Osobit želuca Proteom tekućine u rak želuca, otkriva više biomarkera dijagnostičku profile

Razlikovni želuca Proteom tekućine u rak želuca, otkriva više biomarkera dijagnostičku profil
apstraktne pregled pozadine
ukupnog preživljavanja od raka želuca i dalje loš, uglavnom zato što nema pouzdane metode za identifikaciju vrlo osjetljiv u ranim fazama bolesti. Multi-protein profiliranje želučanih tekućina, dobiven iz anatomskoj lokaciji patologije, mogao otkriti dijagnostičke proteomsku otiske prstiju.
Metode pregled Protein profili su generirane iz uzoraka želuca tekućinom od 19. rakom želuca i 36 gastritides pacijenata benignih prolazi izborni, klinički -indicated gastroskopija pomoću laserske desorpcije /ionizacije vremenska masena spektroskopija površinski pojačan na više ProteinChip polja. Proteomske karakteristike uspoređene su značaj analize microarray algoritma i dvosmjerne hijerarhijskog grupiranja. Drugi oslijepio skup uzoraka (24 karcinome želuca i 29 klinički benigni gastritides) se koristi za provjeru valjanosti. Pregled Rezultati
prema značaju analysyis od microarray, 60 proteomsku crte lica bile regulira prema gore, a 46 su dolje regulirana u uzorcima karcinoma želuca (p pregled < 0,01). Multimarker klastera pokazala je dva osebujna proteomsku profila neovisno o njihovoj dobi i nacionalnosti. Osamnaest od 19 uzoraka raka grupirani zajedno (osjetljivost 95%), dok je 27/36 uzoraka nekanceroznih skupljeno u drugu grupu. Devet uzorci nisu raka koji su se okupljali s uzorcima karcinoma uključena 5 premalignih lezija (1 adenomatozna polipa i 4 intestinalne metaplazije). Validacija koristeći drugi set uzorka pokazala osjetljivosti i specifičnosti da se 88% i 93%, pojedinačno. Pozitivna prediktivna vrijednost kombiniranih podataka iznosio je 0,80. Odabrani peptid sekvencioniranje identificirati pepsinogen C i pepsina A aktivacijski peptid kao značajno pale regulirano i alfa-defensin kao značajno je povećana. Pregled Zaključak pregled ovaj jednostavan i ponovljiv multimarker proteomskog testa može dopuniti kliničku procjenu gastroscopic u simptomatskih bolesnika kako bi se poboljšala dijagnostička točnost za rak želuca i premalignih lezija. pregled Pozadina pregled, za razliku od drugih oblika raka, prognoza za pacijente s rakom većinu želučanog je siromašan i popravila malo tijekom posljednjih nekoliko desetljeća. Petogodišnje preživljenje za rak želuca su znatno niže od svih glavnih vrsta raka, osim raka jetre, gušterače i jednjaka [1]. S obzirom da je rak u ranoj fazi želuca ima mnogo bolju prognozu (5-godišnjeg preživljavanja je oko 90%) nego uznapredovalim rakom želuca (5-godišnje preživljavanje 3-10%) [2, 3], globalne smrtnosti od raka želuca treba smanjiti značajno od mjere koje imaju za posljedicu downstaging tumora u vrijeme početne dijagnoze.
