Značilen želodca proteoma tekočine v raka želodca razkriva več bio-označevalce diagnostične profil

Značilen želodca proteoma tekočine v raka želodca razkriva več bio-označevalce diagnostično profil
Abstract
Ozadje
Skupni želodca preživetja raka še vedno slaba predvsem zato, ker ni zanesljive metode za ugotavljanje zelo ozdraviti bolezen v zgodnji fazi. Multi-protein profiliranje želodčnih tekočinah, pridobljen iz anatomskem mestu patologije, bi lahko razkrila diagnostične proteomskimi prstne odtise.
Metode
so Beljakovinski profile ustvarjene iz želodca vzorcev tekočin z dne 19. rakom želodca in 36 bolnikov benignih gastritides postopku izbirni, klinično -indicated gastroskopija pomočjo laserskega desorpcijo /ionizacijski časa z letom masne spektrometrije površinsko okrepili na več nizi ProteinChip. Proteomskimi lastnosti smo primerjali z analizo pomembnosti za mikromrež algoritma in dvosmerno hierarhično grozdenje. Drugi zaslepljen niz vzorca (24 želodčni rak in 29 klinično benigni gastritides) je bil uporabljen za potrditev.
Rezultati
Z pomena analysyis iz mikromrež so 60 proteomskimi funkcije up-urejena in 46 so navzdol urejena v vzorcih raka želodca (p
< 0,01). Multimarker povezovanje pokazala dva značilne proteomskimi profila neodvisno od starosti in narodnosti. Osemnajst od 19 vzorcev z rakom nagnetene skupaj (občutljivost 95%), medtem ko je 27/36 vzorcev nerakave združenih v drugi skupini. Devet nerakave vzorci, ki gručah z vzorci z rakom, vključenih 5 pre-malignih lezij (1 adenomatozna polip in 4 intestinalno metaplazijo). Validacija uporabo drugega vzorca videz pokazala občutljivost in specifičnost, da je 88% in 93% oz. Pozitivna napovedna vrednost kombiniranih podatkov je bila 0,80. Izbrano peptid zaporedja opredeljena pepsinogen C in pepsina A aktivacijski peptid kot močno navzdol regulirano in alfa-defenzin kot močno reguliran.
Zaključek
Ta preprost in ponovljive multimarker proteomske testom lahko dopolni klinično vrednotenje gastroscopic simptomatskih bolnikov, za povečanje diagnostična natančnost za raka želodca in pre-malignih lezij.
Ozadje
za razliko od drugih skupnih raka, prognoza za bolnike z rakom najbolj želodca je slaba in je izboljšala le malo v zadnjih nekaj desetletjih. Petletna stopnja preživetja za raka želodca so bistveno nižja od vseh večjih raka, razen raka jeter, trebušne slinavke in požiralniku [1]. Glede na to, da ima raka v zgodnji fazi želodca veliko boljšo prognozo (5-letno preživetje približno 90%) kot napredovalega raka želodca (5-letno preživetje 3-10%) [2, 3], globalna umrljivost zaradi raka želodca bi bistveno zmanjšala za ukrepi, ki izhajajo iz downstaging tumorjev v času prvotne diagnoze.
