Epstein-Barr virus-specifieke methylatie van genen in menselijke maagkanker cellen

Epstein-Barr virus-specifieke methylatie van genen in menselijke maagkanker cellen
Abstract achtergrond
Epstein-Barr virus (EBV) komt voor bij 10% van gastrische adenocarcinomen maar de rol in tumorontwikkeling en onderhoud resten onduidelijk. Het doel van deze studie was EBV-gemedieerde ontregeling van cellulaire factoren betrokken bij maagkanker onderzocht.
Methods
genexpressie patronen werden in EBV-negatieve en positieve EBV-AGS maagepitheelcellen met een lage dichtheid microarray onderzocht reverse transcriptie PCR, histochemische vlekken en methylatie-specifieke DNA sequentiebepaling. Expressie van PTGS2 (COX2) werd gemeten in AGS-cellen en in het primair adenocarcinoom van de maag weefsels.
Resultaten
In reeks studies, bijna de helft van de 96 menselijke genen getest, wat neerkomt op 15 verschillende kanker-gerelateerde signaaltransductie routes, werden ontregeld na EBV infectie. Reverse transcriptie PCR bevestigd aanzienlijke impact hebben op factoren die diverse functies, zoals regulering van de celcyclus (IGFBP3
, CDKN2A, CCND1, HSP70, ID2, ID4)
, DNA-reparatie (BRCA1, TFF1
), celadhesie ( ICAM1
), ontsteking (COX2
) en angiogenese (HIF1a
). Demethylering met behulp van 5-aza-2'-deoxycytidine keerde de EBV-gemedieerde ontregeling van alle 11 hier genoemde genen. Voor sommige promotersequenties, CpG eiland methylering en demethylering opgetreden in een EBV-specifiek patroon zoals door bisulfiet DNA sequencing. Immunohistochemie was minder gevoelig dan werd western blot voor het detecteren van neerwaartse regulatie van COX2 op EBV infectie. Virusgerelateerde ontregeling van COX2 niveaus in vitro
niet gerecapituleerd in vivo
onder natuurlijk geïnfecteerd maagkanker weefsels.
Conclusies
EBV verandert genexpressie mens op manieren die kunnen bijdragen aan de unieke pathobiologie van virus geassocieerde kanker. Bovendien, de frequentie en reversability van methylatie-gerelateerde transcriptie veranderingen suggereren dat demethyleren agenten hebben therapeutisch potentieel voor het beheer van EBV-gerelateerde carcinoom. Achtergrond
Maagkanker is de vierde meest voorkomende vorm van kanker en de tweede belangrijkste oorzaak van kanker overlijden wereldwijd [1]. Verschillende genetische veranderingen en infectieuze agentia en andere omgevingsfactoren blijken factoren maagkanker is. Epstein-Barr virus (EBV), een dubbelstrengs DNA gammaherpesvirus wordt gevonden binnen de kwaadaardige cellen in 10% van gastrische adenocarcinomen, en infectie lijkt maligne transformatie voorafgaan [2]. Fundamentele en klinische waarnemingen suggereren dat EBV-geassocieerde maagkanker hebben een andere pathobiology van EBV-negatieve maagkanker [3-8]. Rationeel ontwerp van virus-gerichte therapie vereist een beter begrip van de pathogene rol van EBV in maagkanker.
Voorafgaande studies hebben aangetoond verlies van drie kritische tumorsuppressorgen producten, CDH1 (E-cadherine), p73 en CDKN2A (p16 ), in EBV geïnfecteerde maagkanker [9-18]. -Virus geassocieerde methylatie van deze genen, samen met bewijs van globale DNA methylatie in EBV-positieve kanker suggereert dat EBV-gerelateerde gastrische kankers zijn een subset van CpG eiland methylator fenotype (CIMP) kanker [4, 11, 19-26]. Een potentiële mediator is DNA methyltransferase 1 (DNMT1)
die wordt opgereguleerd in natuurlijk geïnfecteerd maagkanker en kon helpen bij het vaststellen methylatie patronen doorgegeven aan dochtercellen bij celdeling [21, 27-29]. Lopende studies zijn gericht op het begrijpen van de rol van EBV en Helicobacter pylori-infectie bij het ontstaan ​​van ontstekingen en daarmee samenhangende mondiale Hypermethylering tijdens maagkanker ontwikkeling [22].