Iako gastroskopija je zlatni standard za dijagnozu raka želuca, njegova točnost nije tako visok kao što je za benignim želučanih bolesti poput peptičkog ulkusa, a posebno u zemljopisnim područjima od niskog do srednji pojavnosti raka želuca. Postotak propuštenih dijagnoze raka, izvijestio je kako je 4,6%, 14%, pa čak i 33% [4-6], nije beznačajno. Čak iu Japanu, lažno negativnih stopa je izvijestila da se 19% [7]. Ovi podaci su u skladu s pozitivnim prediktivne vrijednosti od samo 0,4 do 0,7 za endoskopske dijagnoze raka želuca u različitim centrima [8-10]. Premda se čini da mali udio propuštenih dijagnoza, apsolutni broj pacijenata odbijen u korist dijagnoze na izlječiv fazi nije zanemariv. Čak i na skromno niske lažno pozitivne dijagnostičke stopi od 5%, više od 47.000 želučani karcinom bio bi propustili u samo jednoj niskoj zemlji prevalencije (SAD) u jednoj godini, 2000. [11]. Endoskopska procjena često uključuje mukozne biopsije, ali nema kliničkih standardi za bilo optimalnog broja biopsija ili anatomskim regijama koje treba uzeti uzorci. Obično citiran preporuka je da se najmanje sedam biopsije ispravno dijagnosticirati rak želuca [12]. U ovom istraživanju, međutim, u potpunosti 17% svih ozljeda naknadno pokazalo da su maligni smatrani su dobroćudni na endoskopije. Dakle, endoskopska za sluznicu pregled pati od inter-promatrača varijacije, suboptimalne korelaciji s histopatologijom, poteškoće u otkrivanju submukozalnim rakova i neometanog vizualizaciju svih anatomskih podregije pr . Nakon prethodnog želuca operacije [13, 14]
želučanom soku sastoji se od smjese izlučenih topljive i odljuštenih staničnih proteina iz cijele želučane sluznice - uključujući regije koji ne može biti adekvatno određuju fibreoptic gastroskopija. Stoga je zaključio da je proteomski profil želučanom soku, često smatran otpad po-proizvoda tijekom gastroscopic ispita, mogu korisno dopuniti konvencionalni kliničku procjenu, osiguravajući 'molekularni biopsiju' koji učinkovito uzoraka cijelu sluznicu želuca, posebno što se tehnikama detekcije proteina takvih kao masene spektrometrije može biti vrlo osjetljiv. Ako se izvodi tijekom klinički indicirano gastroskopija, dobivanje želučane tekućine ne povećava invazivnost postupka. Za razliku od proteome plazme, želučani Proteom tekućina je vjerojatno da će biti manje složeno, ali obogaćen biomarkera bolesti specifična, koji proizlaze izravno na mjestu bolesti. Isti biomarkeri, čak i ako je prisutan u plazmi, može se razrijediti izvan granica detekcije i pomiješa s drugim više obilnih sistemskih proteina koji odražavaju istodobno patofiziološkim uvjetima (npr komorbiditet bolesti), nego anatomski site-specific bolesti. Pregled Ispitali smo novi pristup razvoju biomarkera za rak želuca profiliranjem topljive luči peptide prisutne u endoskopski atmosferski želučanom soku i proteine ​​ekstrahirane iz odljuštenih epitelnih stanica, također nadoknađeni tijekom endoskopije površinskim poboljšane laserska desorpcija-ionizacija vrijeme od leta (pomoć SELDI TOF) masenim spektrometrom. Naši rezultati pokazuju da više proteina biomarkera iz izvora organa specifične odnosno želučane kiseline, stvaraju prepoznatljiv potpis koji zaslužuje daljnji razvoj kao alat za poboljšanje dijagnostičku točnost gastroskopija rak želuca i ima potencijal za otkrivanje ranoj fazi rak želuca i prekancerogeni lezije (intestinalne metaplazije i displazija).
Metode
kliničkim uzorcima
želučanih tekućina dobiveni su tijekom gastroskopija u noći postio pacijenti u Singapuru Općoj bolnici. Protokol istraživanja je odobren od strane Etičkog povjerenstva Singapur Opće bolnice. i u skladu s odredbama Deklaracije u Helsinkiju 1995. Indikacije za gastroskopija su isključivo klinički i bili neovisni o studiji. Početna analiza je provedena na trening seta od 19 uzoraka iz histološki dokazano želučanog adenokarcinoma (13 crijevna tipa, 4 difuzni tip, jedan mješoviti tip, jedan neodređeni) [15] i od 36 uzoraka od bolesnika s klinički benignih želučane uvjete. Srednja dob od 19 pacijenata oboljelih od raka želuca (13 muških, 6 žensko, 17 kineskih, dva indijska) je 68 godina. Distribucija od strane američke Zajednički odbor za rak (AJCC) kliničkom stupnjevanju je stadij 0 (1 bolesnika), faza I (4 bolesnika), faza II (2 pacijenta), faza III (2 bolesnika) i stadij IV (10 pacijenata). Srednja dob od 36 bolesnika s benignim želučanim uvjetima (19 muških, 17 ženski, 33 kineskih, 2 malajski, jedan indijski) je 57 godina. Klinička dijagnoza nakon endoskopije pacijenata bez raka bili su normalni (9), antralne gastritis (9), gastritis (6), čira (4), hiatal kila (3), hiperplastičnih polipi (2), Barrettov ezofagus (1), fundusa ožiljak (1) i adenomatozna polip (1).