Čeprav gastroskopija je zlati standard za želodčne diagnozo raka, njegova natančnost ni tako visoka, kot je za benignih želodčnih bolezni, kot so želodčne razjede, zlasti v geografskih regijah nizke do srednje želodca razširjenosti raka. Odstotek neodgovorjenih diagnozo raka, poroča kot 4,6%, 14% in celo 33% [4-6], ni nepomemben. Tudi na Japonskem, so poročali, da je 19% lažno negativne stopnje [7]. Ti podatki so skladni s pozitivno napovedno vrednost le 0,4-0,7 za endoskopsko diagnostiko raka želodca v različnih centrih [8-10]. Čeprav se zdi, delež zamujenih diagnoz majhen, absolutno število bolnikov zanikal ugodnost diagnozo na ozdravljivega fazi ni zanemarljiv. Tudi na zmerno nizko lažno pozitiven diagnostično stopnji 5%, bi več kot 47.000 želodčni rak so zamudili v samo eno majhno državo razširjenosti (ZDA) v enem letu 2000 [11]. Endoskopska ocena pogosto vključuje sluznice biopsije ni pa kliničnimi standardi za bodisi optimalnega števila biopsij ali anatomskih regij, ki jih je treba v vzorec. Ki se običajno navedena priporočilo je, da se vsaj sedem biopsije pravilno diagnozo raka želodca [12]. V tej študiji pa se je štelo, benigna na endoskopijo celoti 17% vseh poškodb pozneje pokazalo, da so maligne. Tako, endoskopski pregled sluznice trpi zaradi razlike med opazovalca, neoptimalne povezavi z histopatologijo, težave pri odkrivanju Submukozno raka in neoviran vizualizacijo vseh anatomskih podobmočij npr . Po prejšnjem operaciji želodca [13, 14]
želodca tekočina sestoji iz mešanice izločajo topni in listasti celičnih proteinov iz celotne želodčne sluznice - tudi regije, ki jih ni mogoče ustrezno oceniti z fibreoptic gastroskopijo. Zato obrazloženo, da proteomskimi profil želodčni tekočini, navadno obravnavati kot odpadek stranskih proizvodov med gastroscopic pregledu lahko koristno dopolnjujeta običajne klinično vrednotenje z zagotavljanjem "molekularno biopsijo", ki učinkovito vzorcev celotno želodčne sluznice, zlasti kot tehnik odkrivanja protein takšnih kot masne spektrometrije lahko zelo občutljive. Če se izvede med klinično navedenega gastroskopijo, pridobivanje želodčne tekočine ne poveča invazivnosti postopka. Za razliko od plazemskega proteoma želodca proteoma tekočina verjetno manj kompleksna, vendar obogaten biomarkerjev za posamezne bolezni, pri čemer nastane neposredno na mestu bolezni. Isti biomarkerjev, tudi če je prisoten v plazmi, lahko razredčimo izven meja detekcije in zmešamo z drugimi bolj vodnatih sistemskih proteinov, ki odražajo sočasne patofiziološke pogoje (npr hkratnimi bolezni), namesto da anatomsko site-specific bolezni.
raziskali smo nov pristop k razvoju biomarkerjev za rakom želodca s profiliranjem topne izloča peptide prisotna v endoskopsko vdihne želodčni tekočini in beljakovin, pridobljen iz listasti epitelnih celic, izterjanih tudi med endoskopijo s površinsko okrepljeno laserska desorpcija ionizacijski čas za letom (SELDI TOF), masna spektrometrija. Naši rezultati kažejo, da več beljakovin biomarkerjev od vira organe specifično tj želodčne tekočine, ustvarjajo značilen želodčne podpis raka, ki zasluži nadaljnji razvoj kot orodje za izboljšanje diagnostično natančnost gastroskopijo in ima potencial za odkrivanje zgodnji fazi raka želodca in pre-maligne lezije (intestinalno metaplazijo in displazija).
Metode
Klinični vzorci
želodcu tekočine so bili pridobljeni med gastroskopijo prenočitev postili bolnikov vidimo v Splošni bolnišnici v Singapurju. Protokol študije je odobril Odbor za etiko Splošne bolnišnice Singapurju. in skladna z določbami Helsinški deklaraciji so bili 1995. Indikacije za gastroskopijo samo klinične in so bile neodvisne študije. Začetna analiza je bila opravljena na učni množici 19 vzorcev iz histološko dokazano želodca adenokarcinome (13 črevesne tipa, 4 difuzni tip, 1 mešanega tipa, 1 nedoločenih) [15] in 36 vzorcev, pri bolnikih s klinično benignih razjed pogoji. Povprečna starost 19 bolnikov želodca z rakom (13 moških, 6 žensk, 17 kitajskih, 2 indijski) je bila 68 let. Porazdelitev po Skupni odbor ameriškega o raku (AJCC) klinični uprizoritev je bila stopnja 0 (1 bolnik), faza I (4 bolniki), stopnja II (2 bolnika), faza III (2 bolnika) in faza IV (10 bolnikov). Povprečna starost 36 bolnikov z benignih razjed pogojih (19 moških, 17 žensk, 33 kitajskih, 2 Malajski, 1 indijski) je bila 57 let. sta klinične diagnoze po endoskopijo bolnikov nerakave normalno (9), antralnih gastritis (9), gastritis (6), ulkusa (4), hiatusna kila (3), hiperplastičnih polipi (2), požiralnik Barrettovega (1), fundic brazgotina (1) in adenomatozna polip (1).
