Rozlišovaciu žalúdočnej tekutiny proteomu v karcinómu žalúdka odhaľuje diagnostický profil viac biomarkerov

Výrazná žalúdočné tekutiny Proteome u karcinómu žalúdka odhaľuje diagnostický profil multi-biomarkerov
abstraktné
pozadia
Celkové žalúdka prežitia rakoviny je stále nedostatočná hlavne preto, že neexistujú žiadne spoľahlivé metódy na identifikáciu vysoko vytvrditeľné skorú choroba štádia. Multi-proteín profiling žalúdočných tekutín, získané z anatomického miesta patológie, by mohla odhaliť diagnostické epigenomických odtlačky prstov.
Metódy
Proteínové profily boli generované zo vzoriek rakoviny žalúdka 19 a 36 pacientov s benígna gastritides žalúdočnej tekutine prechádza voliteľný, klinicky -indicated gastroskopia s použitím povrchom zosilneného laserovej desorpcie /ionizácie time-of-flight hmotnostnej spektrometrie na viac ProteinChip polí. Proteomické rysy boli porovnané podľa významu analýzou mikročipov algoritmu a obojsmerné hierarchického zhlukovaniu. Druhý set oslepený vzorka (24 karcinómov žalúdka a 29 klinicky benígne gastritides) bol použitý na overenie.
Výsledky
podľa významu analysyis z mikročipu, 60 proteomické rysy boli up-regulovaná a 46 boli down-regulované vo vzorkách s karcinómom žalúdka (p Hotel < 0,01). Multimarkerový clustering ukázal dve významné epigenomických profilov nezávisle na veku a etnického pôvodu. Osemnásť z 19 vzoriek s rakovinou zoskupené (citlivosť 95%), zatiaľ čo 27/36 vzoriek nerakovinotvorných zoskupených v druhej skupine. Deväť vzorky non-rakovinové, ktoré klastrov sa vzorky s rakovinou zahrnuté 5 pre-malígne lézie (1 adenomatóznej polyp a 4 črevné metaplázia). Overenie pomocou druhej sady vzorky ukázala, že senzitivita a špecificita, že je 88% a 93%, v danom poradí. Pozitívna prediktívna hodnota kombinovaných dát bola 0,80. Vybrané peptidové sekvencie identifikované pepsinogénu C a pepsín A aktivačný peptid, ako významne down-regulované a alfa-defenzínov ako významne up-regulované.
Záver
tento jednoduchý a reprodukovateľné multimarkerový proteomickou testu by mohol doplniť klinické hodnotenie gastroskopicky symptomatických pacientov k zlepšeniu Diagnostická presnosť rakovinou žalúdka a premalígnych lézií.
pozadia
na rozdiel od iných bežných druhov rakoviny, prognóza pacientov s karcinómom žalúdka najviac je zlá a zlepšila málo v priebehu posledných niekoľkých desaťročí. prežitie päťročné rakoviny žalúdka sú podstatne nižšie ako vo všetkých hlavných druhov rakoviny s výnimkou rakoviny pečene, pankreasu a pažeráka [1]. Vzhľadom na to, že rakovina žalúdka v počiatočnej fáze má oveľa lepšiu prognózu (5-ročné prežitie približne 90%) než pokročilého karcinómu žalúdka (5-ročné prežitie 3-10%) [2, 3], globálne úmrtnosť na rakovinu žalúdka by sa podstatne znížiť tým, opatrenia, ktoré vedú k downstaging nádorov v čase stanovenia diagnózy.
