Skiriamasis skrandžio skysčio Proteome skrandžio vėžio atskleidžia kelių biologinio žymiklio diagnostikos profilį

Skiriamasis skrandžio skysčio Proteome skrandžio vėžio atskleidžia kelių biologinio žymiklio diagnostikos profilį
Anotacija
faktai
Bendras skrandžio vėžio išgyvenimo išlieka prasta daugiausia, nes nėra patikimų metodų nustatyti labai išgydomą ankstyvojoje stadijoje liga. "Multi-baltymų profiliavimas skrandžio skysčių, gautas iš anatominės svetainėje patologijos, gali atskleisti diagnostikos PROTEOMIKOS pirštų atspaudus.
Metodai
Baltymų profiliai sugeneruotus iš skrandžio skysčių mėginiai 19 skrandžio vėžiu ir 36 gerybinių gastritides pacientams, kuriems atliekama planinė, kliniškai -indicated gastroskopija naudojant paviršiaus padidinto lazerio desorbcija /jonizacijos laiko apie skrydžio masės spektrometrijos keliuose proteinchip matricos. Proteominiai savybės buvo lyginamos pagal statinio analizę mikrogardeliq algoritmas ir dvipusio hierarchinę grupavimas. Antrasis apakinti pavyzdys rinkinys (24 skrandžio vėžio ir 29 kliniškai gerybinių gastritides) buvo naudojamas patvirtinti.
Rezultatai
pagal svarbą analysyis iš microarray, 60 proteominiai funkcijos buvo iki reguliuojama ir 46 buvo žemyn reguliuoja skrandžio vėžio mėginiai (p
< 0,01). Multimarker grupavimas parodė dvi savitas PROTEOMIKOS profiliai nepriklausomai nuo amžiaus ir tautybės. Aštuoniolika iš 19 vėžio mėginių suburiama (jautrumas 95%), o 27/36 ne vėžio mėginių sugrupuotos į antrą grupę. Devyni ne vėžio mėginiai, kad susitelkę su vėžio atrankinė 5 anksto piktybinius pakitimus (1 adenomatozinio polipas ir 4 žarnyno Metaplasia). Patvirtinimas naudojant antrąją pavyzdys su atitinkamomis parodė, jautrumą ir specifiškumą, kad būtų 88% ir 93%, atitinkamai. Teigiama prognostinė vertė kartu duomenimis buvo 0,80. Pasirinkti peptidas sekos nustatytos pepsinogen C ir pepsino aktyvavimo peptido, kaip smarkiai žemyn reguliuojama ir alfa-defensin kaip gerokai iki reguliuojama.
Išvada
Šis paprastas ir atkuriami multimarker PROTEOMIKOS tyrimu galėtų papildyti klinikinį gastroscopic vertinimą simptominių pacientų didinti diagnostikos tikslumas skrandžio vėžio ir iš anksto piktybinių pakitimų.
faktai
Skirtingai nuo kitų bendrų vėžio, dėl daugelio skrandžio vėžiu sergančių pacientų prognozė yra prasta ir pagerėjo šiek tiek per pastaruosius kelis dešimtmečius. Penkerių metų išgyvenamumas dėl skrandžio vėžio yra žymiai mažesnė nei visų pagrindinių vėžio išskyrus vėžio, kepenų, kasos ir stemplės [1]. Atsižvelgiant į tai, kad anksti skrandžio vėžys yra daug geriau prognozę (5 metų išgyvenamumas maždaug 90%) nei išplitusiu skrandžio vėžiu (5 metų išgyvenamumo 3-10%) [2, 3], pasaulinė mirtingumas nuo skrandžio vėžio turėtų gerokai sumažėti priemonės, dėl kurių downstaging navikų pirminio diagnozę.
