolonėlė (Qiagen) į Łyse ląsteles. Patvirtinę RNR vientisumą, naudojant AGILENT Bioanalyzer, išraiška Mikrogardelė analizė buvo atliekama SABiosciences Corporation "(Frederick, MD), naudojant savo GEArray Q serija Human signalo perdavime vėžio genų masyvo. Tai mažo tankio Mikrogardelė sudaro 96 zondai, išbandyti aktyvavimą 15 signalo perdavimo kelius, dalyvaujančių onkogenezėje. (TARGET nuorašai yra išvardyti rezultatų.) Biotinas žymėto kDNR, pagaminti iš 10 mikrogramų kiekvieno RNR mėginį AmpoLabeling-LPR metodą (SABiosciences) buvo kryžminosi į masyvą ir cheminės liuminescencijos aptikimo buvo atliekama naudojant CCD kamera. Integruotos žaliavos intensyvumo vertes kiekvienai vietoje buvo sukurtas GEArray analizė Suite programinės įrangos (SABiosciences) ir tolesnė analizė ir normalizavimas buvo atlikta naudojant Microsoft Excel ". Žemiausias taškas intensyvumas vertės kiekvieno masyvo buvo laikomas fone ir buvo atimamas iš kiekvienos žalio intensyvumo vertė kiekvienai zondo, ir tada vietoje intensyvumas buvo normalizuotas, kad į namų ūkį geno, glyceraldehydephosphate dehidrogenazės (GAPDH pervežimas). Porinis palyginimas genų ekspresijos lygį buvo tarp EBV-teigiamas ląsteles (MAA-B95-HygB) ir tėvų EBV-neigiamas AGS ląsteles. Jei šis santykis buvo ≥2 arba ≤0.5, buvo laikoma genas turi būti aktyvinama arba downregulated infekuotų ląstelių.
SYBR Green pusiau kiekybiniai testo rtPCR
Norėdami patvirtinti pasirinktas microarray genų ekspresijos rezultatus, rtPCR atlikta naudojant realaus laiko AT <sup>2 genų būdingų PGR pradmenys (SABiosciences). ReactionReady ™ Pirma kryptis kDNR sintezė Kit (SABiosciences) buvo naudojama konvertuoti 3 mikrogramų RNR cDNR, ir kDNR buvo praskiestas 1:10 prieš PGR metodu. Šie 38 kDNR buvo skirta: GAPDH, A2M, ABCB1, BCL2L1, BIRC1, BIRC2, BIRC3, EN1, GADD45, HIF1A, ID2, IGFBP3, BRCA1, TMEPAI, IRF1, BCL2, BMP4, CDKN2A (P16), FN1, HK1, ICAM1, IL2, CCND1, MDM2, COX2 (PTGS2), TFRC, WISP1, TRAF1, CDK2, VCAM1, CDKN2C (P18), CDKN1A (P21), DUSP1, HSP70, NFKB1, TNFSF10, TRIM25
ir FOSL1
. Reakcijos buvo atliekamas bendras tūris 25 įxL sudėtyje yra 1X TaqMan ® Universal Mix (ABI) RT 2 genų būdingų pradmenų rinkinio mišinys (10 mkm kiekvienas gruntas, SABiosciences), 2,5 pL 5X SYBR žalios spalvos tirpalas ( molekuliniai zondai, Eugenijus, AR), ir 5 pL kDNR šabloną. Thermocycling sąlygos buvo: 50 ° C temperatūroje 2 min, 95 ° C temperatūroje 10 minučių, ir 40 ciklų 95 ° C temperatūroje 15 sekundžių ir 60 ° C temperatūroje 1 minutę dėl ABI 7500 priemonę su Sequence Detection sistemos programinė įranga (Applied Biosystems). Tas pats slenkstis buvo naudojamas kiekvienam genų ir plokštelės vertinamos pagal "Santykinis kiekybinis Plate" protokolą. Kiekvieną PGR reakcija buvo paleisti tris kartus, kiekvieno mėginio ant dviejų atskirų 96-duobučių lėkštelėse, ir rezultatai buvo vidutiniškai nustatyti santykinius skirtumus kiekvienoje geno ekspresijos lygį EBV-teigiamas, lyginant su
EBV-neigiamas ląstelių linijos.