algoritam klasifikacije koji je razvio iz skupa trening testirana je oslijepio analize skupa validacije koja se sastoji od još 24 histološki potvrđeno želudac adenokarcinome (10 crijevna tip, 7 vrsta difuzna, jedna mješovita tipa, 5 neodređen, 1 neuroendokrini) i 29 klinički benigni želučani uzoraka. Srednja dob tih 24 pacijenata oboljelih od raka želuca (18 mužjaka, 6 ženki, 21 kineskih, 3 malajski) bio je 70 godina. Distribucija od strane AJCC kliničkom stupnjevanju je faza I (5 bolesnika), faza II (4 bolesnika), faza III (2 bolesnika) i stadij IV (12 pacijenata). Jedan pacijent u setu validacije odbio daljnju istragu i ne može se održati. Srednja dob od 29 pacijenata bez raka (11 muških, 18 ženski, 26 kineskih, 2 indijski, 1 malajski) bila je 47 godina. Klinička dijagnoza nakon gastroskopija pacijenata bez raka su gastritis (14.) Polipi fundusa žlijezda (2), akutna želuca (2), duodenitis (2), hiatal hernija (1) i normalnih (8). Pregled Nijedan od pacijenti s rakom želuca je primio bilo koji oblik liječenja raka u vrijeme gastroskopija.
Uzimanje obuku i provjeru valjanosti slučajeve zajedno, 19% (8/43) i 29% 19/65 () bolesnika s karcinomom želuca i benigne želuca uvjete, odnosno, bili su pozitivni na H. pylori pregled, a razlika je u tome nije bila značajna Fisher testu egzaktne (2-sided p pregled vrijednost = 0,4508). pregled, prikupljanje i obrada uzoraka pregled želučanom soku se usisan u sterilni spremnik na početku endoskopije, dodijeljen anonimnog kod te se odmah stavljaju na led. Krvno ili žučnim umrljan uzorci su odbijeni. Samo klinički sumnjive mukozne lezije su biopsije po vlastitom nahođenju endoscopist. Želučana tekućina se centrifugiraju na 180 g tijekom 6 minuta na 4 ° C, od kojih je supernatant je ponovno centrifugirana na 16 100 g tijekom 30 minuta na 4 ° C. Peleti iz oba centrifugiranja se spoje. Supernatanti velike brzine su čuvani zasebno od kuglica na -80 ° C. Pregled Protein profiliranje pregled Nakon otapanja 10 ul svakog želuca tekućeg uzorka se primjenjuje na različite kemijske površine ProteinChip polja (Ciphergen Biosystems Inc., Kalifornija , USA): (a) bakar (II) Immobilized Metal Affinity hvatanje (IMAC3) u prisustvu 100 ul 1 mol /L urea, 1 g /L 3 - [(3-holamidopropil) dimetilaminijoj] -1 propansulfonata ( CHAPS), 0,3 mol /L KCl, koktel inhibitora proteaza (Roche Diagnostics, Mannheim, Njemačka), 50 mol /L TrisHCl, pH 7,5; (B) slab Kation izmjenjivački (WCX2 i CM10) u prisustvu 100 ul 50 mmol /l natrijevog acetata, 1 g /L oktil glukopiranozida, koktel inhibitora proteaze, pH 5; (C) Strong Anion Exchange (Sax2) u prisustvu 100 ul od 50 mmol /L TrisHCl, 1 g /L CHAPS, koktel inhibitora proteaza, pH 8; i (d) hidrofobnih interakcija (H50) u prisustvu 100 ul 5 mL /L trifluoroctene kiseline. Nakon ispiranja s 100 ul istih odgovarajućih pufera, doda sinapinska kiselina kako bi se olakšalo desorpcije i ionizacije. Čipovi su analizirani SELDI-TOF-MS (, PBSII Ciphergen Biosystems Inc.). Karcinomi i kontrole bili su pomiješani i raditi istovremeno u istom čip i na više žetona za smanjivanje čip-na-čipu varijacije.
Pelete želučanoj tekućini su ponovno suspendirani u 25 ul 6 mol /l gvanidin tiocijanata, 5 g /l oktilnim glukopiranozid, 0,1 mol /L Hepes pH 7, te 100-200 ul od 9 mol /L urea, 2 g /l CHAPS, 50 mmol /l TrisHCl, pH 7,5 vrtloženjem 45 minuta na 4 ° C. Nakon centrifugiranja na 20 000 g tijekom 5 minuta, 10 ul ekstrakta je nanesen na ProteinChip polja kao što je gore opisano.