keď gastroskopia je zlatý štandard pre žalúdka diagnostike rakoviny, jeho presnosť nie je tak vysoká, ako je to pre benígne ochorenie, ako je žalúdočné peptické vredy, a to najmä v geografických oblastiach nízku až strednú žalúdočné výskytu rakoviny. Percento zmeškané diagnostike rakoviny, označená ako 4,6%, 14% a dokonca 33% [4-6], nie je zanedbateľná. Dokonca v Japonsku, falošne negatívny nárast bol zaznamenaný na 19% [7]. Tieto dáta sú v súlade s pozitívne prediktívne hodnoty iba 0,4 až 0,7 pre endoskopickú diagnostiku karcinómu žalúdka v rôznych centrách [8-10]. Hoci podiel zmeškaných diagnóz sa objavia malé, absolútny počet pacientov odopretá výhoda diagnózy v vytvrditeľné fáze nie je zanedbateľný. Aj pri mierne nízkej falošnej pozitivity diagnostických vo výške 5%, viac ako 47.000 žalúdočné rakoviny by boli minul v jednom nízkym výskytom samotnej krajine (USA) v jednom roku, 2000 [11]. Endoskopické posúdenie často zahŕňa slizničnej biopsia ale nie sú tam žiadne klinické štandardy pre buď optimálneho počtu biopsiou alebo anatomických oblastí, ktoré by mali byť do vzorky. Bežne citované odporúčanie je, aby aspoň sedem biopsie správne diagnostikovať rakovinu žalúdka [12]. V tejto štúdii však dokonale 17% všetkých lézií následne ukázali byť malígne boli považované za neškodné na endoskopii. Tak, endoskopická slizničnej vyšetrenie trpí inter-pozorovateľ variácii, suboptimálne korelácia s histopatológie, ťažkosti pri zisťovaní LIEKU Submukózna rakoviny a nerušený vizualizáciu všetkých anatomických podoblastí napr . Po predchádzajúcej operácii žalúdka [13, 14]
žalúdočné tekutina obsahuje zmes vylučovaných rozpustné a exfoliovaných bunkových proteínov z celej žalúdočnej sliznice - vrátane oblastí, ktoré nemôžu byť adekvátne vyhodnocovať fibreoptic gastroskopicky. Preto vyvodzoval, že proteomická profil žalúdočné tekutinou, zvyčajne považovaná za odpad vedľajší produkt pri gastroskopicky vyšetrenie, mohla vhodne doplniť konvenčné klinické hodnotenie tým, že poskytne "molekulárnej biopsiu ', ktorá účinne vzoriek kompletnú žalúdočnú sliznicu, najmä čo sa techniky detekcie proteín takých ako hmotnostná spektrometria môžu byť veľmi citlivé. Ak sa vykonáva v priebehu klinicky indikované endoskopicky, získanie žalúdočné tekutiny nezvyšuje invazivitu postupu. Na rozdiel od plazmy proteomu, žalúdočné Proteome kvapalina je pravdepodobné, že bude menej zložité, ale obohatená ochorenie špecifických biomarkerov, je generovaný priamo v mieste ochorenia. Rovnaké biomarkery, a to aj pokiaľ sú prítomné v plazme, môže riediť za hranice detekcie a zmieša s inými hojnejší systémových proteínov, ktoré odrážajú súbežných patofyziologické podmienok (napr ďalšími chorobami ochorenie), skôr než anatomického site-specific ochorenia.
skúmali sme nový prístup k rozvoju biomarkerov rakoviny žalúdka profilovaním rozpustných vylučovaný peptidy prítomné v endoskopicky odsať žalúdočné šťavy a bielkovín získaných z exfoliovaných epitelové bunky, a to aj získaných počas endoskopie podľa povrchom zosilneného laserovej desorpcie-ionizácie time-of-flight (Šelda TOF), hmotnostná spektrometria. Naše výsledky naznačujú, že viac proteínové biomarkery od zdroja orgánov špecifická, tj žalúdočné tekutiny, generovať výrazný žalúdočné podpis rakovina, ktorá si zaslúži ďalší vývoj ako nástroj na zlepšenie diagnostickej presnosti gastroskopia a má potenciál pre detekciu ranom štádiu rakoviny žalúdka a pre-malígne lézie (črevná metaplázia a dysplázia).