In cellijn modellen, DNMT1 overexpressie wordt bemiddeld door EBV LMP1 en LMP2 [21, 28 -31]. EBV lijkt epigenetische mechanismen om de gastheer transcriptoom controle dienst en om expressie van zijn eigen viraal gecodeerde genen [11, 12, 14, 15, 19, 21, 24, 29, 32, 33]. Bij de eerste infectie van een cel, kan de ongemethyleerde virale genoom virale replicatie nieuwe virion productie ondergaan, terwijl een subset van geïnfecteerde cellen een volstrekt gemethyleerde viraal genoom dat expressie van vreemde eiwitten squelches en bemiddelt langdurige virale persistentie door de latente infectie [23, 34]. Geïnfecteerde tumoren hebben de neiging om zeer gemethyleerd EBV DNA en-methylatie-gerelateerde silencing van virale genen helpt verklaren hoe geïnfecteerde tumoren ontduiken immune vernietiging.
Terwijl methylatie van genen promoters gewoonlijk wordt geassocieerd met transcriptie downregulatie
via selectieve binding van repressor eiwitten het eerste eiwit ooit aangetoond te binden en activeren
gemethyleerde promoter was EBV BZLF1, de belangrijkste factor die de overschakeling van latente naar replicatieve vormen van virale infectie [35]. Het blijkt dat de virus onderschept geëvolueerd middel overwinnen promoter methylatie in haar voordeel [34, 35]. Antivirale strategieën worden onderzocht op hun potentiële antineoplastische. Interessant is dat de meest gebruikelijke antivirale middelen, acyclovir en ganciclovir, effectief zijn in het afsluiten van virale replicatie maar geen expressie van latente en lytische virale vroege genen zoals LMP1, LMP2 en BZLF1 elimineren. Ondernemingen De klinische implicaties van EBV verwante methylering van de maagkanker genoom zijn immens. Ten eerste, de opkomende bewijsmateriaal toont het potentieel voor een betere diagnose van maagkanker door het testen van de maag wasbeurten voor kanker-specifieke methylatie patronen, wellicht in overleg met tests voor EBV aan de virus-geïnfecteerde subset van kanker [36-40] te identificeren. Verschillende patronen van promotor-methylering-positieve virus in vergelijking met virus-negatieve cellen [11, 21, 24] benadrukken dat methylatie patronen te detecteren op een wijze dat deze maximaliseert assay gevoeligheid voor detectie van kanker. Zowel de infectie en veranderde DNA-methylatie lijken vroege gebeurtenissen in carcinogenese [2, 41], mogelijk faciliteren van de detectie van precancereuze letsels in de maag sap zijn.
Een tweede klinische implicatie is het potentieel voor verbetering van de behandeling van maagkanker het gebruik van drugs dat het omgekeerde effect promotor hypermethylatie [42, 43]. Vooral demethylerende middelen die DNA methyltransferase remt en omgekeerde tumorsuppressorgen silencing of oncogenactivering potentiële antineoplastische strategieën [43]. Aandacht dient te worden besteed aan mogelijke verschillen in het effect van demethylerende agenten in virus-positieve versus
virus-negatieve tumoren [43-45]. Wij en anderen hebben aangetoond dat natuurlijk geïnfecteerd maagkanker lagere CDKN2A (p16) expressie [14, 15]. In een klinische trial van fluorouracil (5FU) voor maagkanker, CDKN2A
promotor methylatie status van een onafhankelijke voorspeller van de overleving [46]. De reden voor het gebruik demethylerende middelen zoals 5-aza-2'-desoxycytidine in klinische onderzoeken berust op wetenschappelijk bewijs dat demethyleren therapie wijzigt de tumorigene eigenschappen van kankercellen.
Verschillende onderzoekers hebben met succes geïnfecteerde epitheliale cellijnen met EBV in
vitro
[47, 48]. In de huidige studie, EBV-positieve EBV-negatieve AGS maagkanker cellen werden onderzocht op verschillen in genexpressie patronen door lage dichtheid microarray analyse en reverse transcriptie polymerase kettingreactie (RTPCR). AGS is een cellijn die oorspronkelijk werd gekweekt uit maagdarmkanker weefsel en nu wordt algemeen gebruikt als een model van maagkanker. De rol van DNA methylering bij het bemiddelen geselecteerde effect werd onderzocht door bisulfiet DNA sequentiebepaling en testen of een demethyleringsmiddel om het effect van EBV op genuitschakeling keren. Resultaten bleek uitgebreide gen ontregeling van EBV infectie in cellen AGS bewijs dat promotor-methylering verantwoordelijk is, ten minste gedeeltelijk. Omkering van-virus geassocieerde transcriptie effecten suggereert dat demethyleren agenten moeten worden onderzocht op hun potentieel om de groei van EBV-gerelateerde maligniteiten onder controle.