Kartom zaostatak je generiran na koji pojedini proteini prikazani kao zasebna vrhovima na temelju njihove mase za punjenje omjer , Podaci o proteomskom spektara su analizirani Ciphergen Express Data Manager softver s uzorkom Track i dvosmjerne hijerarhijska klastera algoritam. Poravnati vrhove s signal šum iznad 3 su normalizirani Ukupna ionska struja. Proteomske osobine su dalje analizirani pomoću analize značaja od Microarrays (SAM) softvera na Sveučilištu Stanford. Paket je dizajniran za rješavanje problema specifičnih za analizu mikropostrojima podataka (signal šum varijance drugačiji od gena do gena, velikog broja točaka podataka iz malog broja uzoraka), ali smo smatrali da je primjenjiv za proteomskog analize podataka, kao dobro. Algoritam softvera opisao je Tusher sur pregled. [16]. Ukratko to je definirano podatak pod nazivom relativna razlika za mjerenje razlike između dvije ili više grupa podataka na mjestu p
vrijednosti. To zaposleni varijaciju metode pokretački i više puta podijeljen zadani skup podataka (spektri sadrži proteomsku značajke u ovom istraživanju) slučajno u dvije grupe izračunati relativnu razliku za svaku od permutacija. Broj permutacija je postavljen da bude 1000 u ovoj studiji, a softver izračunava 1000 relativna razlika vrijednosti za svaku proteomskog značajku. Relativna razlika određenog grupiranja interesa (promatrano relativno odstupanje) je u odnosu na prosječnu relativnu razliku od svih permutacija (očekuje se relativna razlika) za svaku značajku, a značajka je procijenjena na gore ili prema dolje regulira prema tome je li njegova promatrana relativna razlika bila veća ili manja od očekivanog relativne razlike po nekim praga. Softver procjenjuje na stopu lažnih otkriće (također definiran u svezi [16]) za svaku granične vrijednosti pod uvjetom da je na posredan način za postavljanje gušeći. Markeri identificirani ovom metodom bili statistički značajni. Lažno stopa otkriće je postavljen da bude manji od 0,05 u ovom istraživanju.
Za provjeru oznaka utvrđene SAM, druga serija 53 zaslijepljeni uzoraka dodani su u skup podataka za hijerarhijskoj klastera pomoću Ciphergen Express Data Manager. Iako se očekivalo poznati uzorci koriste SAM za odabir markera za obavljanje dobro u klastera, zaslijepljeni uzorci su uključeni testirati koliko dobro markeri generalizirati na nepoznate uzorke. Rezultati klastera jednostavno su odnosu prema istinskom identitetu uzoraka i bez naprednih metoda klasifikacije ili bilo koji drugi softver je korišten u validacije. Identifikacijski pregled biomarker pregled želučanom soku Proteini su po anion exchange kromatografije (P HyperD , Ciphergen Biosystems Inc.), uz postepeni promjene u pH za ispiranje. Proteini u 50 mmol /L TrisHCl, 1 g /L oktil glukopiranozida, Ph 8 eluensa se dalje pročišćava na kationsku izmjenu niza (LWCX30) korištenjem 50 mmol /L natrijev acetat, 1 g /L oktil glukopiranozid, pH 5, kao vezanje i pufer za ispiranje. Nakon dodatka alfa-cijano-4-hidroksicinaminska kiselina energije apsorbiraju molekula (Ciphergen Biosystems Inc.), zadržanim proteini analizirani su PBSII i Q-TOF (Waters /Micromass) opremljen ProteinChip priključka (PCI 1000, Ciphergen Biosystems Inc.) , Proteini su karakterizirani MS /MS fragmentacije i identifikacija se vrši pretraživanje baza podataka s maskotom (Matrix Science Ltd., London, UK). Pregled biomarker validacija pregled Ovo je izvedena u trećem setu uzoraka želuca fluida uzet od benignih želuca i pacijenata s rakom želuca. Svaki svježe