Nors gastroskopija yra aukso standartas skrandžio vėžio diagnozę, jos tikslumas nėra toks didelis, kaip ji yra gerybinių skrandžio ligų, tokių kaip skrandžio opa, ypač geografinius regionus mažai tarpiniam skrandžio vėžio paplitimą. Iš praleistą vėžio diagnostikos procentais, pranešė kaip 4,6%, 14% ir net 33% [4-6], nėra nereikšmingas. Net Japonijoje, klaidingai neigiamų norma buvo pranešta, kad 19% [7]. Šie duomenys sutampa su teigiama prognostinė vertė tik 0,4 - 0,7 endoskopinių diagnozuoti skrandžio vėžį skirtingų centrų [8-10]. Nors praleistų diagnozių dalis atrodo mažas, absoliutus skaičius pacientų paneigta diagnozė naudos ne išgydomos etape nereikšminga. Net ne šiek tiek mažas klaidingai teigiamo diagnostikos norma 5%, daugiau nei 47.000 skrandžio vėžio būtų nepasinaudota vien vieno mažo paplitimo šalyje (JAV) per vienerius metus, 2000 [11]. Endoskopinė vertinimas dažnai yra gleivinės biopsijos, bet nėra klinikinių standartai arba optimalaus skaičiaus biopsijos ar anatominių regionuose, turėtų būti atrinkti. Visuotinai aktai rekomendacija imtis bent septynis biopsijos teisingai diagnozuoti skrandžio vėžį [12]. Į vis dėlto šiame tyrime, visiškai 17% visų pažeidimų vėliau įrodyta, kad būti piktybiniai buvo laikomi gerybinė dėl endoskopu. Taigi, endoskopinis gleivinės tyrimo kenčia nuo tarpusavio stebėtojo variacijos, neoptimaliai koreliacija su histopatalogiją, sunku aptikti gleivine vėžio ir nekliudomai vizualizacija visų anatominių subregionų pvz . Po ankstesnės skrandžio operacijos [13, 14]
Skrandžio skystis susideda iš išskiriami tirpių ir akytasis korinio baltymų mišinio iš viso skrandžio gleivinės - įskaitant regionus, kurie negali būti adekvačiai įvertintas fibreoptic gastroskopijos. Todėl motyvuotas, kad PROTEOMIKOS aprašymą skrandžio skysčio, paprastai laikomas šalutiniu produktu atliekų gastroscopic nagrinėjimo metu, gali naudingai papildyti įprastą klinikinį įvertinimą, teikiant "molekulinį biopsiją", kad būtų veiksmingai mėginių visą skrandžio gleivinę, ypač baltymų aptikimo metodų tokių kaip masių spektrometrijos gali būti labai jautrūs. Jei atliekami per kliniškai nurodytu gastroskopijos žinoma, gauti skrandžio skysčio nedidina procedūros invazinis. Skirtingai nei plazmos proteomos, skrandžio skysčio Proteome greičiausiai bus mažiau sudėtingas, bet prisodrintas ligų konkrečių biologinių žymenų, generuojamas tiesiai į ligos svetainėje. Tie patys biologiniai žymenys, net jei yra kraujo plazmoje, gali būti skiedžiamas už aptikimo ir sumaišytas su kitais gausiai sisteminių baltymų apribojimus, kurie atspindi vienu metu patofiziologinių sąlygas (pvz gretutinių ligų), o ne anatominės specifinės vietos ligą.
mes tyrė naujas požiūris į besivystančias biologinių žymenų, skirtų skrandžio vėžio profiliavimo tirpių sekretuojamą peptidai esančių endoskopijos įsiurbimo skrandžio skysčio ir baltymų išgaunamas iš akytasis epitelinių ląstelių, taip pat susigrąžintų endoskopijos metu paviršinis padidinto lazerio desorbcija jonizacijos laiko iš skrydžio (SELDI TOF) masių spektrometrija. Mūsų rezultatai rodo, kad daug baltymų biologiniai žymenys iš organų konkretaus šaltinio, ty skrandžio sultyse, generuoti savitą skrandžio vėžys parašu patvirtina, kad nusipelno tolesnio plėtojimo kaip priemonė gerinti diagnostikos tikslumą gastroskopijos ir turi potencialą aptikti ankstyvos stadijos skrandžio vėžiu ir iš anksto piktybinis pažeidimai (žarnyno Metaplasia ir displazija).
metodai
klinikinius mėginius
buvo gauti Skrandžio skysčiai gastroskopijos nakties nevalgius matė ne Singapūro General Hospital metu. Tyrimo protokolas buvo patvirtintas etikos komiteto Singapūro pagrindinė ligoninė. ir atitiko Helsinkio deklaracijoje 1995 indikacijos gastroskopijos buvo tik klinikinę ir nepriklauso nuo tyrimo nuostatų. Pradinė analizė buvo atliekama mokymo rinkinys iš 19 mėginių iš histologiškai patvirtintas skrandžio adenokarcinomos (13 žarnyno tipo, 4 difuzinis tipo, 1 mišraus tipo, 1 neapibrėžta) [15] ir 36 mėginių iš pacientų, kuriems yra kliniškai gerybinių skrandžio sąlygomis. Amžiaus vidurkis 19 skrandžio vėžiu sergančių pacientų (13 vyrų, 6 moterų; 17 kinų, 2 Indijos) buvo 68 metai. Pasiskirstymas pagal Amerikos jungtiniame komitete dėl Vėžys (AJCC) Klinikiniai sustojimo buvo 0 etapas (1 pacientas), I etapas (4 pacientai), II etapas (2 pacientams), III etapas (2 pacientai) ir IV etapas (10 pacientai). Amžiaus vidurkis 36 pacientai, sergantys gerybine skrandžio sąlygomis (19 vyrų, 17 moterų; 33 kinų, 2 malajų, 1 indas) buvo 57 metai. Klinikinių diagnozės po endoskopu ne-vėžiu sergantiems pacientams buvo normalus (9), antralinių gastritas (9), gastritas (6), opa (4), hiatal išvarža (3), hiperplazinį polipų (2), Barrett'o stemplės (1), fundic randų (1) ir adenomatozinio polipas (1).