Methods
maagkanker cellijnen Ondernemingen De AGS maagkanker cellijn (ATCC CRL 1739) werd gekweekt in Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium bevattende 10% foetaal runderserum (hitte geïnactiveerd gedurende 20 minuten bij 65 ° C) en 1% penicilline-streptomycine (10.000 eenheden penicilline, 10.000 ug /ml streptomycine, Gibco, Carlsbad, CA) . De cellen werden geïnfecteerd met een recombinant EBV stam (een gift van Dr. J. Henri Delecluse) [33, 49, 50] dat is ontworpen om groene fluorescentie eiwit (GFP) en hygromycine B resistentie expressie door het kloneren van deze genen in de prototypische B95 0,8 stam van EBV waar de tweede exemplaar van oriLyt normaal verblijft. Vóór infectie werden AGS cellen getransfecteerd met 1 ug van een expressievector coderend voor CD21 (de EBV-receptor) en een puromycine resistentiegen door Fugene 6 (Roche, Indianapolis, IN) zoals eerder beschreven [51]. Op 48 uur na transfectie werden cellen die CD21 positief geselecteerd voor gebruik 0,5 ug /ml puromycine-HCl (Roche). Virale voorraden recombinant EBV werden gegenereerd in de nier 293 cellen, een humane embryonale epitheliale cellijn, door het induceren van lytische replicatie via 20 ng /ml forbol- 12-tetradecanoaat 13-acetaat en 3 mM butyraat. Supernatanten werden geoogst 3 dagen na inductie, gefiltreerd (0,8 uM) en ingevroren bij -80 ° C tot gebruik. Puromycineresistente AGS-cellen werden met 50% volledige dichtheid in 60-mm weefselkweekschaaltjes en co-geïncubeerd met 1 ml van de virions. Vier dagen later werden de EBV geïnfecteerde cellen AGS (nu AGS-B95-hygB) positief geselecteerd met 100 ug /ml hygromycine B (Roche).
DNA fingerprinting bevestigd dat AGS cellen die in deze studie paste het genotype van AGS cellen in de American Type Culture Collection. Fingerprinting werd gedaan met behulp van de PowerPlex 1.2 STR-kit (Promega), gevolgd door elektroforese op een ABI 310 capillaire gelelektroforese instrument (Applied Biosystems).
Gene Expression door Histochemische Stains
Paraffine blokken werden bereid uit AGS en AGS-B95- hygB cellijnen en paraffineblokken van primair adenocarcinoom van de maag werden opgehaald uit klinische archieven. De resterende klinische monsters vertegenwoordigt beschikbare EBV positieve maagkanker (n = 9) en een willekeurige selectie van EBV-negatieve maagkanker (n = 9). Histochemische vlekken werden op paraffine secties infectie bevestigen en om genexpressie te evalueren. Blokken bereiden, werden gekweekte cellen eerst gewassen in Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (Gibco, Invitrogen), geoogst met 0,25% trypsine (Gibco, Invitrogen), verstrikt in een stolsel behulp Dade Ci-Trol Coagulation Control (gecitreerd) -Niveau 1 (Dade Behring, Marburg, Duitsland) en trombine 200 (Pacific Hemostase, Middletown, VA), gefixeerd in 10% gebufferde formaline, ingebed in paraffine en in secties verdeeld op gecoate glaasjes.