prikupljeni uzorak je obrađena za uklanjanje čvrstog otpada i da se koncentriraju na sadržaj proteina kako slijedi. Nakon dodavanja fenilmetansulfonil fluorida do konačne koncentracije od 0,2 mM, uzorak se centrifugira 15 minuta pri 500 g i 4 ° C. Inhibitore proteaze (Potpuno Mini ™, Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA) dodano je u supernatant i zatim centrifugiranjem kroz membranu pri 2 900 g i 15 ° C (Amicon Ultra-4 centrifugalna uređaj za filtriranje, 5 000 limit nominalne molekulske mase; Millipore, Billerica, MA, USA) dok uzorak je smanjen na 10 - 20% originalnog volumena. Ukupna koncentracija proteina se odredi 2-D kvant kita (Amersham Biosciences, Pisctaway, NJ, USA). Pepsinogen C i alpha-defensin 1-3 koncentracije su određene enzimskim imunoesejom (ELISA) koristeći setove od ALPCO Diagnostics (Salem, NH, SAD) i Hycult biotehnološke B.V. (Uden, Nizozemska), redom. Svaki obrađeni uzorak je analiziran u dva primjerka za pepsinogen C i razine defensin koriste protokolu proizvođača. Uzorci za ispitivanje pepsinogen C su prethodno razrijeđen 120 puta. Koncentracije pepsinogen C i alfa-defensin 1-3 izvedeni su se u odnosu na njihove standardne krivulje i izražena kao ng (pepsinogen C) ili PG (defensin) po mikrograma ukupnog želučane proteina tekućine. Pregled, Helicobacter pylori
prisutnost H. pylori
u želucu tkivima identificiran pomoću vizualizacije spiralnih mikroorganizama histologije dijelovima i /ili imunohistokemije. sekcije četiri mikrona tkiva su de-voskom u ksilena i smanjenju ocjenama etanola. Antigen pronalaženje bilo zagrijavanjem u citratnom puferu, pH 6,0. Primarna antitijela na H. pylori pregled (1:50 razrjeđivanja; DAKO A /S, Glostrup, Denmark) uslijedila je link sekundarnih antitijela polimera (Predvidjeti Chem Mate, DAKO) i vizualizirati pomoću Diaminobenzidin kao kromogena pregled. Rezultati
više gore ili prema dolje regulirana protein biomarkera u rak želuca, otkriveni su u želučanom soku. Reprezentativni proteomski karta želučane tekućine je prikazan na slici 1. To je pogled gel spektra masa pokazuje želučanog fluida proteini se selektivno vežu na imobilizirani bakar (II) iona metala u rasponu molekulskih težina od 1500 Da do 6000 Da. Značajne protein oznake za koje se smatra podregulirani u tumorskom želučanom soku (p pregled < 0,01) označene su strelicama. Slika 1 Ekspresija razlika karta želučane tekućine na bakar (II) imobiliziranog metalnog afiniteta hvatanje ProteinChip spektar (IMAC3). Strelice pokazuju proteinske biomarkere bitno različite razine ekspresije između dviju skupina uzoraka.
Reprezentativnu proteomski karti ekstrakta kuglica na želučani sok je prikazano na slici 2. Proteini su selektivno vezan na kationski izmjenjivač polja površine. Značajne protein oznake za koje se smatra gore ili prema dolje reguliraju u želučanom peleta tekućine rak (p pregled < 0,01) označene su strelicama. Slika 2 Expression Razlika karta želučane tekućeg ekstrakta peleta na kationske izmjene ProteinChip polja (WCX2). Strelice pokazuju proteinske biomarkere bitno različite razine ekspresije između dviju skupina uzoraka
Prosječna CV. (Koeficijent varijacije, kumulativna 10-15 većih vrhova u želučanom soku po spektru, n = 8) za imobilizirani bakar (II) ProteinChip niz (IMAC3) bio je 12,8%, a za izmjenom kationa niz (WCX2) je 15%, za anion exchange niz (Sax2) bio je 17,3%, a za hidrofobne interakcije čip (H50) bio je 13,6%. Ove CV vrijednosti su u skladu s procjenom obnovljivosti u SELDI literaturi [17, 18].