Mažosios "Groove įrišimas Probe pusiau kiekybiniai testo rtPCR
įvertinti išraišką penkių atrinktų genus, kurie buvo ne aukščiau aprašytą microarray, pusiau kiekybiniai rtPCR tyrimai buvo atliekami (tyrimai-paklausa, Taikomoji BIOSYSTEMS), naudojant nedidelis griovelis privalomus zondai orientacijos helikazės-kaip transkripcijos faktorius (HLTF
), trilapis faktorius 1 (TFF1
), Basic-leucinas užtrauktukas ATF-kaip transkripcijos faktorius (BATF
) inhibitorius DNR surišantis baltymas-4 (ID4
) ir nucleostemin (NS
). Šie penki atrinkti, nes jie, kaip pranešama, dysregulated didelėje dalis skrandžio adenokarcinomos ar EBV susijusių vėžio [32, 54-59]. GAPDH
tarnavo kaip endogeninio kontrolės santykinių kiekybinio tikslais. RNR buvo konvertuojami į cDNR naudojant didelės talpos kDNR Archyvas rinkinį (Applied Biosystems), ir kDNR buvo praskiestas 1:10 su nukleazės be vandens. Kiekvienas 50 pL PGR reakcija pateikta: 1X TaqMan ® Universal Master Mix, 1x Tikslinė genų ekspresijos testo ar GAPDH
endogeniniai kontrolės sumaišoma ir 10 iL kDNR. Norėdami patikrinti, ar amplikono užteršimo, kas išraiška tyrimo kiekvieną plokštelės pateikta bent du "Ne šabloną" kontrolę, kuri nukleazes be vandens buvo pakeisti šabloną. Thermocycling sąlygos ir duomenų analizė buvo, kaip aprašyta aukščiau už SYBR Žalioji rtPCR.
Demetilinimu gydymas ir seka bisulfite-modifikuotų DNR
studijuoti demetilinant poveikį, AGS ir AGS-B95-HygB skrandžio vėžio ląstelių linijos buvo išaugo iki 75% susiliejimo, o po to tris dienas iš eilės 1 pM šviežio 5-aza-2'-deoksicitidino (5aza; Sigma), buvo įtraukta per parą. Ketvirtą dieną, RNR ir DNR buvo nuimamas iš gydytų ir negydytų kultūrų. RNR buvo įvertintas genų ekspresijos lygį ir DNR buvo tiriama metilinimo po natrio bisulfito gydymas (EZ DNR Metilinimas komplektas, Zymo tyrimų, Oranžinė, Kalifornija) konvertuoti nedenatūruotą cytosines į uracilas, išlaikant denatūruoti cytosines nepakitęs [60]. Teigiama kontrolė buvo CpGenome Universalus denatūruotu DNR (Chemicon) taikoma ta pati bisulfito perskaičiavimo ir kontrolės gruntai orientacija C8orf4
ląstelių geno promotoriaus patvirtino sėkmingą bisulfite konversiją kiekvieno DNR mėginio [61]. CpG salos buvo nustatyti naudojant CPG sklypas kiekvienas iš penkių žmogaus genes-- ICAM1
(RefSeq # NM_00201), CDKN2A (P16)
(RefSeq # NM_000077.3), ID4
(RefSeq # NM_001546) COX2
(RefSeq # NM_000963) ir TFF1
(RefSeq.225,2) - kurių promotorinės sekas (3000 basepairs tiekėjų iš transkripcijos starto svetainėje per egzono 1) buvo atsisiųsti iš GenBank. buvo naudojami šie parametrai CpG salos identifikuoti: mažiausias ilgis 200 bp, mažiausias vidutinis procentas c + g 50%, o mažiausias vidutinis santykis pastebėta, kad tikimasi, c + g 0,6 [62]. Norėdami nustatyti CpG tankus regionai COX2