EBER
in situ hybridisatie werd uitgevoerd
met behulp van fluoresceïne gelabelde probe EBER
en oligo probe (d) T besturingselement op een Benchmark in situ hybridisatie
systeem (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ). Immunohistochemische vlekken voor EBV LMP1 en LMP2 eiwitten werden uitgevoerd zoals eerder beschreven [52] met citraat antigeenterugtrekking en CS1-4 cocktail van monoklonale antilichamen van muizen tegen LMP1 (1: 100, Dako, capinteria, CA) en de E411 rat monoklonaal antilichaam tegen LMP2 (1 mg /ml, Asencion, München, Duitsland). Paraffine secties van EBV-gerelateerde Hodgkin lymfoom en post-transplantatie lymfoproliferatieve aandoening dienden als positieve controles
Immunohistochemische analyse van de EBV replicatieve eiwitten BMRF1 en BZLF1 werd uitgevoerd met behulp van anti-BMRF1 kloon G3-E31 ​​(1:. 200 verdunning, Research Diagnostics Inc., Flanders, NJ) en anti-kloon BZLF1 BZ.1 (1:25 verdunning, Dako, Carpinteria, CA), terwijl menselijk PTGS2 (informeel genoemd cyclooxygenase-2, COX2) werd bepaald met behulp van anti-COX2 monoklonaal antilichaam ( 1: 200 verdunning, Cayman Chemical). Secties werden geïncubeerd met primair antilichaam gedurende 30 minuten bij 37 ° C voor de EBV targets of bij 4 ° C overnacht voor COX2 via de blokkering en detectie protocollen in de Super-Sensitive Niet biotine HRP Detection Kit (BioGenex). Gebonden antilichaam werd gedetecteerd met chromogeen diaminobenzidine (BioGenex) en cellen werden tegengekleurd met hematoxyline (Dako). Paraffinesecties van orale harige leukoplakie diende als een positieve controle voor lytische EBV, terwijl reactieve tonsillen en nasofaryngeale carcinomen weefsels dienden als controles voor COX2 vlekken. De resultaten werden geïnterpreteerd door microscopische scoren van maligne cellen in ≥10 velden 400x vergroting hetgeen een gemiddelde percentage score (0 = geen, 1 = < 1%, 2 = 1-10%, 3 = 10-33%, 4 = 33 -66%, 5 = > 66% van de cellen) en intensiteit score (0 = geen, 1 = zwak, 2 = midden, 3 = sterke kleuring). Totaalscores werden vergeleken EBV positief versus negatief
tumoren met behulp van een Mann-Whitney ongepaarde t-test.
Detectie van EBV genoom
een batterij van kwantitatieve real-time PCR (Q-PCR) assays gericht zes ongelijksoortige gebieden van het EBV-genoom werd gebruikt om aan te tonen dat virale infectie van cellen AGS geslaagd. Geamplificeerde producten werden gedetecteerd met behulp van de ABI Prism 7500 Real-Time PCR instrument met Sequence Detection System software (Applied Biosystems) zoals eerder beschreven met behulp van primers gericht op de BamH1W
, EBNA1
, LMP1
, LMP2
, en BZLF1
regio's van het EBV-genoom [52] of EBER1
DNA [53]. Om te controleren op amplicon verontreiniging, elke run bevatte ten minste twee "geen template" controles waarin nuclease-vrij H2O werd vervangen template.
Low Density cDNA microarray-analyse
RNA werd geïsoleerd uit AGS en AGS-B95- hygB cellen met behulp van de RNeasy RNA Mini Kit (Qiagen) na het eerste gebruik van de Qiashredder ™ spinkolom (Qiagen) om de cellen te lyseren. Na bevestiging van RNA integriteit met behulp van een Agilent Bioanalyzer, werd expressie microarray analyse uitgevoerd door SABiosciences Corporation (Frederick, MD) met behulp van hun GEArray Q-serie Human Signaaltransductie in Cancer Gene Array. Deze lage-dichtheid microarray bestaat uit 96 probes die activering van 15 signaaltransductie routes betrokken bij oncogenese testen. (Target transcripten zijn opgenomen in resultaten.) Biotine gelabelde cDNA bereid uit 10 ug van elk RNA-monster met behulp van de LPR AmpoLabeling-methode (SABiosciences) werd gehybridiseerd aan de array en chemiluminescerende detectie werd uitgevoerd met een CCD-camera. Geïntegreerde rauwe intensiteit waarden voor elke spot werden gegenereerd door GEArray Analysis Suite software (SABiosciences), en verdere analyse en normalisatie werd uitgevoerd met behulp van Microsoft Excel. De laagste spot intensiteitswaarde op elke array werd als achtergrond en werd afgetrokken van elke ruwe intensiteitswaarde voor elke probe, en vervolgens ter intensiteiten werden genormaliseerd tot die van het huishoud-gen, glyceraldehydephosphate dehydrogenase (GAPDH
). Een paarsgewijze vergelijking van genexpressie niveaus gemaakt tussen het EBV-positieve cellen (AGS-B95-hygB) en ouderlijke EBV-negatieve AGS cellen. Als de verhouding was ≥2 of ≤0.5, werd het gen geacht te zijn opgereguleerd of neerwaarts gereguleerd in geïnfecteerde cellen.