Sam analize svih proteomskom značajki (ukupnog broja značajki 41 800, prosječan broj po zaostatka karte 314) u želučanom soku i pelete ekstrakta 46 proteomske karakteristike Utvrđeno je da su značajno pale-regulirano raka želuca i 60 proteomsku crte lica bile su značajno viša u raka želuca. (Podaci iz različitih uvjeta, npr, tekućine i pelete, kao i različite površine, jednostavno su agregirani zajedno kao različite mogućnosti za SAM. Markeri izvijestila SAM u oba i supernatanta frakcije ručno identificirani su i zastupljeni samo jednom na popisu, nakon što su bili smatra biološki značajna). Značajno dolje regulirane markeri uključuju 1884, 2428, 2594, 2840, 4050, 11720, 13700 Da, značajno je povećana markeri uključuju 1761. 1831. 3372, 3443, 3605, 5160, 6780 Da. (Većina značajnih markera otkriveni su na WCX2 i IMAC-bakar (II), nakon čega slijedi Sax2). Na temelju 106 bitno različitim proteomskom mogućnosti (dodatne datotečne 1), dvosmjerna hijerarhijska grupiranje analiza (dvodimenzionalni kompletna veza) je izvedena. Većini slučajeva raka želuca su grupirani zajedno tako da formiraju karakterističan skupinu (slika 3 i dodatne datoteke 2). Glavna komponenta analiza istim podacima također otkrio da je rak i benigni uzorci mogu biti i odvojeni u dvije skupine, s 2 lažnih negativa (koja je predstavljala duple analizu istom predmetu) i 9 neistinit, odnosno (slika 4). Uzorak jedan rak želuca tekućina (s slučaj etapu slabo diferencirani želuca adenokarcinom) klastera kod uzoraka nekanceroznih; svi ostali 4 ranoj fazi (stupnjevi 0 i I) pacijenti ispravno grupirani s uzorcima od 14 bolesnika s stadiju II - IV karcinoma želuca, dajući ukupnu dijagnostičku osjetljivost od 95% (18/19 bolesnika s rakom želuca) na trening seta. Slika 3 Ekspresija razlika karta mjesta u želučanom soku i pelete ekstrakt proteina postavljenih uzoraka trening na četiri ProteinChip polja, koja se nalazi u dvosmjernoj hijerarhijskog grupiranja. Značajne proteomske značajke prikazane su okomito. Intenzitet sivim tonovima pokazuje stupanj relativnog razini proteina, više ili niže od medijana vrijednosti. Pacijent slučajevi su prikazani vodoravno; većina pacijenata s rakom želuca čvrsto su grupirani zajedno. Ova slika prikazuje gornji kvartil punog slike (pogledajte dodatne datoteke 2 za punu sliku).
Slika 4 Metodom glavnih komponenata zemljište proteomskom obilježja trening set uzoraka. Jedan zrakoplov (označeni crnom linijom) dijeli uzorke u dvije skupine s 1 lažno negativan (prikazano na duple spotova) i 9 neistinit. Pregled Devet od 36 uzoraka ne-raka u trening seta grupirani s uzorcima karcinoma (specifičnost 75%). Od toga, jedan je imao displazije adenomatozne polipa - što je pretkarcinoznog lezija [19]. Između ostalih 8 pacijenata, 6 su klinički usmjeren biopsije koji je otkrio crijevnu metaplazije u 4 (67%). Osam pacijenata bez raka čije želučanom soku Profili proteina grupirani u normalnoj grupi i klinički su usmjerena mukoznim biopsijama koje su pokazale intestinalnog metaplazije u samo 2 pacijenta (25%). Pregled 1000 uzastopnih želučanih biopsija se izvode za sve indikacije pokazao ukupnu učestalost intestinalne metaplazije u Singapuru Opće bolnice tijekom istraživanja od 30%. Ovo je u suprotnosti s rasprostranjenošću od najmanje 67% intestinalne metaplazije među klinički benignih slučajeva čiji proteomic profili grupirani pobliže s slučajeva raka želuca nego s drugim normale, u skladu s intestinalne metaplazije se jedno srednje stanje u tranziciji normalnog želučanog epitela na želučani adenokarcinoma , Točno utvrđivanje intestinalne metaplazije i endoskopije je poznato da je netočna [20]. Dakle, rak želuca tipa proteomic otisaka prstiju je možda osjetljiv indikator za prisutnost ovog premalignih lezija kod pacijenata klinički dijagnosticirana benigna želučani poremećaji.