Metódy
Klinické vzorky
žalúdočnej tekutiny boli získané počas gastroskopia časti cez noc na lačno pacientov videný v General Hospital v Singapure. Protokol štúdie bol schválený etickou komisiou zo Všeobecnej nemocnice v Singapure. a zodpovedalo ustanovenia Helsinskej deklarácie 1995. Indikácie pre gastroskopia boli výhradne klinickej a boli nezávislé štúdie. Počiatočná analýza bola vykonaná na cvičnom súbore 19 vzoriek z histologicky dokázaný žalúdočnými adenokarcinómy (13 črevnej typ, štyri difúzny typ, jeden zmiešaný typ, 1 neurčitý) [15] a 36 vzoriek od pacientov s klinicky benígnych žalúdočných podmienok. Priemerný vek 19 pacientov s rakovinou žalúdka (13 samcov, 6 žena, 17 čínskych, 2 indický) bolo 68 rokov. Distribúcia Spoločným výborom amerického rakoviny (AJCC) klinickom štádiu bol stupeň 0 (1 pacient), I. etapa (4 pacienti), fáza II (2 pacienti), fázy III (2 pacienti) a štádium IV (10 pacientov). Priemerný vek 36 pacientov s benígnych žalúdočných podmienok (19 samcov, 17 samice, 33 čínskych, malajských 2, 1 indický) bolo 57 rokov. Klinické diagnózy po endoskopia pacientov s non-rakovinou boli v normále (9), antrálnej gastritída (9), gastritída (6), vred (4), výhrez (3), hyperplastických polypy (2), Barrettov pažerák (1), fundu jazvy (1) a adenomatózna polypy (1).
algoritmus klasifikácie vyvinuté z trénovacej množiny bola testovaná pomocou zaslepeného analýzou validačnú množiny pozostávajúce z iného 24. histologicky potvrdené žalúdočné adenokarcinómov (10 črevnej typ, typ 7 difúzna, 1 zmiešané typ, 5 neurčitý, jeden neuroendokrinný) a 29 klinicky benígnych žalúdočných vzoriek. Priemerný vek týchto 24 pacientov s rakovinou žalúdka (18 mužov, 6 samíc 21 čínskych, 3 Malay) bolo 70 rokov. Rozdelenie podľa AJCC klinickom štádiu bola etapa I (5 pacientov), ​​etapa II (4 pacienti), fázy III (2 pacienti) a štádium IV (12 pacientov). Jeden pacient v sade validačný odmietol ďalšie vyšetrovanie a nemohla byť predstavený. Priemerný vek 29 pacientov s non-rakovinou (11 samcov, 18 samice, 26 čínskych, indických 2, 1 Malajzijské), bolo 47 rokov. Klinické diagnózy po endoskopicky pacientov s non-rakovinou boli gastritída (14), fundic žľazy polypy (2), akútne žalúdočný vred (2), duodenitída (2), výhrez (1) a normálny (8). Žiadny z
pacienti s rakovinou žalúdka dostal akúkoľvek formu liečby rakoviny v čase gastroskopia.
Užívanie odbornej prípravy a schvaľovania prípadov dohromady a 19% (8/43) a 29% (19/65) pacientov s rakovinou žalúdka a benígnych žalúdočných podmienky, v uvedenom poradí, boli pozitívne na H. pylori
, s tým rozdielom, že nebol významný tým, Fisherovho exaktného testu (2-obojstranné p
hodnota = 0,4508).
Odber a spracovanie
žalúdočné tekutina bola saním do sterilnej nádoby, a to na začiatku endoskopia, priradené anonymného kódu a ihneď umiestni na ľad. Hematoencefalickou alebo žlčových postriekané vzorky boli zamietnuté. Iba klinicky podozrivé lézie na sliznici boli biopsia na uváženia endoskopista. Žalúdočné tekutiny boli centrifugovány pri 180 g počas 6 minút pri teplote 4 ° C, z ktorej bol supernatant znovu centrifugován pri 16 100 g počas 30 minút pri teplote 4 ° C. Pelety z oboch odstredenia boli spojené. Supernatanty sa vysokorýchlostné boli uložené oddelene od peliet pri -80 ° C.