algoritem klasifikaciji razvil iz nabora usposabljanja je bil testiran s slepo analizo niza validacije, ki sestoji iz drugega 24. histološko potrjeni želodčne adenokarcinomov (10 črevesne tip, 7 vrsta difuzna, 1 mešano Tip, 5 nedoločeno, 1 nevroendokrini) in 29 klinično benignih želodčnih vzorci. Povprečna starost teh 24 bolnikov želodca z rakom (18 moških in 6 žensk,; 21 kitajskih, 3 Malay) je bil 70 let. Porazdelitev po AJCC klinični uprizoritev je bila faza I (5 bolnikov), stopnja II (4 bolniki), faza III (2 bolnika) in faza IV (12 bolnikov). En bolnik v nizu potrjevanja zmanjšala nadaljnje preiskave in jih ni bilo mogoče uprizorjena. Povprečna starost 29 bolnikov nerakave (11 moških, 18 žensk, 26 kitajskih, 2 indijskih, 1 Malay) je bila 47 let. Klinična diagnoza po gastroskopijo bolnikov nerakave bili gastritis (14), polipi fundic žleze (2), akutna poškodba želodčne razjede (2), duodenitis (2), hiatusna kila (1) in normalno (8).
Noben bolnikov z rakom želodca prejela kakršno koli obliko zdravljenja raka v času gastroskopijo.
ob primerih usposabljanja in potrjevanja skupaj, 19% (8/43) in 29% (19/65) bolnikov z rakom želodca in benigno želodca pogoji, oziroma, je bilo pozitivnih na H. pylori
, s to razliko, da ni bilo pomembne, Fisherjev test, (2-sided p
vrednost = 0,4508).
zbiranje in obdelovanje vzorcev
je želodčna tekočina Sesalni v sterilno posodo na začetku endoskopije, dodeli anonimizirani kodo in takoj damo na led. Krvno ali žolčne obarvajo vzorci so bili zavrnjeni. Samo klinično sumljive poškodbe sluznice biopsijo pri presoji endoscopist. Želodčne tekočine smo centrifugirali pri 180 g 6 minut pri 4 ° C, iz katerega je bil supernatant spet centrifugiramo pri 16 100 g 30 minut pri 4 ° C. Peleti iz obeh centrifugations združimo. Supernatante za visoke hitrosti bili shranjeni ločeno od peletov pri -80 ° C.
Protein profiliranje
Po odtajanju smo 10 ul vsakega želodca vzorcu tekočine uporabljajo za različne kemične površine ProteinChip nizi (Ciphergen Biosystems Inc., Kalifornija , ZDA): (a) bakrov (II) Imobilizirana kovinska afinitete za prestrezanje (IMAC3) v prisotnosti 100 ul z 1 mol sečnine /L, 1 g /L 3 - [(3-holamidopropil) dimethylammonio] -1-propansulfonata ( kavbojke), 0,3 mol /l KCl, inhibitor proteaze cocktail (Roche Diagnostics, Mannheim, Nemčija), 50 mol /L TrisHCI, pH 7,5; (B) Slab Kationska Exchange (WCX2 in CM10) v prisotnosti 100 ul v 50 mmol /L natrijevega acetata, 1 g /L oktil glukopiranozida, zaviralca proteaz koktajl, pH 5; (C) Močan anionske izmenjave (SAX2) v prisotnosti 100 ul 50 mmol /L TrisHCI, 1 g /L CHAPS, inhibitor proteaze koktajl, pH 8; in (d) hidrofobno interakcijsko (H50) v prisotnosti 100 ul v 5 ml /L trifluorocetne kisline. Po spiranju z 100 ul istih zadevnimi pufri, dodamo sinapinic kislino olajša desorpcijo in ionizacijo. Čipi so bili analizirani s SELDI-TOF-MS (PBSII, Ciphergen Biosystems Inc). Raka in kontrole so pomešana in teče vzporedno na istem čipu in na več čipov za zmanjšanje čip na čip razlike.
Želodčni pelete tekočine smo ponovno suspendirali v 25 ul od 6 mol /L gvanidin tiocianata, 5 g /L oktil glukopiranozid, 0,1 mol /L Hepes pH 7, in 100-200 ul 9 mol sečnine /L, 2 g /L CHAPS, 50 mmol /L TrisHCI, pH 7,5, ki jih vrtinčimo 45 minut pri 4 ° C. Po centrifugiranju pri 20 000 g pri 5 minutah je bila uporabljena 10 ul ekstrakta za ProteinChip nizi, kot je opisano zgoraj.