klasifikavimo algoritmą sukurta iš mokymo rinkinys buvo patikrintas aklu analizės patikimumą rinkinyje, sudarytame iš kito 24 histologiškai patvirtinta skrandžio adenokarcinoma (10 žarnyno tipas, 7 difuzinis tipo, 1 mišri tipo, 5 neapibrėžta, 1 neuroendokrininių) ir 29 kliniškai gerybinių skrandžio mėginius. Amžiaus vidurkis šių 24 skrandžio vėžiu sergančių pacientų (18 vyrai, 6 patelėms; 21 kinų, 3 Malay) buvo 70 metų. Pasiskirstymas pagal AJCC klinikinė stadija buvo I etapas (5 pacientai), II etapas (4 pacientai), III etapas (2 pacientai) ir IV etapas (12 pacientai). Vienas pacientas patvirtinimo rinkinys sumažėjo tolesnį tyrimą ir negalėjo būti pastatyta. Amžiaus vidurkis 29 ne vėžiu sergančių pacientų (11 vyrų, 18 moterų; 26 kinų, 2 indų, 1 Malajų) buvo 47 metai. Klinikinių diagnozės po gastroskopijos ne-vėžiu sergantiems pacientams buvo gastritas (14), fundic liaukų polipų (2), ūmus skrandžio opa (2), duodenitu (2), hiatal išvarža (1) ir normalus (8).
Nei vienas iš skrandžio vėžiu sergantiems pacientams negavo jokio vėžio gydymo ties gastroskopijos laiko formą.
Atsižvelgiant mokymą bei bylas kartu, 19% (8/43) ir 29% (19/65) pacientų su skrandžio vėžio ir gerybinės skrandžio sąlygos, atitinkamai, buvo teigiami H. pylori
, skirtumas, kad nebuvo reikšmingas iki miesto Fišerio testas (2-sided psl
reikšmė = 0,4508).
Imties rinkimas ir apdorojimas
Skrandžio skystis buvo įsiurbimo į sterilų konteinerį prie pradžios endoskopija, priskiriamas anoniminiams kodą ir iš karto ant ledo. Kraujo ir arba tulžies tamsintas mėginiai buvo atmestas. Tik kliniškai įtartinus gleivinės pakitimai buvo biopsiją ties endoscopist nuožiūra. Skrandžio skysčiuose buvo centrifuguojamas 180 g 6 minutes, esant 4 ° C, iš kurių viršutinis sluoksnis buvo centrifuguojamas vėl, esant 16 100 g 30 minučių, esant 4 ° C temperatūroje. Granulės iš abiejų centrifugavimų buvo sujungti. Greitųjų supernatantai buvo laikomi atskirai nuo granulių iki -80 ° C.
Baltymai profiliavimas
Atšildyto 10 mikrol kiekvieno skrandžio skysčio mėginį buvo taikoma įvairių cheminių paviršių proteinchip matricos (Cipergen Biosystems Inc, Kalifornija , JAV): (a) vario (II) imobilizuotą metalo Affinity surinkimo (IMAC3) į 100 pL 1 mol /L karbamido, 1 g /l 3 buvimą - [(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate ( CHAPS), 0,3 mol /l KCl, proteazės inhibitorius kokteilis (Roche Diagnostics, Manheimas, Vokietija), 50 mol /l TrisHCl, pH 7,5; (B) Silpnas katijonų mainų (WCX2 ir CM10) į 100 pL 50 mmol /l natrio acetato, 1 g /l oktil gliukopiranozido, proteazių inhibitorius kokteilio, kurio pH 5 buvimą; (C) Stiprus anijonų mainų (SAX2) į 100 pL 50 mmol buvimą /L TrisHCl, 1 g /l CHAPS, proteazės inhibitorius kokteilis, pH 8; ir (d) hidrofobinės sąveikos (H50) į 100 pL 5 ml /L trifluoracto rūgštį. Nuplovus 100 įxL pačioms buferiai, buvo įtraukta sinapinic rūgštis palengvinti desorbcijos ir jonizacijos. Lustai buvo analizuojami SELDI-TOF-MS (PBSII, Cipergen Biosystems Inc). Vėžio ir kontrolė buvo susimaišė ir paleisti tuo pačiu metu toje pačioje lustą ir keliuose lustų, siekiant sumažinti lustas-į-chip variaciją.
Skrandžio sultyse granulės buvo resuspenduotos 25 pL 6 mol /L guanidino tiocianatą, 5 g /l oktilo gliukopiranozid 0,1 mol /l Hepes, pH 7, ir 100-200 mikrol, 9 mol /L karbamido, 2 g /l CHAPS, 50 mmol /l TrisHCl, pH 7,5, purtant 45 minučių, esant 4 ° C temperatūroje. Po centrifugavimo, esant 20 000 g 5 minutes, 10 mikrol ekstrakto buvo taikomas proteinchip matricos, kaip aprašyta aukščiau.