SYBR Green Semikwantitatieve RTPCR Belgique Om geselecteerde microarray genexpressie resultaten te bevestigen, werd RTPCR uitgevoerd met behulp van Real-Time RT 2 genspecifieke PCR primers (SABiosciences). De ReactionReady ™ First Strand cDNA Synthesis Kit (SABiosciences) werd gebruikt om 3 ug RNA te converteren tot cDNA en het cDNA werd verdund 1:10 voor PCR analyse. De volgende 38 cDNAs waren gericht: GAPDH, A2M, ABCB1, BCL2L1, BIRC1, BIRC2, BIRC3, EN1, GADD45, HIF1a, ID2, IGFBP3, BRCA1, TMEPAI, IRF1, BCL2, BMP4, CDKN2A (p16), FN1, HK1, ICAM1, IL2, CCND1, MDM2, COX2 (PTGS2), TFRC, WISP1, TRAF1, CDK2, VCAM1, CDKN2C (p18), CDKN1A (p21), DUSP1, HSP70, NFKB1, TNFSF10, TRIM25
en FOSL1
. Reacties werden uitgevoerd in een totaal volume van 25 ul met 1X TaqMan ® Universal Mix (ABI), RT 2 gen-specifieke primer set mix (10 uM van elke primer, SABiosciences), 2,5 pi 5x SYBR groene oplossing ( Molecular Probes, Eugene, OR), en 5 ul cDNA template. Thermocycling omstandigheden waren: 50 ° C gedurende 2 minuten, 95 ° C gedurende 10 minuten en 40 cycli van 95 ° C gedurende 15 seconden en 60 ° C gedurende 1 minuut op een ABI 7500 instrument Sequence Detection System software (Applied Biosystems). Dezelfde drempel werd gebruikt voor elk gen en plaat geëvalueerd door de "Relatieve kwantificering Plate" protocol. Elke PCR-reactie werd uitgevoerd in triplo voor elk monster op twee afzonderlijke 96-putjesplaten en de resultaten werden gemiddeld relatieve verschillen in elk gen expressieniveau in de EBV-positieve versus
EBV-negatieve cellijn.
Minor bepalen groef-binder Probe semikwantitatieve RTPCR Belgique Om expressie van vijf geselecteerde genen die niet op de hierboven beschreven microarray waren evalueren werden semi-kwantitatieve RTPCR assays uitgevoerd (assays-on Demand, Applied Biosystems) onder toepassing van kleine groef-bindende probes gericht helicase-achtige transcriptie factor (HLTF
), trefoil factor-1 (TFF1
), basic-leucine zipper ATF-achtige transcriptiefactor (BATF
), remmer van DNA-bindend eiwit-4 (ID4
), en nucleostemin (NU
). Deze vijf werden geselecteerd omdat ze naar verluidt verstoord bij een aanzienlijk deel van de maag adenocarcinomen of EBV-gerelateerde kanker [32, 54-59]. GAPDH
diende als endogene controle voor relatieve kwantificatie doeleinden. RNA werd omgezet in cDNA met behulp van de High Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems) en het cDNA werd verdund 1:10 met nuclease-vrij water. Elke 50 ul PCR reactie bevatte: 1X TaqMan ® Universal Master Mix, 1X Target genexpressie test of GAPDH
endogene controle mix, en 10 pi cDNA. Om te controleren op amplicon besmetting, iedere uiting assay op elke plaat bevatte ten minste twee "geen template" controles waarin nuclease-vrij water werd vervangen door sjabloon. Thermische cycli voorwaarden en gegevensanalyse werden zoals hierboven beschreven voor de SYBR Green RTPCR.