A retentata zemljevida bila pripravljena v kateri so posamezni proteini prikazana kot ločeni vrhove na osnovi njihove mase za polnjenje razmerje . Podatki o proteomskimi spektrov smo analizirali s Ciphergen Express Data Manager Software s Pattern progi in dvosmerno hierarhično grozdenje algoritem. Usklajena vrhovi s signalom razmerij hrupa nad 3 smo normalizirali s popolnim tokom. Proteomskimi lastnosti so še dodatno analizirali z analizo pomena mikromrež programske opreme (SAM), Stanford University. Paket je bil zasnovan za reševanje težav, ki so značilne za analizo podatkov mikromrež (signal šum variance razlikuje od gena do gena, velikega števila podatkovnih točk od majhnega števila vzorcev), vendar smo ugotovili, da se uporablja za proteomske analizo podatkov, kot tudi. Algoritem programske opreme je opisal Tusher sod
. [16]. Na kratko je opredeljena meritev se imenuje relativna razlika za merjenje razlike med dvema ali več skupin podatkov namesto p
vrednosti. Je zaposlenih spremembo načina zaženejo in večkrat razdeljen dano podatkovni niz (spektre vsebuje proteomskimi funkcije v tej študiji) naključno v dve skupini za izračun relativno razliko za vsako od permutacij. Število permutacij je bil določen, da bo 1000 v tej študiji in programsko opremo, izračunana 1000 relativna razlika vrednosti za vsako proteomske funkcijo. Relativna razlika v posebne skupine interesa (opaziti relativno razliko) je bila v primerjavi s povprečno relativno razliko od vseh permutacij (predvidoma relativna razlika) za vsako funkcijo in funkcijo je bilo ocenjeno, da je navzgor ali navzdol regulirano glede na to, ali svoje opazovana relativna razlika je bila večja ali manjša od njegove pričakovane relativne razlike v nekaterih pragom. Programska oprema ocenjen lažno stopnjo odkrivanja (opredeljeno tudi v literaturi [16]) za vsako mejne vrednosti, ki določa posreden način, da nastavite cutoff. Označevalci ugotovljena po tej metodi so bile statistično značilne. Lažni stopnja odkritje je bila nastavljena na manj kot 0,05 v tej študiji.
Za potrditev označevalcev, ki jih SAM, so druga serija 53 slepih vzorcev dodamo v nabor podatkov za hierarhično grozdenje s programom Manager Ciphergen Express podatkov. Medtem ko je bilo pričakovati, so znani vzorci s SAM, ki se uporabljajo za izbiro oznake opravljati tudi v grozdenja, so bili vključeni slepi vzorci za test, kako dobro so označevalci posplošiti na neznanih vzorcih. Rezultati grozdenja so preprosto primerjajo prave identitete vzorcev in ne napredne metode razvrščanja ali katero koli drugo programsko opremo, je bila uporabljena v potrditev. Identifikacija
Biomarker
želodca beljakovin tekočin frak s kromatografijo anionsko izmenjalno (Q HyperD , Ciphergen Biosystems Inc.), s pomočjo stopenjsko spremembe v pH za izpiranje. Beljakovine v 50 mmol /L TrisHCI, 1 g /L oktil glukopiranozida je bilo pH 8 eluenti dodatno očistili na kationsko izmenjalno paleto a (LWCX30) z 50 mmol /L natrijev acetat, 1 g /l oktil glukopiranozid, pH 5 kot zavezujoče in pranje buffer. Po dodatku alfa-ciano-4-hidroksicimetne energija kislina absorpcijo molekul (Ciphergen Biosystems Inc.), so bili zadržani proteine ​​analizirali s PBSII in Q-TOF (Waters /MICROMASS) opremljen z vmesnikom ProteinChip (PCI 1000, Ciphergen Biosystems Inc.) . Beljakovine so značilni MS /MS razdrobljenost in identifikacija je bilo izvedeno z iskanjem baze podatkov z maskoto (Matrix Science Ltd., London, Velika Britanija).