Retentato žemėlapį buvo sukurtas, pagal kurias atskiri baltymai buvo rodomi skirtingais smailių dėl jų masės į krūvio santykio pagrindu , Duomenys proteominius spektrų buvo analizuojami Cipergen Express Data Manager "programinė įranga su Pattern Track ir dvipusio hierarchinė grupavimo algoritmas. Sulygiuoti viršūnės su signalo ir triukšmo santykis didesnis negu 3 buvo normalizavosi visuminę jonų srovė. Proteominiai funkcijos buvo toliau analizuojami naudojant reikšmingumo analizę mikrogardelių (SAM) programinę įrangą iš Stanfordo universiteto. Paketas buvo sukurta siekiant spręsti specifines Mikrogardelė duomenų analizės (signalo ir triukšmo santykis dispersijos skiriasi nuo geno geno daug duomenų taškų iš nedidelio skaičiaus mėginių) problemas, bet mes radome, kad ji būtų taikoma PROTEOMIKOS duomenų analizę, taip pat. Programinės įrangos algoritmas buvo aprašytas Tusher kt
. [16]. Trumpai ji apibrėžta rodiklis vadinamas skirtumas, palyginti su matavimo tarp dviejų arba daugiau grupių, duomenų skirtumą vietoj p
vertės. Jis dirbo su saviranka metodo variacijos ir pakartotinai suskirstyti tam tikrą duomenų rinkinio (spektrai, kurių sudėtyje yra PROTEOMIKOS funkcijas šiame tyrime) atsitiktinai į dvi grupes apskaičiuoti santykinį skirtumą kiekvienai iš kombinacijų. Iš kombinacijų skaičius buvo nustatytas, kad būtų 1000 šiame tyrime ir programinė įranga kompiuterinė 1000 santykinis skirtumas vertes kiekvienai PROTEOMIKOS funkcija. Santykinis skirtumas konkrečios grupės interesų (pastebėti santykinį skirtumą) buvo lyginamas su vidutiniu santykinis skirtumas nuo visų kombinacijų (tikimasi, santykinis skirtumas) kiekvieno funkcija ir funkcija buvo nuspręsta, kad aukštyn arba žemyn reguliuojama pagal tai, ar jos Pastebėjus santykinis skirtumas buvo didesnis arba mažesnis nei tikėtasi santykinis skirtumas kai kurios ribos. Programinė įranga Apskaičiuota klaidingą atradimas norma (taip pat apibrėžta atskaitos [16]) už kiekvieną ribinę vertę, kad suteikė netiesiogines priemones nustatytus Apipjaustymas. Kurią nustatė šį metodą žymenys buvo statistiškai reikšmingas. Netikras atradimas norma buvo nustatyta mažesnė nei 0,05 šiame tyrime.
Patvirtinti žymekliai nustatytus SAM, antra partija 53 apakinti mėginių buvo įtraukta į duomenų rinkinyje hierarchinę grupavimas naudojant Cipergen Express "Data Manager programinę įrangą. Nors Sam naudojamas pasirinkti žymekliai žinomi pavyzdžiai buvo tikimasi, kad gerai atlikti į grupes, aklu mėginiai buvo įtraukta išbandyti, kaip gerai žymekliai apibendrinti nežinomų pavyzdžių. Šio grupavimo rezultatai buvo tiesiog palyginti su tikrojo tapatumo mėginiai ir jokių papildomų klasifikavimo metodą arba bet kurį kitą programinę įrangą buvo panaudotas patvirtinimo.
Žymenų nustatymas
skrandžio skysčio baltymų buvo frakcionuotas anijonų mainų chromatografijos (K HyperD , Cipergen Biosystems Inc), naudojant pakopinį pokyčius pH išskyrimui. Baltymų, 50 mmol /l TrisHCl, 1 g /L oktil gliukopiranozido, pH 8 tirpiklius komponentų buvo toliau gryninama katijonų mainų masyvo (LWCX30), naudojant 50 mmol /l natrio acetato, 1 g /l oktilo gliukopiranozid pH 5, kaip privalomas ir Skalbimo buferis. Po to alfa-cian-4-hydroxycinnamic rūgštis energiją sugeriančių molekulių (Cipergen Biosystems Inc.), nepaskirstytasis baltymai buvo analizuojami PBSII ir Q-TOF (Vandenys /Micromass) įrengta proteinchip sąsaja (PCI 1000 Cipergen Biosystems Inc ") , Baltymai buvo būdingas MS /fragmentacija ir identifikavimas buvo padaryta paiešką duomenų bazėje, su Mascot (matrica mokslo Ltd., Londonas, Jungtinė Karalystė).