Demethylering Behandeling sequentiebepaling van bisulfiet-gemodificeerd DNA Belgique Om het effect van demethylering bestuderen de AGS en AGS-B95-hygB maagkanker cellijnen waren gekweekt tot 75% confluentie en vervolgens gedurende drie opeenvolgende dagen 1 uM van verse 5-aza-2'-desoxycytidine (5aza; Sigma) werd dagelijks toegevoegd. Op de vierde dag, RNA en DNA werden geoogst van behandelde en onbehandelde culturen. RNA werd beoordeeld op genexpressie en DNA werd onderzocht op methylering na natriumbisulfiet behandeling (EZ DNA methylatie Kit, Zymo Research, Orange, CA) met ongemethyleerde cytosines converteren naar uracil, terwijl gemethyleerde cytosinen ongewijzigd [60]. De positieve controle was CpGenome Universal gemethyleerde DNA (Chemicon) onderworpen aan dezelfde bisulfiet conversie en controle primers gericht op de C8orf4
cellulair gen promoter bevestigd succesvolle bisulfiet conversie van elk DNA-monster [61]. CpG eilanden werden geïdentificeerd met behulp van CpG Perceel voor elk van de vijf menselijke genes-- ICAM1
(RefSeq # NM_00201), CDKN2A (p16)
(RefSeq # NM_000077.3), ID4
(RefSeq # NM_001546), COX2
(RefSeq # NM_000963), en TFF1
(RefSeq.225,2) - waarvan promotor sequenties (3000 basenparen stroomopwaarts van de transcriptie start site via exon 1) van GenBank werden gedownload. De volgende parameters voor CpG eiland identificatie gebruikt: minimale lengte van 200 bp, minimale gemiddelde percentage C + G van 50%, en minimale gemiddelde verhouding waargenomen verwachte C + G van 0,6 [62]. Om CpG dichte gebieden voor COX2 Kopen en TFF1
identificeren, werd de minimale lengte parameter verminderd tot 50 bp [61]. Primersequenties worden getoond in Tabel 1. Elke 50 ui PCR reactie bevatte: 1X PCR-buffer, 2 mM MgCl 2, 1 eenheid Platinum Taq DNA Polymerase (Invitrogen, Carlsbad CA), 0,2 mM dNTPs (ABI) en 30 pmol van elke primer. Thermocycling omstandigheden waren: 94 ° C gedurende 2 minuten, 40 cycli van 94 ° C gedurende 30 seconden, 55 ° C gedurende 30 seconden en 72 ° C gedurende 1 minuut, 72 ° C gedurende 10 minuten. Om amplicon besmetting te controleren, elke run bevatte een "geen template" controle waarbij nuclease-vrij water werd vervangen door templateTable 1 bisulfiet Oud Gene-Specifieke PCR Primer Sequences
ICAM1

Forward
5'-TGG GGG TTG TGG TTT TAG TT-3 '
Reverse
5'-CTC CCT CCA CTA AAA AC-3'
Amplicon formaat
412 bp
CDKN2A (p16)
Forward
5'-AGA TGT TTT GTG GTT GTT GTG A-3 '
Reverse
5'-CAA AAA TCT TCC ATT CTT CAA AC -3 '
amplicongrootte
418 bp
ID4
Forward
5'-TTT TTT GGG TAT ATA TTA GTT TGG-3'
Reverse
5'-TAT CCT AAT CAC TCC CTT C-3 '
amplicongrootte
477 bp
Cox2
Forward
5'-TAT GTG TTG TAT ATA GAG TAG A-3'
Reverse
5'-AAA AAA TAA TCC CCA CTC TC -3 '
amplicongrootte
399 bp
TFF1
Forward
5'-TTA GGT TGG AGT GTA GTA GG-3'
reverse
5'-CCT ACT CAT ATC TAA AAA ACC C-3 '
amplicongrootte
489 bp
C8orf4 controle
Forward
5'-GAA TTA AAA TAT AAG GAG AGT TTT-3 '
Reverse
5'-AAC ATT ACC CAA ACA TAA AAC AA-3'
amplicongrootte
328 bp
Sequencing werd uitgevoerd op amplicons van bisulfiet behandeld templates te identificeren de gemethyleerde en niet-gemethyleerde CpGs met of zonder 5aza behandeling. Eerst werd elk PCR product gekloneerd in pGEM-T vector met de pGEM-T Easy-vector II (Promega) en getransformeerd in JM109 hoge efficiëntie competente cellen. Witte kolonies die inserties bevatten werden geselecteerd en overnacht gekweekt en plasmide DNA werd geëxtraheerd met behulp van de Qiaprep Spin Miniprep Kit (Qiagen). Sequencing werd uitgevoerd op een ABI 3100 Genetic Analyzer met behulp van de ABI PRISM ™ BigDye ™ Versie 1.1 Terminator Cycle Ready Reaction Kit met AmpliTaq DNA polymerase en een M13R3 primer. De resultaten werden gedownload in Sequencher software (Gene Codes, Ann Arbor, MI) om de keerzijde compliment van elke sequentie te verkrijgen en zowel vooruit als achteruit sequenties werden uitgelijnd en geanalyseerd om niet-gemethyleerd cytosines onderscheiden van gemethyleerde cytosines.