Potrditev Biomarker
Ta je bila izvedena v tretji seriji vzorcev želodčne tekočine, vzeta iz benigna želodca in bolniki z rakom želodca. Vsak sveže zbrani vzorec je bil obdelan, da odstranimo trdne naplavin in usmeriti vsebnosti beljakovin, kot sledi. Po dodajanju fen fluorid do končne koncentracije 0,2 mM, smo vzorec centrifugirali 15 minut pri 500 g in 4 ° C. Proteaznih inhibitorjev (popoln Mini ™, Roche Applied Science, Indianapolis, IN, ZDA) smo dodali supernatantu sledila centrifugalne membransko filtracijo na 2 900 g in 15 ° C (Amicon Ultra-4 centrifugalna filter naprava, 5 000 nominalna omejitev molekulske mase; Millipore, Billerica, MA, ZDA), dokler vzorec, se je zmanjšal za 10 - 20% svoje prvotne prostornine. Skupna koncentracija proteina določimo z 2-D Quant Kit (Amersham Biosciences, Pisctaway, NJ, USA). Pepsinogen C in alfa-defenzin 1-3 koncentracije smo določili z encimsko vezan imunološki (ELISA) z uporabo kompletov iz Alpco diagnostiko (Salema, NH, ZDA) in Hycult biotehnologije B.V. (Uden, Nizozemska), oz. Vsak obdelani vzorec smo analizirali v dveh izvodih za pepsinogen C in ravni defenzin uporabo protokolov dobavitelji. Vzorci za pepsinogen C testu so bile predhodno razredčili 120-krat. Koncentracije pepsinogen C in alfa-defenzin 1-3 so bile pridobljene s sklicevanjem na njihove standardne krivulje in izražene kot ng (pepsinogen C) ali pg (defenzin) na mikrogramov celotnega želodca beljakovin tekočine.
Helicobacter pylori
prisotnost H. pylori
v želodcu tkivih so označene z vizualizacijo spiralnih mikroorganizmov v histoloških oddelkov in /ali z imunohistokemijo. odseki štiri mikronov tkiva so de-voskom v ksilena in zmanjšuje razredov etanola. Antigen Preiskovalna je s segrevanjem v citratnem pufru, pH 6,0. Primarna protitelesa proti H. pylori
(1:50 razredčitve; DAKO A /S, Glostrup, Danska), je sledila sekundarna polimera protitelesa povezavo (Predstavljajte si Chem Mate, DAKO) je in prikaže z diaminobenzidine kot kromogena
. Rezultati
več pomikanje navzgor ali navzdol reguliran beljakovin biomarkerjev pri raku želodca so bile odkrite v želodčni tekočini. Predstavnik proteomskimi zemljevid želodčni tekočini je prikazano na sliki 1. To je pogled gel masnega spektra prikazuje želodčne proteine ​​tekočine selektivno vezani na imobiliziran bakrovega (II) kovinskih ionov v razponu molekulsko maso 1500 Da do 6000 Da. Pomembne proteinski markerji ugotovljeno, da so dol-urejeno v raka želodčni tekočini (p
< 0,01), so označene s puščicami. Slika 1 Izražanje razlika karta želodčne tekočine na baker (II) imobilizirana kovinski afiniteto za zajemanje ProteinChip matriko (IMAC3). Puščice kažejo proteinske biomarkerje bistveno različna nivoja ekspresije med obema skupinama vzorcev.
Reprezentativen proteomskimi zemljevid ekstrakta želodčne tekočine pelet je prikazano na sliki 2. Proteine ​​smo selektivno veže na kationsko izmenjalno diod površino. Pomembne najdenih proteinski markerji, da se navzgor ali navzdol, urejena v pelete želodčni rak tekočine (p
< 0,01), so označene s puščicami. Slika 2 Izražanje razlika zemljevid želodčne tekočine ekstrakta na kationsko izmenjalno ProteinChip paleto (WCX2). Puščice kažejo proteinske biomarkerje bistveno različna nivoja ekspresije med obema skupinama vzorcev
Povprečna CV. (Koeficient variacije, kumulativni 10-15 velikih želodčnih vrhov tekočin na spektra, n = 8) za imobiliziran bakrovega (II) ProteinChip matrika (IMAC3) je bila 12,8%, za izmenjavo kationov niz (WCX2) je bil 15%, za anionsko izmenjalno niz (SAX2) je bila 17,3%, za hidrofobno interakcijo čipa (H50) je bila 13,6%. Te CV vrednosti so v skladu z oceno obnovljivosti v SELDI literaturi [17, 18].