Žymenų tvirtinimas
Tai buvo atliekama trečiojoje rinkinio skrandžio skysčio mėginių gerybinis skrandžio ir skrandžio vėžiu sergantiems pacientams. Kiekvienas šviežiai Paimtas mėginys buvo apdorojami pašalinti tvirtą šiukšles ir sutelkti baltymų kiekis taip. Po to, kai pridedant fenilmetansulfonil fluorido, kad galutinė koncentracija 0,2 mM, mėginys buvo centrifuguojamas 15 minučių, esant 500 g ir 4 ° C temperatūroje. Proteazės inhibitoriai (Visas Mini ™, Roche Applied Science, Indianapolis, IN, JAV) buvo įtraukta į virš nuosėdų po išcentrinio membranos filtravimo ne 2 900 g ir 15 ° C temperatūrai (Amikon Ultra 4 išcentriniai filtras įrenginys, 5 000 nominalios molekulinio svorio riba; Millipore ", Billerica, MA, JAV), kol mėginio buvo sumažintas iki 10 - 20% jo pradinio tūrio. Bendro baltymo koncentracija buvo nustatomas pagal 2-D Quant Kit (Amersham Biosciences, Pisctaway, NJ, JAV). Pepsinogen, C ir alfa-defensin 1-3 koncentracija buvo nustatoma pagal imunofermentiniu (ELISA), naudojant rinkiniai nuo Alpco diagnostika (Salem, NH, USA) ir Hycult biotechnologijų B.V (Uden, Olandija), atitinkamai. Kiekvienas tvarkomi mėginys buvo tiriami dviem egzemplioriais už pepsinogen C ir defensin lygius naudojant tiekėjų protokolus. Mėginiai pepsinogen C tyrimu buvo iš anksto atskiesti 120 kartus. Koncentracijos pepsinogen C ir alfa-defensin 1-3 buvo nustatytos atsižvelgiant į jų atitinkamų standartinių kreivių ir išreikšta ng (pepsinogen C) arba pg (defensin) už mikrogramų viso skrandžio skysčio baltymų.
Helicobacter pylori Viesbutis The buvimas H. pylori pervežimas skrandžio audinių nustatė, vizualizacijos spiraliniais mikroorganizmų histologijos skyriuose ir /ar imunohistocheminiu. Keturių mikronų audinio skyriai buvo panaikinti vašku ir ksileno ir mažėjančių klasių etanolio. Antigenas paieška buvo kaitinant citrato buferiu, kurio pH 6,0. Pagrindinis antikūnai prieš H. pylori
(1:50 praskiedimas; DAKO A /S ", Glostrup, Danija) buvo po vidurinės antikūnų polimero nuorodą (Įsivaizduoti chemijos Matė, DAKO) ir ryškinamos naudojant diaminobenzidinas kaip chromogeną
. rezultatai
Keli tiekėjų ir žemyn reguliuojamos baltymų biologiniai žymenys skrandžio vėžio buvo atrastas skrandžio skysčio. Atstovas PROTEOMIKOS žemėlapis skrandžio skysčiuose yra parodyta 1 paveiksle yra gelis vaizdas iš masės spektre, rodo skrandžio sultyse baltymų pasirinktinai sujungtas su imobilizuota vario (II) metalo jono jų molekulinio svorio diapazone 1500 Da iki 6000 Da. Nustatytas didelis baltymų žymekliai žemyn reguliuojama vėžio skrandžio skysčio (psl
< 0,01) yra nurodyti rodyklėmis. 1 pav išraiška skirtumas žemėlapis skrandžio skysčio vario (II) imobilizuota metalo giminingumo surinkimo proteinChip array (IMAC3). Rodyklės rodo baltymų biologiniai žymenys žymiai skiriasi ekspresijos lygiu tarp dviejų grupių mėginių.
A reprezentatyvus proteo žemėlapį skrandžio skysčio nuosėdų ekstrakto kaip parodyta 2 paveiksle Baltymai buvo selektyviai jungiasi su katijonų mainų matricos paviršiaus. nustatė reikšmingų baltymų žymekliai būti aukštyn arba žemyn reguliuojama skrandžio vėžys skysčio rutuliuku (psl
< 0,01) yra nurodyti rodyklėmis. 2 pav išraiška skirtumas žemėlapis skrandžio skysčio granulių ekstraktu apie katijonų mainų proteinchip masyvo (WCX2). Rodyklės rodo baltymų biologiniai žymenys žymiai skiriasi ekspresijos lygiu tarp dviejų grupių mėginių
Vidutinis CV. (Variacijos koeficientą; kumuliacinis 10-15 pagrindinių skrandžio sultyse smailių per spektro, n = 8), skirtą imobilizuoto vario (II) proteinchip masyvo (IMAC3) buvo 12,8%, dėl katijonų mainų masyvo (WCX2) buvo 15%, dėl anijonitu masyvo (SAX2) buvo 17,3%, o visų hidrofobinės sąveikos lustą (H50) buvo 13,6%. Šie CV vertybės atitinka atkuriamumo vertinimo SELDI literatūros [17, 18].