Protein profilovanie
Po rozmrazení, 10 ul každého žalúdočného vzorky tekutiny bol aplikovaný na rôzne chemické povrchy ProteinChip polí (Ciphergen Biosystems Inc., California , USA): (a) meď (II) s imobilizovaným kovom afinitnej zachytávacie (IMAC3) v prítomnosti 100 ul 1 mol /l močoviny, 1 g /l 3 - [(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propansulfonát ( CHAPS), 0,3 mol /l chloridu draselného, ​​koktail inhibítora proteázy (Roche Diagnostics, Mannheim, Nemecko), 50 mol /l TrisHCl, pH 7,5; (B) Slabá výmene katiónov (WCX2 a CM10) v prítomnosti 100 ul 50 mmol /l octanu sodného, ​​1 g /l oktyl glukopyranozidu, koktailu inhibítora proteázy, pH 5; (C) Strong Anion Exchange (Sax2) v prítomnosti 100 ul 50 mmol /L TrisHCl, 1 g /l CHAPS, koktail inhibítora proteázy, pH 8; a (d) hydrofóbne interakcie (H50) v prítomnosti 100 ul 5 ml /l kyseliny trifluóroctovej. Po premytí 100 ul rovnakých príslušných vyrovnávacích pamätí, bola pridaná kyselina sinapinová pre uľahčenie desorpcia a ionizácie. Tieto kúsky boli analyzované pomocou Šelda-TOF-MS (PBSII, Ciphergen Biosystems Inc.). Rakoviny a kontroly boli prelínajú a bežať súčasne na rovnakom čipe, a na viac čipov, aby sa minimalizovalo chip-to-chip variantu.
Pelety žalúdočnej tekutine boli resuspendované v 25 ul 6 mol /l guanidínu Tiokyanatan, 5 g /l oktyl glukopyranozidu, 0,1 mol /l HEPES pH 7, a 100-200 ul 9 mol /l močoviny, 2 g /l CHAPS, 50 mmol /L, pH 7,5 TrisHCI vírením počas 45 minút pri teplote 4 ° C. Po centrifugácii pri 20 000 g počas 5 minút, 10 ul extraktu sa nanesie na ProteinChip pole, ako je popísané vyššie.
Bielkovinový koncentrát mapa bola vytvorená, v ktorom boli zobrazené jednotlivé proteíny ako samostatné piky na základe ich hmotnosti účtovať pomer , Údaje o proteomických spektier boli analyzované pomocou Ciphergen Express Software Data Manager s Track vzorom a obojsmerného algoritmu hierarchického zhlukovaniu. Usporiadané vrcholy so signálom k pomeru šumu nad 3 boli normalizované podľa celkového iónového prúdu. Proteomické rysy boli ďalej analyzované pomocou analýzy významnosti microarrays softvéru (SAM) zo Stanford University. Balíček bol navrhnutý tak, aby riešenie problémov špecifických pre microarray analýzy dát (pomer signálu k šumu rozptylu sa líši od génu do génu, veľký počet dátových bodov z malého počtu vzoriek), ale zistili sme, že je použiteľný pre proteomické analýzy dát rovnako. Algoritmus softvéru opísal Tusher et al
. [16]. Stručne povedané to definované metriku relatívny rozdiel pre meranie rozdielu medzi dvoma alebo viacerými skupín údajov na miesto hodnoty p
. Že činné variáciu metódy Bootstrapping a opakovane delia danú sadu dát (spektra obsahujúci proteomických funkcie v tejto štúdii) náhodne do dvoch skupín pre výpočet relatívnej rozdiel pre každý z permutácií. Počet permutácií bol nastavený na 1000 v tejto štúdii a softvér počítaný 1000 hodnoty relatívnej rozdiel pre každý proteomické funkciu. Relatívny rozdiel konkrétneho zoskupenia záujmu (pozorované relatívne rozdiel) sa v porovnaní s priemernou relatívnou rozdiel od všetkých permutácií (očakáva relatívna rozdiel) každej funkcie a funkcia bola vyhodnotená ako up- alebo down-regulované podľa toho, že jeho pozorovaná relatívny rozdiel bol väčší alebo menší ako jeho očakávané relatívny rozdiel od určitej prahovej hodnoty. Tento softvér odhaduje falošný objav rýchlosť (tiež definovaný v referenčnom [16]) pre každú prahovú hodnotu, ktorá zaisťuje nepriamy komunikačný prostriedok pre nastavenie cutoff. Markery identifikovanej touto metódou boli štatisticky významné. Falošná objav rýchlosť bola nastavená na hodnotu menšiu ako 0,05 v tejto štúdii.