Sam analizo vseh proteomskimi funkcij (skupno število funkcij 41 800, povprečno število na zadrževalni karti 314) v želodčni tekočini in pelete ekstrakta je bilo 46 proteomskimi funkcije ugotovi, da je bistveno navzdol ureja rakom želodca in 60 proteomskimi lastnosti občutno so se regulirane z rakom želodca. (Podatki iz različnih razmerah, na primer, tekočine in pelete, kot tudi različnih površin, so preprosto združijo skupaj v različne funkcije za SAM. Označevanje s SAM so poročali tako na pelete in supernatanta frakcije so ročno opredeljene in predstavljajo le enkrat na seznamu, potem ko so bili šteje biološko pomembna). Občutno navzdol regulirane markerji vključenih 1884, 2428, 2594, 2840, 4050, 11720, 13700 Da; precej up-regulirane označevalci vključene 1761, 1831, 3372, 3443, 3605, 5160, 6780 Da. (Večina pomembnih označevalci so odkrili na WCX2 in IMAC-baker (II), ki mu sledi SAX2). Na podlagi 106 zelo različnih proteomskimi funkcij (Additional datotek 1), je bila izvedena dvosmerni hierarhično analizo gruče (dvodimenzionalna popolna povezava). Večini primerov želodca raka bili združeni, da tvorita značilno skupino (slika 3 in dodatno datoteko 2). Analiza glavna sestavina istih podatkov je tudi pokazala, da bi se rak in benignih vzorce ter ločimo v dve skupini, pri čemer 2 lažno negativen (predstavljajo podvojeni analizo istega primera) in 9 lažnih alarmov, oziroma (slika 4). En želodčni rak vzorec tekočine (iz primera stopnji I slabo diferencirano adenokarcinomom želodca) žive med vzorci nerakave; vsi ostali 4 zgodnji fazi (fazi 0 in I), bolniki pravilno zbrani z vzorci iz 14 bolnikih s stadijem II - IV raka želodca, kar je splošno diagnostično občutljivost 95% (18/19 bolnikov z rakom želodca) na učni množici. Slika 3 Expression razlika zemljevid želodčnih tekočin in pelete ekstrakta proteinov določenih vzorcih usposabljanja na štirih ProteinChip nizi, ki so prikazane v dvosmerni hierarhično grozdenje. Pomembne proteomskimi funkcije so prikazane navpično. Intenzivnost sivine kaže stopnjo relativne ravni proteina, višji ali nižji od srednjo vrednost. primeri bolnikov so predstavljene vodoravno; Večina bolnikov z rakom želodca so tesno združeni. Ta podatek kaže zgornji kvartil celotne slike (glej dodatno datoteko 2 za popolno sliko).
Slika 4 analizo glavnih komponent parcelo proteomskimi značilnosti trening določenih vzorcih. Ena sama ravnina (označen s črno črto) razdeli vzorce v dve skupini z 1 lažno negativno (prikazano v dvojnih mestih) in 9 lažnih alarmov.
Devet od 36 vzorcev nerakave v seriji za učenje žive z vzorci z rakom (specifičnost 75%). Od tega je 1 imel displastičnega adenomnih polip - v predrakave lezije [19]. Med drugim 8 bolnikov, 6 je klinično usmerjena biopsije, ki so se pokazale intestinalno metaplazijo pri 4 bolnikih (67%). Osem bolniki niso rakom, katerih želodca tekoča beljakovinska profili zbrani v normalni skupini, prav tako so klinično usmerjenega sluznice biopsije, ki je pokazala intestinalno metaplazijo samo pri 2 bolnikih (25%). Pregled 1000 zaporednih želodca biopsije opravljenih za vse indikacije je pokazala splošno razširjenost intestinalno metaplazijo v Splošni bolnišnici v Singapurju v času študija v višini 30%. To je v nasprotju s prevalenco vsaj 67% intestinalno metaplazijo med klinično benignih primerih, katerih proteomskimi profili bolj zbrani s primerov raka želodca kot pri drugih preiskovancih, v skladu z intestinalno metaplazijo čemer je vmesno stanje pri prehodu normalne želodca epitela adenokarcinomom želodca . Točna identifikacija intestinalno metaplazijo z endoskopijo je znano, da je netočno [20]. Tako je v želodcu raka tipa proteomskimi prstni odtis je lahko občutljiv indikator za prisotnost te pre-maligne tvorbe med bolniki klinično diagnozo, da ima benigne želodčne motnje.