ir TFF1
, minimalus ilgis parametras buvo sumažintas iki 50 bp [61]. Gruntas sekos yra parodyta 1 lentelėje Kiekvienas 50 mikrol PGR reakcija pateikta: 1X PGR buferis, 2 mm MgCl <sub>2, 1 vienetas platina Taq DNR polimerazė (Invitrogen, Karlovi Varai CA) 0,2 mM dNTP (ABI) ir 30 pmol kiekvieno pradmens. Thermocycling sąlygos buvo: 94 ° C temperatūroje 2 min, 40 ciklų 94 ° C temperatūroje 30 sekundžių, 55 ° C temperatūroje 30 sekundžių, ir 72 ° C temperatūroje 1 minutę, 72 ° C temperatūroje 10 minučių. Stebėti amplikono užteršimo, kas paleisti esančius "ne šabloną" kontrolę, kurioje nukleazes be vandens buvo pakeistų templateTable 1 bisulfite Perskaičiuotas Genų-Konkretus PGR pradmenų sekos
ICAM1

Persiųsti
5'-TGG ggg TTG TGG TTT TAG TT 3 "
Nemokama Reverse
5'-BTK BMT CCA CTA AAA AC-3"
amplikono dydis
412 BP
CDKN2A (P16)
Persiųsti
5'-AGA TGT TTT GTG GTT GTT GTG A-3 "
Grįžtamieji
5'-CAA AAA TCT TCC ATT CTT CAA AC -3 "
amplikono dydis
418 BP
ID4
Persiųsti
5'-TTT TTT ggg TAT ATA TTA GTT TGG-3"
Grįžtamieji
5'-TAT BMT AAT ŠMC TCC CTT, C-3 "
amplikono dydžio
477 BP
COX2
Persiųsti
5'-TAT GTG TTG TAT ATA GAG Tag A-3"
Atvirkštinė
5'-AAA AAA TPI TCC CCA BTK TC -3 "
amplikono dydžio
399 BP
TFF1
Persiųsti
5'-TTA GGT TGG AGT GTA GTA GG-3"
Atvirkštinė
5'-BMT AKTAS CAT, ATC TPI AAA ACC, C-3 "
amplikono dydis
489 BP
C8orf4 kontrolės
Persiųsti
5'-GAA TTA AAA TAT AAG GAG AGT TTT-3 "
Atvirkštinė
5'-AAC PGS ACC CAA PPK TPI AAC AA 3"
amplikono dydžio
328 BP
sekos buvo atliktas Amplikonų apie bisulfite gydytų šablonus, siekiant nustatyti metilinti ir nedenatūruotą CpGs su arba be 5aza gydymui. Pirma, kiekvieną PGR produktas buvo klonuotas į pGEM-T vektoriaus naudojant pGEM-T yra lengva vektoriaus sistema II (PROMEGA) ir transformuojami JM109 didelio efektyvumo kompetentingų ląsteles. Baltos kolonijos, kurių sudėtyje yra įdėklai buvo atrinkti ir kultivuojamos per naktį, ir plazmidės DNR buvo ekstrahuojamas naudojant QiaPrep Spin minipreparatyvinė rinkinį (QIAGEN). Sekos buvo padaryta ABI 3100 Genetic Analyzer naudojant ABI PRISM ™ BigDye ™ Versija 1.1 Terminatorius ciklas Ready Reakcijos rinkinys su AmpliTaq DNR polimerazė ir M13R3 gruntu. Rezultatai buvo atsisiųsti į Sequencher programinė įranga (genų kodai, Ann Arbor, MI) gauti atvirkščią komplimentas kiekvienam sekos ir pirmyn ir atgal sekos buvo suderinta ir analizuojami išskirti nedenatūruotą cytosines iš metilo cytosines.