K overeniu značky zistené SAM, druhá dávka 53 zaslepených vzoriek bola pridaná do súboru dát pre hierarchické zhlukovanie pomocou softvéru Ciphergen Express Data Manager. Kým známej vzorky SAM slúži na výber značky boli čakal, že hrá dobre v zhlukovaniu, zaslepeného vzorky boli zaradené vyskúšať, ako dobre značky zovšeobecniť na neznámych vzorkách. Výsledky zhlukovaniu boli jednoducho porovnané skutočnú identitu vzoriek a nemali pokročilé metódy výkladu zaradenia alebo akýkoľvek iný softvér bol použitý v overení. Identifikácia
biomarkerov
žalúdočné proteínov tekutín boli frakčnom aniontoměničovou chromatografiou (Q HyperData , Ciphergen Biosystems Inc.), za použitia krokovo zmeny pH pre elúciu. Bielkoviny v 50 mmol /l TrisHCl, 1 g /l oktyl glukopyranozidu, pH 8 elučných boli ďalej čistené na katexovej pole (LWCX30) za použitia 50 mmol /l octanu sodného, ​​1 g /l oktyl glukopyranozidu, pH 5 za záväzné a umývanie vyrovnávacej pamäte. Po pridaní alfa-kyano-4-hydroxyskořicová kyselina energiu absorbujúcich molekúl (Ciphergen Biosystems Inc.), uchovávané proteíny boli analyzované pomocou PBSII a Q-TOF (Waters /Micromass) vybavený ProteinChip rozhranie (PCI 1000, Ciphergen Biosystems Inc) , Proteíny boli charakterizované fragmentácie a identifikácia MS /MS bola vykonaná pomocou vyhľadávacej databázy s Maskot (Matrix Science Ltd., Londýn, Veľká Británia).
Biomarkery validácia
bola vykonaná v treťom súbore vzoriek žalúdočnej tekutiny odobraté z benígne žalúdočné a pacientov s rakovinou žalúdka. Každý čerstvo získané vzorky boli spracované za účelom odstránenia pevné nečistoty a sústrediť sa na obsah proteínu nasledujúcim spôsobom. Po pridaní fenylmethansulfonylfluorid na konečnú koncentráciu 0,2 mM, vzorka bola odstreďovanie po dobu 15 minút pri 500 g a 4 ° C. Inhibítory proteázy (Complete Mini ™, Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA) bol pridaný k supernatantu s následným odstredivou membránovej filtrácie pri 2 900 g a 15 ° C (Amicon Ultra-4 odstredivé filtračné zariadenie, 5 000 menovitá medza molekulovej hmotnosti , Millipore, Billerica, MA, USA) do vzorky bola znížená na 10 - 20% svojho pôvodného objemu. Celková koncentrácia proteínu bola stanovená na 2-D Quant Kit (Amersham Biosciences, Pisctaway, NJ, USA). Pepsinogén C a alfa-defenzínov 1-3 koncentrácie boli stanovené pomocou enzyme-linked immunoassay (ELISA) za použitia súpravy od Alpco Diagnostics (Salem, NH, USA) a Hycult biotechnológie B.V. (Uden, Holandsko), v danom poradí. Každý spracovaný vzorka bol testovaný v dvoch vyhotoveniach na pepsinogénu C a hladiny defenzínov s využitím protokolov dodávateľov. Vzorky na stanovenie pepsinogénu C boli predriedenie 120-krát. Koncentrácia pepsinogénu C a alfa-defenzínov 1-3 boli odvodené s ohľadom na ich štandardné krivky a vyjadrí ako ng (pepsinogén C) alebo (str defenzínov) na mikrogram celkového proteínu žalúdočnej tekutiny.