Western Blot op de AGS cellijn
Vanwege het potentieel voor Cox2 remmers te COX2 effecten te overwinnen, de op RNA gebaseerde resultaten voor Cox2 werden gekozen voor de follow-up studie aan de eiwit-niveau. Confluente AGS cellen met of zonder EBV werden geoogst met 0,25% trypsine, tweemaal in fosfaatgebufferde zoutoplossing gewassen en gepelleteerd door centrifugeren. Cellen werden geresuspendeerd in 500 ul NP-40 cell lysis buffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1% NP-40, pH 8,0), geïncubeerd op ijs gedurende 30 minuten en gecentrifugeerd bij 12.000 rpm gedurende 15 minuten bij 4 ° C. Hoeveelheden van lysaat (50, 100, 150 ug proteïne per putje) werden gescheiden met behulp van SDS-PAGE op een Tris-glycine 4-20% gradiënt gel (Invitrogen) en overgebracht op een nitrocellulosemembraan. COX2 werd gedetecteerd met een 1: 5000 verdunning van het monoklonale antilichaam volgde een 1: 10.000 verdunning van secundair antilichaam geconjugeerd met alkalische fosfatase (Amersham Biosciences), en visualisatie met een Typhoon PhosphorImager (Molecular Dynamics). Band dichtheid gemeten semi-kwantitatief en genormaliseerd naar beta actine (ACTB) werd vergeleken tussen besmette en niet-geïnfecteerde cellen AGS.
Resultaten
EBV-infectie van AGS maagkanker Cellen
Succesvolle EBV-infectie van AGS maagkanker cellen werd bevestigd met behulp van zes Q-PCR assays gericht uiteenlopende segmenten van het EBV-genoom. EBER
in situ
hybridisatie toonden geen EBER
uitdrukking in het ouderlijk "EBV-negatieve" AGS cellen, terwijl meer dan 90% van de AGS-B95-hygB cellen werden EBER
-positieve en had geactiveerd -appearing nucleaire morfologie (figuur 1). De proliferatie tarief werd verhoogd zoals getoond door samenloop van gekweekte AGS-B95-hygB cellen drie dagen voorafgaand aan de ouderlijke AGS cellen. De infectie gedurende ten minste 4 maanden, zoals blijkt uit GFP en EBER
histochemische vlekken. EBV latent (LMP1 en LMP2A) en lytische (BZLF1 en BMRF1) eiwitten werden niet tot expressie gebracht in niet-geïnfecteerde AGS cellen, terwijl ~ 10% van de geïnfecteerde cellen tot expressie LMP1, de helft van de cellen tot expressie LMP2A, en ~ 35%, uitgedrukt BMRF1 en BZLF1 eiwitten impliceren actief virale replicatie (figuur 1). Figuur 1 AGS-B95-hygB cellen brengen latente en lytische virale genen. A) Immunohistochemische kleuring voor GFP suggereert hygromycine-B AGS behandelde cellen werden gelijkmatig geïnfecteerd door de kunstmatige B95.8 EBV genoom. B) EBER in situ
hybridisatie geeft aan latente infectie in > 90% van de cellen. Nuclear EBER
kleuring spaart de nucleoli en vergrote nucleoli zijn een marker van cellulaire activatie. Latente virale eiwitten LMP1 (C) en LMP2 (D) werden focaal expressie. Lytische virale eiwitten, BMRF1 (E) en BZLF1 (F), werden tot expressie gebracht in een significante fractie van AGS-B95-cellen hygB. (GFP en BMRF1 vlekken, 800x, LMP1, LMP2, EBER
en BZLF1 vlekken, 1200x)
Cellular Gene Expression Verschillen in EBV-positieve versus EBV-negatieve AGS Cells
Expressie niveaus van 96 cellulaire genen werden geanalyseerd in AGS en AGS-B95-cellen met behulp hygB lage dichtheid microarray-analyse met chemiluminescente detectie (figuur 2). Na normalisatie naar GAPDH