Bolnikov z rakom želodca v seriji za učenje je bilo bistveno več (povprečna starost 67,7 let) kot pri bolnikih z benignih razjed pogojev (povprečna starost 56,6) (p
= 0,0062). Za odpravo možnosti, da so proteinski profili na podlagi starosti ali narodnosti, smo ponovno analizirali podatke o podskupini kitajskih bolnikih nad 55 let. To je privedlo do 1/17 raka napačno obravnava (enako tumor, ki je bil napačno obravnava, ko smo analizirali vse 19 raka; občutljivosti 94%) in 4/17 nadzora napačno obravnava (iste 4 kontrole, ki so bile med 9 napačno obravnava benignih primerih, specifičnost 76,5%) .
smo zraven testirali dejansko delovanje proteomskimi profilov pri bolnikih z rakom razlikuje od benignih vzorcev v drugem nizu 53 prikritih želodčne tekočine in pelete vzorcev izvleček (24 želodca raka in 29 benignih želodčnih motenj) (Dodatni datotek 3). Enaindvajset od 24 želodca raka so bile pravilno ugotovljene (občutljivost 88%) in 2 od 29 benignih vzorcev so bili nepravilno razvrščeni (specifičnost 93%) (slika 5). Slika 5 Izražanje razlika zemljevid želodčnih tekočin in ekstrakta proteinov potrjevanja določenih vzorcev na štirih ProteinChip polja, prikazana v dvosmerno hierarhično grozdenje. Pomembne proteomskimi funkcije so prikazane vodoravno. Intenzivnost rdeče ali zelene barve označuje stopnjo relativne ravni proteina, višji ali nižji od srednjo vrednost. primeri bolnikov so predstavljene navpično; Večina bolnikov z rakom želodca so tesno združeni.
Izbrano proteomskimi označevalcev (na podlagi pomena dosežen rezultat določi SAM) so semi-očistili na ProteinChip nizi in stranskih trkov povzroča disociacije sekvenciranje identificirati neposredno na mestih (Slika 6). Več o občutno navzdol reguliranih označevalcev pri bolnikih z rakom, prikazanih na slikah 1 in 2, 1881,9 DA, 2041,0 DA, 2188,1 DA in 2387,3 DA, ni bilo ugotovljeno, da je pepsinogen C in pepsina aktivacijo peptidnih fragmentov (tabela 1). so bile ugotovljene, da je alfa defenzin-1,2,3 so up-urejena trojček markerji pri bolnikih z rakom, prikazani na slikah 2, 7 in dodatnih datotek 4. Intenzivnost graf raztrosa kažejo zelo velike razlike v srednje intenzivnosti defenzin in pepsin fragmenta med benigne kontrole in vzorcev raka želodca tekočine (p
= 0,003 in 0,00002, oziroma) (Slika 8). Uporaba ELISA, specifični za pepsinogen C, smo potrdili bistveno nižje koncentracije v želodčnih tekočinah raka (11,9 ± 0,1 ng /ig skupnih beljakovin; pomeni ± SEM n = 6), v primerjavi z benignimi vzorcev (21,5 ± 1,4 ng /ig celotnega proteina n =. 23), v tretjem nizu vzorca (p
= 0,0126; študenta brez para dve zimske t
test). ELISA na enak vzorčni nabor za ravneh defenzin pokazale višje koncentracije v vzorcih želodčne raka (63,4 ± 9,2 pg /ig skupnih beljakovin; pomeni ± SEM n = 6), kot pri benignih vzorcih (46,2 pg /ig skupnih beljakovin; srednja vrednost ± SEM n = 23) ((p
= 0,0654; Študentska t
test) .table 1 peptidne sekvence označene z MS //MS
peptida m /z
Sequence
Protein Match
Mowse † rezultat
Mowse rezultat z znatno homologijo
2386.29
FLKKHNLNPARKYFPQWKA
Pepsin aktivacijo peptid
35
> 28
2187,12
FLKKHNLNPARKYFPQW
Pepsin aktivacijo peptid
18
> 26
2040,03
LKKHNLNPARKYFPQW
Pepsin aktivacijo peptid
28
> 26
1775,95
FLKKHNLNPARKYF
Pepsin aktivacijo peptid
47
> 26
1628,84
LKKHNLNPARKYF
Pepsin aktivacijo peptid
40
> 28
1880,92
LRTHKYDPAWKYRF
Pepsinogen C aktiviranje peptid
31
> 22
† Mowse ocena = -10Log ( P), kjer je P = verjetnost, da je delilec naključni dogodek (P
< 0,05) m /z
, masa /zaračuna
Slika 6 visoki ločljivosti masni spekter frakcioniranih želodčnih proteinov tekočin na LWCX30 ProteinChip paleto pridobljenih na QTOF opremljeno z PCI1000 vmesnik. Ohišju- vrhovi so bili podvrženi analizi razdrobljenost stranski trk povzroča disociacije MS /MS.