Pagal SAM analize visų proteominius funkcijų (iš viso funkcijų 41 800, vidutinis skaičius už retentato žemėlapyje 314) skrandžio skysčių ir granulių ekstraktu buvo nustatyta 46 proteominiai funkcijos bus gerokai žemyn reguliuoja skrandžio vėžio ir 60 proteominiai savybės buvo gerokai iki reguliuojama skrandžio vėžio. (Duomenys iš įvairių sąlygų, pvz, skysčių ir granulių taip pat įvairių paviršių, buvo tiesiog sujungti kartu kaip atskiras funkcijas SAM. Žymekliai apie kurias SAM tiek granulių ir virš nuosėdų frakcijos buvo rankiniu būdu nustatyti ir atstovavo tik vieną kartą sąrašo, kai jie buvo laikoma biologiškai reikšmingas). Reikšmingai mažina reguliuojamos žymekliai įtrauktas 1884, 2428, 2594, 2840, 4050, 11720, 13700 da; gerokai iki reglamentuotos žymekliai įtrauktas 1761, 1831, 3372, 3443, 3605, 5160, 6780 da. (Dauguma svarbių žymenų buvo atrasta ant WCX2 ir IMAC-vario (II), po SAX2). Remiantis 106 labai skiriasi proteominius įranga (papildanti failų 1), buvo atliktas dvipusis hierarchinė grupavimas analizė (dvimatis visiškai jungtis). Dauguma skrandžio vėžio atvejų buvo sugrupuotos suformuoti savitą grupę (3 paveiksle ir papildomų failų 2). Pagrindinis komponentas analizė pačiu duomenimis taip pat atskleidė, kad vėžio ir gerybinės mėginiai gali būti gerai suskirstyti į dvi grupes, su 2 klaidingų neigiamų rezultatų (atstovaujančių pasikartojančius analizę toje pačioje byloje) ir 9 apgaulingų teigiamų, atitinkamai (4 paveikslas). Vienas skrandžio vėžys skysčio mėginyje (iš I etapo prastai diferencijuota skrandžio adenokarcinoma atveju) sugrupuotos tarp ne-vėžio mėginių; visi kiti 4 anksti (etapai 0 ir I) pacientai tinkamai sugrupuotos pavyzdžius iš 14 pacientų su II etapas - IV skrandžio vėžio, suteikiant bendrą diagnostinį jautrumą 95% (18/19 skrandžio vėžiu sergantiems pacientams) apie mokymo rinkinys. 3 pav išraiška skirtumas žemėlapis skrandžio skysčio ir granulių ištrauka baltymų mokymo imties pavyzdžių apie keturis proteinChip matricos, rodomas dvipusio hierarchinę grupavimas. Svarbūs proteominiai funkcijos rodomi vertikaliai. Iš juodai baltos intensyvumas rodo, santykinio baltymų lygiu, didesnio arba mažesnio nei vidutinė vertė laipsnį. Pacientų atvejai pateikiami horizontaliai; dauguma skrandžio vėžiu sergantiems pacientams yra glaudžiai sugrupuotos. Šis skaičius rodo viršutinę kvartiliui visą vaizdą (žr Papildoma failą 2 už visą vaizdą).
4 pav pagrindinis komponentas analizė sklypas proteominius bruožų mokymo imties pavyzdžių. Vienoje plokštumoje (žymimas juoda linija) mėginius skirsto į dvi grupes, kurių 1 klaidingai neigiamas (parodyta pasikartojančius dėmės) ir 9 apgaulingų teigiamų.
Devyni iš 36 ne vėžio mėginių mokymo komplekto sugrupuotos su vėžio mėginiai (specifiškumas 75%). Iš jų 1 buvo displazija adenomatozinio polipas - priešvėžinė pažeidimas [19]. Tarp kitų 8 pacientų, 6 buvo kliniškai nukreiptas biopsijos, kuri parodė, žarnyno metaplazijos 4 pacientams (67%). Aštuoni ne vėžiu sergantiems pacientams, kurių skrandžio skysčio baltymų profiliai susitelkę normalios grupės taip pat buvo kliniškai nukreiptas gleivinės biopsijos, kad parodė, žarnyno Metaplasia tik per 2 pacientams (25%). 1000 iš eilės skrandžio biopsijos atliekamos visų nuorodų apžvalga parodė bendrą paplitimą žarnyno metaplazijos Singapūro pagrindinė ligoninė per tyrimo laikotarpį 30%. Tai kontrastuoja su bent 67% žarnyno metaplazijos paplitimas tarp kliniškai gerybinių atvejais, kurių PROTEOMIKOS profiliai labiau susitelkę su skrandžio vėžio atvejų nei su kitais normals, atitinkančių žarnyno metaplazija yra tarpinis būvis į normalų skrandžio epitelio perėjimo prie skrandžio adenokarcinoma , Tiksliai identifikuoti žarnyno metaplazijos Endoskopiškai yra žinoma, kad netikslūs [20]. Taigi, skrandžio vėžio tipas PROTEOMIKOS anspaudas yra galbūt jautrus rodiklis šio anksto piktybinis pakitimas tarp pacientų kliniškai diagnozuotas nepiktybinės skrandžio sutrikimų buvimą.