, paarsgewijze vergelijking van genexpressie tussen de EBV-positieve EBV-negatieve AGS cellen onthulde dat 96 van de genen op de microarray, 43 werden ontregeld tenminste tweevoudig na EBV infectie. Verrassend, een EBV-geassocieerde toename in expressie werd waargenomen voor slechts 6 genen (IGFBP3
, GADD45, IRF1, grp78 /HSPB1, GLUT1 /SLC2A1, TMEPAI
), terwijl de verminderde expressie werd waargenomen voor de resterende 37 ontregelde genen (ABCB1, BCL2L1, BIRC2, BMP2, CDKN2A, DUSP1, HIF1a, ICAM1, ID2, NFKB1, COX2, TFRC, VCAM1, WISP1, TRIM25, IL2, BMP4, MDM2, CCND1, CDK2, BAX, p57, p19, CSN2, CXCL9 , IL4, juni, KLK3, LTA, MMP7, PPARg, TNFRSF10B, WIG1, WNT2, PTCH2
). Figuur 2 Genexpressie patronen worden veranderd door EBV-infectie van AGS cellen. Biotine gelabelde cDNA probes gerangschikt in viervoud op een nylonmembraan hybridiseren met RNA geïsoleerd uit AGS en AGS-B95-cellen hygB. Chemiluminescerende signalen geven ontregeling van geselecteerde genen onder de 96 in de array ten opzichte van controle genen in de laatste twee rijen.
SYBR Green RTPCR werd gebruikt om de microarray resultaten controleren 26 van de ontregelde genen en voor 12 extra genen waarin geen significante verandering werd waargenomen op de microarray. Meer dan tweevoudige verandering in mRNA in geïnfecteerde versus
geïnfecteerde cellen werd gevonden 16/26 genen (Tabel 2). De genen die het sterkst getroffen waren IGFBP3
die werd opgereguleerd door 42-voudig, en COX2, BMP4 en ICAM1
die werden neerwaarts gereguleerd door de 35-, 32-, en 22-voudig, respectievelijk. De overige tien-microarray gebaseerde veranderingen werden niet bevestigd door RTPCR suggereert dat EBV gerelateerde ontregeling van deze factoren lager dan tweevoudig. In één geval was er een grote discrepantie: Expressie niveaus van BCL2L1
door middel van microarray-analyse toonde een tweevoudige afname
in geïnfecteerde cellen, terwijl RTPCR herhaaldelijk toonden een vervijfvoudiging
in BCL2L1
mRNA niveaus in geïnfecteerde cellen. Minder dramatische verschillen werden gevonden bij een extra 12 genen werden geanalyseerd door RTPCR, met significant (> 2-voudig) veranderingen in de expressie van genen 5/12 waarvoor geen verandering werd waargenomen op de microarray (tabel 2) 2 .table genen dysregulated in EBV-positieve AGS Cells
Gene Name
Gene Symbol
Vouw Change *
neerwaarts gereguleerd Genes
basic leucine-zipper transcriptiefactor, ATF-achtige
BATF
-38
cyclooxygenase-2
Cox2
-35
botmorfogeen eiwit-4
BMP4
-32
intercellulaire adhesie molecuul-1
ICAM1
-22
trefoil factor-1
TFF1
-21
remmer van DNA-bindende-2
ID2
-14
heat shock protein-70
HSP70
-10
cycline-afhankelijke kinase-2
CDK2
-9
cycline-D1
CCND1
-9
hypoxia induceerbare factor-1A
HIF1a
-9
borstkanker-1
BRCA1
-7
nucleostemin
NU
-7
cycline-afhankelijke kinase-remmer-2A
CDKN2A /p16
-6
remmer van DNA-bindende-4
ID4
-6
spikkelspanner-1
EN1
-5
ATP-bindende cassette, sub-familie B, lid 1
ABCB1
-3
MDM2 p53-eiwit
MDM2
-3
opgereguleerd Genes
insulin-like growth factor binding protein-3
IGFBP3
40
tumor necrose factor-receptor geassocieerde factor-1
TRAF1
20
transmembraan prostaat androgeen-geïnduceerde eiwit
TMEPAI
10
tumor necrosis factor, superfamilie lid-10

• Detectie van promotor hypermethylering van het CpG eiland van E-cadherine in de maag cardiale adenocarcinoma
• Wijzigingen van lipide-profielen na een radicale gastrectomy bij patiënten met maag- cancer