Slika 7 visoki ločljivosti masni spekter želodčnih proteinov tekočin na H50 ProteinChip paleto pridobljenih na QTOF opremljeno z PCI1000 vmesnik. Ta podatek kaže navzgor regulirano trojček označevalcev v raku želodca. Oglejte si dodatno datoteko 4 za celotno sliko.
Slika 8 graf raztrosa vrednosti intenzitete za defenzin in pepsin fragmenta prisotne v želodcu vzorcev tekočin benignega nadzora in bolnikov želodca z rakom iz niza usposabljanja.
Razprava
Naši podatki kažejo, da bi lahko bila spektralna profil nefrakcioniranem želodčni tekočini koristen dodatek za diagnozo in odkrivanje bolezni v zgodnji fazi raka, če je kombinirana s kliničnim gastroskopijo. Najnovejši poskusi identifikacijo proteinov biomarkerjev za raka želodca so raziskovali serum [21-29] in tkiva [24, 30-37], in so vse bolj uporablja masne spektrometrije. Starejša poročila seroloških testih posameznih znanimi tumorskih markerjev npr CEA, CA 19-9, CA 72-4, CA242 in TAG-72, imajo na splošno nizka občutljivost (< 50%) [38-41]. Poleg tega obstaja znatna navzkrižno pozitivnost teh tumorskih označevalcev ni želodčnih raka npr postavljeno CEA in MG7-Ag ravni so pogosti v kolorektalnega raka, holangiokarcinom, karcinom trebušne slinavke, in celo pri zdravih kontrolah [40, 23]. Ni presenetljivo, da takšne serum tumorski markerji imeti nobene vloge pri želodca diagnozo raka in pregleda, lahko pa služi kot napovednih kazalcev in zgodnje označevalce ponavljajočih se bolezni naslednje želodca [39, 41, 42].
Odločili smo se, da preuči proteomskimi profilov želodčne tekočine za biomarkerjev bolezni, ker se je zdelo verjetno, da zaskrbljen izločanja želodčne beljakovin v malignih in pre-malignih stanj, skupaj z morebitno prisotnost listasti rakavih celic, lahko ustvari razločevalne proteomskimi profilov. Kot pri iskanju serumskih biomarkerjev, ki so več skupin raziskovali diagnostično uporabnost znanih tumorskih markerjev v želodčnega soka. Niti CEA niti CA 19-9 pozitivnost v želodčni tekočini je pokazala diagnostično natančnost [43-46]. Alfa-1 antitripsin želodčnega soka je bil pred kratkim poročali kot želodčni biomarker raka [47, 48].
Naš pristop k razvoju občutljive metode za želodčne diagnozo raka razlikuje od prejšnjih študij na tri načine. Najprej smo izbrali biološki vzorec, ki je bil organ specifične (npr endoskopsko Sesalni želodčni tekočine) kot sistemsko (tj serum), sklepanje, da bi bolj verjetno molekulske lastnosti za posamezne bolezni. Drugič, masna spektrometrija nam je omogočilo, da se nepristranski pristop, ki temelji na odkritje. Tretjič, naši podatki ustvarili profile več proteomskimi markerjev, ki so vedno bolj šteje, da ima večjo občutljivost in specifičnost kot posameznih označevalcev tumorskih [49, 50]. Za rakom želodca, ki združuje tudi 2 ali 3 tumorskih markerjev doseči boljšo diagnostično natančnost v primerjavi s samim enotnega označevalca [38, 40].
Beljakovine prstni odtisi želodčni kislini pri bolnikih z rakom želodca pokazala skupno 106 proteomskimi funkcij, ki so bili precej navzgor - ali navzdol regulirano (Dodatne datoteke 1 in 3). Dva pomembna markerji so bili izbrani za identifikacijo, ki ga MS /MS. Pepsinogen A in pepsinogen C aktivacijo peptide smo navzdol urejena v želodčnih tekočinah, vzete iz želodcev s histološko potrjeni adenokarcinome. Študija kriostat odsekov raka želodca poročali tudi znatno navzdol ureditev pepsinogen C, opredeljeno z MS /MS, v tumorskega tkiva [51].

• Genetski rodbin v nediferencirani tipa želodčnega karcinoma analiziral nenadzorovan povezovanjem genomske mikromrež DNA data
• MIR-146a rs2910164 G /C polimorfizem in dovzetnost rak želodca: meta-analysis