Skrandžio vėžiu pacientams mokymo nustatytą buvo gerokai vyresni (amžiaus vidurkis 67,7 metų), nei pacientams, sergantiems gerybine skrandžio sąlygomis (vidutinis amžius 56,6) (p
= 0.0062). Spręsti galimybę, kad baltymų profiliai buvo susiję su amžiaus ar tautybės, mes vėl analizavo duomenis iš Kinijos pacientų virš 55 metų amžiaus pogrupyje. Tai lėmė, 1/17 vėžio neteisingai klasifikuotos (tas pats navikas, kuris buvo neteisingai klasifikuotos kai buvo analizuojami visi 19 vėžio; jautrumas 94%) ir 4/17 kontrolės neteisingai klasifikuotos (tie patys 4 kontrolė, kad buvo tarp 9 neteisingai klasifikuotos gerybinių atvejais; specifiškumas 76,5%) .
Mes kitas išbandytas faktinį našumą proteominius profilių skiriamasis vėžio nuo gerybinių mėginių antrame serijos 53 apakinti skrandžio skysčio ir granulių ištrauka mėginių (24 skrandžio vėžiu ir 29 gerybinių skrandžio sutrikimų) (papildomas failų 3). Dvidešimt vienas iš 24 skrandžio vėžio buvo teisingai identifikuotas (jautrumas 88%) ir 2 iš 29 gerybinių mėginių buvo neteisingai klasifikuojami (specifiškumas 93%) (5 pav.) 5 paveikslas išraiška skirtumas žemėlapis skrandžio skysčio ir granulių ištrauka baltymų patvirtinimo nustatytus mėginių keturiuose proteinchip masyvų, rodoma dvipusio hierarchinę grupavimas. Svarbūs proteominiai funkcijos rodomi horizontaliai. Iš raudonos arba žalios spalvos intensyvumas rodo santykinį baltymų lygis, didesnis ar mažesnis nei vidutinė vertė laipsnį. Pacientų atvejai pateikiami vertikaliai; dauguma skrandžio vėžiu sergantiems pacientams yra glaudžiai sugrupuotos.
Pasirinktos PROTEOMIKOS žymekliai (remiantis reikšmingumo balas nustatomas pagal SAM) buvo pusiau gryninama proteinChip masyvų ir nustatė tiesiai ant dėmės susidūrimo sukelto disociacijos sekos (6 paveikslas). Keletas reikšmingai mažina reguliuojamų žymenų vėžiu sergantiems pacientams parodyta 1 ir 2 paveiksluose, 1881,9 DA, 2041,0 DA, 2188,1 DA ir 2387,3 DA, buvo nustatyta, kad pepsinogen C ir pepsino aktyvavimo peptidas fragmentai (1 lentelė). Buvo nustatyti iki reguliuojama trynės žymekliai vėžiu sergantiems pacientams, nurodyti 2, 7 ir papildoma skaičiais failų 4 būti alfa defensin-1,2,3. Intensyvumas sklaida sklypai rodo labai didelius skirtumus vidutinių intensyvumo defensin ir pepsino fragmento tarp gerybinės kontrolės ir skrandžio vėžio skysčių mėginiai (p = 0,003 pervežimas ir 0,00002, atitinkamai) (8 pav.) Naudojant IFA specifinis pepsinogen C, mes patvirtino gerokai mažesnes koncentracijas skrandžio vėžio skysčių (11,9 ± 0,1 ng /mikrogramų bendrųjų baltymų; vidurkis ± SEM n = 6.) Nr palyginti su gerybinių mėginių (21,5 ± 1,4 ng /mikrogramų bendrųjų baltymų =. 23) trečiojoje mėginio rinkinys (p
= 0,0126; Studento neporiniai du-tailed T
testas). IFA atlikta tą pačią imtį defensin lygių parodė didesnės koncentracijos skrandžio vėžio mėginių (63,4 ± 9,2 pg /mikrogramų bendrųjų baltymų; vidurkis ± SEM, n = 6), nei gerybinių mėginių (46,2 pg /mikrogramų bendrųjų baltymų; vidurkis ± SEM n = 23) ((p
= 0,0654; Stjudento t
testas) .table 1 peptidų seka nustatyti MS //MS
peptidų m /Z
seka
Baltymai atitikimo
Mowse † rezultatas
Mowse rezultatas su gerokai homologijos
2386.29
FLKKHNLNPARKYFPQWKA
Pepsino aktyvavimo peptidas
35
> 28
2187,12
FLKKHNLNPARKYFPQW
Pepsino aktyvavimo peptidas
18
> 26
2040,03
LKKHNLNPARKYFPQW
Pepsino aktyvavimo peptidas
28
> 26
1775,95
FLKKHNLNPARKYF
Pepsino aktyvavimo peptidas
47
> 26
1628,84
LKKHNLNPARKYF
Pepsino aktyvavimo peptidas
40
> 28 1880,92
LRTHKYDPAWKYRF
Pepsinogen C aktyvacijos peptidas
31
>
; 22
† Mowse rezultatas = -10Log ( P), kur P = tikimybė, kad rungtynės yra atsitiktinis įvykis (P
< 0,05) m /z
, masė /imti
6 pav Aukštos skyros masių spektrą frakcionuoto skrandžio skysčio proteinais LWCX30 proteinchip masyvo gaunamas pakeitimo QTOF įrengta PCI1000 sąsaja. Saugiklių viršūnės buvo atliktas susiskaldymo analizės susidūrimo sukelto disociacijos MS /.