Pacijenata s rakom želuca u trening set bili su značajno stariji (prosječna dob 67.7 godine) od bolesnika s benignim želučanim uvjetima (srednja dob 56,6) (p pregled = 0,0062). Kao odgovor na mogućnost da su Profili proteina se odnose na dob ili nacionalnost, ponovno smo analizirali podatke o podskupu kineskih pacijenata iznad 55 godina starosti. To je dovelo do 1/17 raka pogrešno klasificiran (isto tumor koji je pogrešno klasificiran kada su analizirani svi 19 vrsta raka, osjetljivost 94%) i 4/17 kontrole pogrešno klasificiran (ista 4 kontrole koje su bile među 9 pogrešno klasificiran benignih slučajeva, specifičnost 76,5%) . pregled Potom smo testirali stvarne izvedbe proteomskom profila u razlikovanju raka od benignih uzoraka u drugoj seriji od 53 zaslijepljeni uzoraka želučanom soku i pelete ekstrakt (24 želučanog karcinoma i 29 benignih želučanih poremećaja) (dodatne datotečne 3). Dvadeset i jedna od 24 želučanog karcinoma ispravno identificirani (osjetljivost 88%) i 2 od 29 benignih uzoraka pogrešno klasificirani (specifičnost 93%) (Slika 5). Slika 5 Ekspresija razlika karta mjesta u želučanom soku i ekstrakt pelet proteinima postavljenih uzoraka validacije na četiri ProteinChip polja, prikazuju se u dvosmjernoj hijerarhijskog grupiranja. Značajne proteomske karakteristike su prikazane vodoravno. Intenzitet crvene ili zelene boje ukazuje na stupanj relativne razine proteina, više ili niže od medijana vrijednosti. Pacijent slučajevi su prikazani vertikalno; Većina pacijenata s rakom želučanih čvrsto su grupirani zajedno.
odabrano proteomsku markera (na osnovi značenja indeksne utvrđen SAM) su polu-pročišćeni na ProteinChip polja i identificiran izravno na mjesta po sudarima izazvanu disocijacije sekvenciranje (Slika 6). Nekoliko značajno dolje regulirana biljega u bolesnika s karcinomom prikazanih na slikama 1 i 2, 1881,9 Da, 2041,0 Da, 2188,1 Da i 2387,3 Da, identificirane su se pepsinogen C i pepsin za aktivaciju peptidnih fragmenata (Tablica 1). Up-regulirana triplet markera u bolesnika s karcinomom prikazani na slikama 2, 7 i dodatne datotečne 4 su identificirane biti alfa defensin-1.2.3. Intenzitet raspršeni parcela pokazuju vrlo značajne razlike u srednjim intenzitetom defensin pepsin fragment između benigne kontrole i raka želuca fluida uzoraka (p = 0,003
i 0,00002, respektivno) (Slika 8). Korištenje ELISA specifična za pepsinogen C, potvrdio nam je značajno niže koncentracije u želučanim tekućinama raka (11,9 ± 0,1 ng /ug ukupnog proteina, srednja vrijednost ± SEM n = 6) u odnosu na benignih uzoraka (21,5 ± 1,4 ng /ug ukupnog proteina n =. 23) u trećem setu uzoraka (p pregled = 0,0126; Student pojedinačna dvosmjerni t pregled test). ELISA provedena je na istom skupu uzoraka za razine defensin pokazuju višu koncentraciju u uzorcima rak želuca (63,4 ± 9,2 pg /ug ukupnog proteina; srednja vrijednost ± SEM n = 6) u odnosu na benignih uzoraka (46,2 pg /ug ukupnog proteina; srednja vrijednost ± SEM n = 23) ((p
= 0,0654; Studentov t pregled test) .table 1 peptida sekvence identificirani su MS //MS pregled Peptide m /z
Slijed
protein odgovarajuće
Mowse † postići
Mowse rezultat sa značajnim homologije
2386.29
FLKKHNLNPARKYFPQWKA
pepsinom aktivaciju peptid pregled 35 izvoznici > 28 pregled 2.187,12 pregled FLKKHNLNPARKYFPQW pregled pepsinom aktivaciju peptid pregled 18 izvoznici > 26 pregled 2.040,03 pregled LKKHNLNPARKYFPQW
pepsinom aktivaciju peptid pregled 28 izvoznici > 26 pregled 1.775,95 pregled FLKKHNLNPARKYF pregled pepsinom aktivaciju peptid pregled 47 izvoznici > 26 pregled 1.628,84 pregled LKKHNLNPARKYF
pepsinom aktivaciju peptid pregled 40 izvoznici > 28 pregled 1.880,92 pregled LRTHKYDPAWKYRF pregled Pepsinogen C aktivacijski peptid pregled 31 izvoznici > 22 pregled † Mowse rezultat = -10Log ( P), gdje je P = vjerojatnost da se utakmica je slučajni događaj (P izvoznici < 0,05) m /z pregled, masa /naboj pregled slika 6 visoke rezolucije maseni spektar prosijano želučanog proteina fluida na LWCX30 ProteinChip niz dobivenih na QTOF opremljen s PCI1000 sučelje. Uokvireno vrhovi su podvrgnuti fragmentaciju analizu sudara izazvanu disocijaciju MS /MS.