Vakarų dėmė ant AGS ląstelių linija
Kadangi vartojant COX2 inhibitoriai potencialo įveikti COX2 poveikį, RNR pagrindu rezultatai COX2 buvo pasirinkta tolesnės studijuoti baltymų lygyje. Susiliejantis AGS ląstelės su arba be EBV buvo surinktos su 0,25% tripsino, du kartus plaunamas tirpalo fosfato buferio druskos tirpalu, o ir daro žirnelius centrifuguojant. Ląstelės buvo resuspenduotos 500 ul NP-40 ląstelių lizės buferiniame tirpale (50 mmol Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1% NP-40, pH 8,0), inkubuojami ant ledo per 30 minučių, ir sukamas 12.000 apsisukimų per minutę 15 min esant 4 ° C. Mėginiai lizate (50, 100, 150 ug baltymų vienam šulinio) buvo išspręsta naudojant SDS-PAGE ant Tris-glicinas 4-20% statumo gelio (INVITROGEN) ir perkeliamas ant nitroceliuliozinio membrana. COX2 buvo aptikta su 1: 5000 skiedimo monokloninio antikūno po 1: 10000 skiedimą antrinio antikūno konjuguota su šarminės fosfatazės (Amersham Biosciences), ir vizualizavimo su Typhoon PhosphorImager (molekulinė Dynamics). Juosta išmatuota tankio pusiau kiekybiškai ir normalizuotas beta aktino (ACTB) buvo lyginami tarp užsikrėtusių ir sveikų AGS ląsteles.
Rezultatai
EBV infekcija "AGS Skrandžio vėžio ląstelių
Sėkmingas EBV infekcija AGS skrandžio vėžio ląstelių buvo patvirtinta naudojant šešių K-PGR orientacijos skirtingas segmentų EBV genomą. Ebera
in situ hibridizacijos
neparodė Ebera
išraišką tėvų "EBV-neigiamas" AGS ląsteles, kadangi didesnė nei 90% AGS-B95-HygB ląstelės buvo Ebera
-positive ir buvo aktyvuota -appearing atominės morfologija (1 paveikslas). Platinimas tarifas buvo padidintas, kaip parodė santakos išaugintų AGS-B95-HygB ląstelių tris dienas prieš tėvų AGS ląsteles. Infekcija išliko bent 4 mėnesius, kaip parodė GFP ir Ebera pervežimas histocheminiu dėmes. EBV latentinis (LMP1 ir LMP2A) ir lizės (BZLF1 ir BMRF1) baltymai nebuvo išreikšta sveikų AGS ląstelių, o ~ 10% infekuotų ląstelių išreiškė LMP1, puse ląstelės išreiškė LMP2A ir ~ 35%, išreiškiant BMRF1 ir BZLF1 baltymus kas reikštų aktyvus virusinė replikacija (1 paveikslas). 1 pav AGS-B95-HygB ląstelės išreiškia nematomus ir lizės virusinių genų. A) Imunohistocheminis dėmių už GFP rodo higromicino B gydytų AGS ląstelės buvo vienodai užsikrėtę inžinerijos B95.8 EBV genomą. B) Ebera in situ hibridizacijos
rodo latentinį infekcijos > 90% ląstelių. Nuclear Ebera
dažymo dalys su nucleoli ir išsiplėtusios nucleoli yra pagaminti iš akytos aktyvacijos žymeklis. Latentinis virusinė baltymai LMP1 (C) ir LMP2 (D) išreiškė iš pagrindų. Lizės virusiniai baltymai, BMRF1 (E) ir BZLF1 (F), buvo išreikštas didelė dalis AGS-B95-HygB ląstelių. (GFP ir BMRF1 dėmes, 800x; LMP1, LMP2, Ebera parsisiųsti ir BZLF1 dėmes, 1200x)
Mobiliojo ryšio genų ekspresijos skirtumai EBV-teigiami, palyginti su EBV-neigiamas AGS ląstelių
Expression lygių 96 korinio genų buvo analizuojami į AGS ir AGS-B95-HygB elementuose naudojamos mažo tankio mikrogardeliq analizę su cheminės liuminescencijos aptikimo (2 paveikslas). Po normalizavimo į GAPDH
, Porinis palyginimas genų ekspresijos lygį tarp EBV teigiamų ir EBV-neigiamas AGS ląstelių atskleidė, kad iš 96 genų mikrogardeliq, 43 buvo dysregulated bent du kartus po EBV infekcija. Keista, buvo pastebėtas EBV susijęs padidėjimas saviraiškos tik 6 genų (IGFBP3
, GADD45, IRF1, Grp78 /HSPB1, GLUT1 /SLC2A1, TMEPAI
), o sumažėjo buvo pastebėtas dėl likusių 37 dysregulated genų išraiška (ABCB1, BCL2L1, BIRC2, BMP2, CDKN2A, DUSP1, HIF1A, ICAM1, ID2, NFKB1, COX2, TFRC, VCAM1, WISP1, TRIM25, IL2, BMP4, MDM2, CCND1, CDK2, BAX, P57, P19, CSN2, CXCL9 , IL4, Bir KLK3, LTA, MMP7, PPARG, TNFRSF10B, WIG1, WNT2, PTCH2
). 2 pav genų ekspresijos modeliai yra pakeista EBV infekcijos AGS ląsteles. Biotinas žymėto kDNR zondai apsivilkusi keturiais egzemplioriais ant nailono membranos Lytiškai į RNR izoliuotas nuo AGS ir AGS-B95-HygB ląsteles. Chemiliuminescencinius signalai rodo reguliacijos sutrikimas pasirinktų genų tarp 96 d masyvo, palyginti su kontrolės genų pastaruosius dviem eilėmis.