7 pav Aukštos skyros masių spektrą skrandžio skysčio proteinais H50 proteinchip masyvo gaunamas pakeitimo QTOF įrengta PCI1000 sąsaja. Šis skaičius rodo, aukštyn-reguliuojamas trynukų žymekliai skrandžio vėžio. Žiūrėkite papildomų failų 4 Pilną atvaizdą.
8 pav Rozdmuchanie sklypus intensyvumo verčių defensin ir pepsino fragmentas, esančio skrandžio skysčių mėginiai gerybinės kontrolės ir skrandžio vėžiu sergančių pacientų iš mokymo rinkinys.
Diskusijos
Mūsų duomenys rodo, kad spektrinis profilis nefrakcionuotų skrandžio skysčio gali būti naudinga papildoma priemonė vėžio diagnostikos ir aptikimo ankstyvoje stadijoje liga, kai ji derinama su klinikine gastroskopijos. Dauguma naujausi bandymai nustatyti baltymų biologinius žymenis skrandžio vėžio tiriami serumo [21-29] ir audinius [24, 30-37], ir vis dažniau naudojami masės spektrometrija. Senesni pranešimai Serologinių tyrimų atskirų žinomų naviko žymenų pvz CEA, CA 19-9, CA 72-4, CA242 ir Tag-72, paprastai būna mažas jautrumas (< 50%) [38-41]. Be to, yra žymiu tarptautiniu-pozityvumo iš šių naviko žymenų ne-skrandžio vėžio pvz iškėlė CEA ir MG7-Ag koncentracija yra paplitusi storosios žarnos vėžio, cholangiokarcinoma, kasos karcinoma, ir net sveikų [40, 23]. Nenuostabu, kad tokie serumas naviko žymenys neturi nustatytą vaidmenį skrandžio vėžio diagnostikos ir patikros, nors jie gali tarnauti kaip prognozinius rodiklius ir anksti žymenų pasikartojančių ligos šias pašalintas skrandis [39, 41, 42].
Mes pasirinkome nagrinėti PROTEOMIKOS profiliai skrandžio skysčio ligų biologinių žymenų, nes ji atrodė tikėtina, kad pasipiktinimas skrandžio baltymų sekrecijos piktybinių ir iš anksto piktybinių narių, kartu su galimo buvimo akytasis vėžinių ląstelių, būtų galima sukurti išskirtinius PROTEOMIKOS profilius. Kaip ieškoti serumo biologinių žymenų, kelios grupės ištyrė diagnostikos įrankis žinomų naviko žymenų skrandžio sulčių. Nei CEA nei CA 19-9 pozityvumo skrandžio skysčio parodė diagnostikos tikslumas [43-46]. Alfa-1 antitripsino skrandžio sulčių neseniai buvo pranešta, kad skrandžio vėžio biologinis žymuo [47, 48].
Mūsų požiūris į besivystančių jautrų metodą skrandžio vėžio diagnostikos skyrėsi nuo ankstesnių tyrimų trimis būdais. Pirma, mes pasirinkome biologinį mėginį, kuris buvo vargonai konkretaus (pvz endoskopijos įsiurbimo skrandžio skysčio), o ne sisteminis (pvz serumas), motyvai, kad molekulinės savybės būtų labiau tikėtina, kad liga-konkretus. Antra, masės spektrometrija leido mums imtis nešališką atradimas pagrįstą požiūrį. Trečia, mūsų duomenys generuojami profilius keliais proteominius žymekliais, kad vis dažniau laikomi turinčiais aukštesnį jautrumą ir specifiškumą nei vieno naviko žymenų [49, 50]. Skrandžio vėžio, derinant net 2 ar 3 naviko žymenų pasiektus geriau diagnostikos tikslumas lyginant su vien tik vieno persekiotoją [38, 40].
Baltymų pirštų atspaudai skrandžio skysčio nuo skrandžio vėžiu sergančių pacientų parodė, 106 proteominius funkcijų, kurios buvo gerokai iki viso - arba žemyn reguliuojama (papildomi failai 1 ir 3). Du garsūs žymekliai buvo atrinkti identifikavimo MS /MS. Pepsinogen A ir pepsinogen C aktyvavimo peptidai buvo žemyn reguliuoja skrandžio skysčių, paimtiems iš skrandžiai su histologiškai patvirtinta adenokarcinomos. Iš Kriostatas skyriuose skrandžio vėžio tyrime taip pat pranešė apie nemažą žemyn reguliavimą pepsinogen C, kuriame nurodomi MS /MS, auglio audinio [51].

• Genetiniai linijas iš nediferencijuotą tipo skrandžio karcinoma išnagrinėtų neprižiūrimą grupavimo genomo DNR microarray data
• MIR-146A rs2910164 G /C polimorfizmo ir skrandžio vėžys jautrumas: meta-analizė