Slika 7 maseni spektar visoke razlučivosti želučanog proteina fluida na H50 ProteinChip niz dobivenih na QTOF opremljen s PCI1000 sučelje. Ova slika prikazuje regulira prema gore triplet markere u raka želuca. Molimo pogledajte dodatne datoteke 4 za punu sliku.
Slika 8 Scatter parcele od vrijednosti intenziteta defensin pepsin fragment prisutan u uzorcima želučane tekućine dobroćudne kontrole i bolesnika s karcinomom želuca od trening seta. pregled Rasprava
Naši podaci pokazuju da je spektar profila nefrakcioniranim želučanom soku može biti korisna pomoć za dijagnosticiranje i otkrivanje ranoj fazi bolesti raka, kada je u kombinaciji s kliničkim gastroskopija. Najnoviji pokušaji identifikacije proteina biomarkera raka želuca su istraživali serum [21-29] i tkiva [24, 30-37], te su sve više koriste masene spektrometrije. Stariji izvješća o serološkim testovima pojedinih poznatim tumorskih biljega pr CEA, CA 19-9, CA 72-4, CA242 i TAG-72, općenito imaju nisku osjetljivost (< 50%) [38-41]. Osim toga, postoji značajan cross-pozitivnost ovih tumorskih biljega u karcinomu non-želučanih npr podigao HUP i MG7-Ag razine su uobičajene u kolorektalnog karcinoma, holangiokarcinomom, karcinoma gušterače, pa čak iu zdravih osoba [40, 23]. Nije iznenađujuće, takve tumorske serum markeri nemaju uspostavljenu ulogu u želučanom dijagnoze raka i projekcije, iako mogu poslužiti kao prognostički pokazatelji i rane markere recidiva bolesti sljedeće gastrektomije [39, 41, 42].
Odlučili smo ispitati proteomsku profila želučane tekućine za biomarkera bolesti, jer se činilo vjerojatnim da smetaju želučane sekrecije proteina u zloćudnim i premalignih stanja, zajedno s mogućim prisutnosti odljuštenih stanica raka, mogao bi generirati karakterističan proteomsku profile. Kao što je u potrazi za biomarkera u serumu, nekoliko su istraživačke skupine dijagnostički alat poznatih tumorskih biljega u želučanom soku. Ni CEA, niti CA 19-9 pozitivnost u želučanom soku pokazala dijagnostičku točnost [43-46]. Alfa-1 antitripsin u želučanom soku Nedavno je zabilježen kao rak želuca biomarkera [47, 48].
Naš pristup razvoju osjetljivu metodu za želučane dijagnoze raka razlikovala od prethodnih studija na tri načina. Prvo, odabrali smo biološkog uzorka koji je bio organ-specifična (tj endoskopski aspirira želučani sok), a ne sistemski (tj seruma), smatrajući da su molekularna svojstva će vjerojatno biti specifičan za bolest. Drugo, spektrometrija masa nam je omogućilo da se nepristrano otkriće bazi. Treće, naši podaci generirani profile više proteomskom markera koji se sve više smatra da ima veću osjetljivost i specifičnost od pojedinih tumorskih markera [49, 50]. Za rak želuca, kombinirajući čak 2 ili 3 tumorske markere postići bolje dijagnostičke točnosti u odnosu na samo jednu oznaku [38, 40].
Proteinski otisci želučanom soku od pacijenata s rakom želuca je pokazao ukupno 106 proteomskom značajke koje su znatno gore - ili dolje regulirano (Dodatni datoteka 1 i 3). Dva istaknuta markeri su odabrani za identifikaciju pomoću MS /MS. Pepsinogen A i pepsinogen C aktivacijski peptidi podregulirani u želučanim tekućinama ukloniti iz želuca s histološki potvrđena adenokarcinoma. Proučavanje kriostatskim dijelovima karcinoma želuca je također izvijestio značajnu-naniže pepsinogen C, identificiran od strane MS /MS, u tumorskom tkivu [51].

• Genetske loze nediferencirane tipa želučanog karcinoma analiziranim nekontroliranog klastera genomske DNA microarray data
• Mir-146a rs2910164 G /C polimorfizma i rak želuca podložnost: meta-analiza