SYBR Green rtPCR buvo naudojamas patikrinti mikrogardeliq išvadas dėl 26 dysregulated genų ir 12 papildomų genų, kurioje nėra reikšmingas pokytis buvo pastebėta mikrogardeliq. Daugiau nei du kartus pakeistų iRNR lygio užkrėstas prieš
sveikų ląstelių ir 16/26 genų (2 lentelė) buvo rasta. Genai labiausiai paveiktos buvo IGFBP3
kad buvo aktyvinama 42 kartų, o COX2, BMP4 ir ICAM1
kad buvo downregulated iki 35-, 32- ir 22 kartus, atitinkamai. Likusios dešimt mikrogardeliq pagrindu pakeitimai nebuvo patvirtinta rtPCR, tai rodo, kad EBV susijusių reguliacijos sutrikimas iš šių veiksnių buvo mažesnė nei du kartus. Vienu atveju, ten buvo pagrindinis skirtumas: Expression lygiai BCL2L1
pagal mikrogardeliq analizė parodė du kartus mažiau
infekuotų ląstelių, o rtPCR kartą parodė penkis kartus padidinti
BCL2L1
mRNR lygiai užkrėstų ląstelių. buvo rasta mažiau dramatiškų neatitikimai, kai papildomi 12 genai buvo analizuojami rtPCR, su reikšminga (> 2 kartus) nustatė pokyčiai 5/12 genų, dėl kurių nėra pakeitimo buvo pastebėtus mikrogardeliq išraiškos (2 lentelė) .table 2 genai Dysregulated į EBV-teigiamas AGS Cells
genų Vardas
genų Symbol

Sulenkite pokytis *
Downregulated genai
Pagrindinis leucinas-užtrauktukas transkripcijos faktorius, ATF-kaip
BATF
-38
ciklooksigenazės-2
COX2
-35
kaulų morfogeninio baltymų-4
BMP4
-32
tarpląstelinės adhezijos molekulė-1
ICAM1
-22
trilapis faktorius 1
TFF1
-21
inhibitorius DNR privalomas-2
ID2
-14
šilumos šoko baltymas-70
HSP70
-10
cikloniniai priklausoma kinazės-2
CDK2
-9
cikloniniai-D1
CCND1
-9
hipoksija indukuojamąją faktoriaus 1A
HIF1A
-9
krūties vėžio 1
BRCA1
-7
nucleostemin
NU
-7
cikloniniai priklausoma kinazės inhibitorius-2A
CDKN2A /P16
-6
inhibitorius DNR privalomas-4
ID4
-6
engrailed-1
EN1
-5
ATP privalomas kasetė, pošeimis B narys 1
ABCB1
-3
MDM2 p53 privalomas baltymų
MDM2
-3
aktyvinama genai
insuliną panašus augimo faktorius surišantis baltymas-3
IGFBP3
40
naviko nekrozės faktoriaus receptoriaus susijęs faktorius 1
TRAF1
20
transmembraninis prostatos androgenų sukeltų baltymų
TMEPAI
10
naviko nekrozės faktorius, superšeimai narys-10
TNFSF10
8
B ląstelių limfoma-2-kaip -1
BCL2L1
7
bakuloviruso TPA pakartokite, kurių sudėtyje yra-3
BIRC3
5
heksokinazės-1
HK1</sub></sup>