Helicobacter pylori
prítomnosť H. pylori
v žalúdočnej tkanive bol identifikovaný vizualizácie špirálových mikroorganizmov v histologických sekcií a /alebo pomocou IHC. Štyri mikrónov Tkanivové rezy boli de-voskovaný v xylénu a klesajúcich stupňoch etanolu. Antigén bol vyhľadávania zahrievaním v citrátovom pufri, pH 6,0. Primárne protilátka proti H. pylori
(zriedenie 1:50, DAKO A /S, Glostrup, Dánsko), nasledovalo sekundárne protilátka polyméru odkazu (Envision Chem Mate, Dako) a vizualizované za použitia Diaminobenzidine ako chromogénu
. výsledky
viac up- alebo down-regulované proteínové biomarkery u karcinómu žalúdka boli objavené v žalúdočnej kvapaline. Reprezentatívny Proteomická mapa žalúdočnej tekutine je znázornené na obrázku 1. Ide o pohľad na gél hmotnostné spektrum ukazuje žalúdočnej tekutiny proteíny selektívne viazané na imobilizovaný medi (II) kovového iónu v rozmedzí molekulovej hmotnosti 1500 Da do 6000 Da. Významné proteínové markery zistené, že sú down-regulované v rakoviny žalúdočnej kvapaline (p Hotel &0,01) sú označené šípkami. Obrázok 1 Expresia rozdiel mapa žalúdočné tekutiny na meď (II) znehybnený kovové afinitnej zachytenie ProteinChip pole (IMAC3). Šípky ukazujú proteínové biomarkery sa výrazne líšia v úrovňou expresie medzi oboma skupinami vzoriek.
Reprezentatívna proteomickou mapa extraktu žalúdočné tekutiny peliet je znázornené na obrázku 2. Proteíny sa selektívne viaže na povrch kationtoměničová pole. Významné proteínové markery zistené, že up- alebo down-regulované v žalúdočné rakovina tekutiny pelety (p Hotel &0,01) sú označené šípkami. Obrázok 2 Expresia rozdiel mapa žalúdočné peliet extraktu tekutiny na katexový ProteinChip pole (WCX2). Šípky ukazujú proteínové biomarkery sa výrazne líšia v úrovňou expresie medzi dvoma skupinami vzoriek
Priemerná CV. (Variačný koeficient, kumulatívny dobu 10-15 hlavných vrcholov žalúdočné tekutiny na spektre, n = 8) pre imobilizované meď (II) ProteinChip array (IMAC3) bola 12,8%, pre výmenu katiónov pole (WCX2) bola 15%, pre výmenu aniónov pole (Sax2) bola 17,3%, a pre hydrofóbne interakčné čipu (H50) bola 13,6%. Tieto hodnoty CV sú v súlade s hodnotením reprodukovateľnosti v Šelda literatúre [17, 18].
Podľa SAM analýzy všetkých proteomických prvkov (celkový počet prvkov, 41 800, priemerný počet za retentátu mape 314) v žalúdočnej tekutiny a peliet extraktu , bolo zistené, že významne down-regulované u karcinómu žalúdka a 60 proteomické funkcia výrazne boli up-regulované u karcinómu žalúdka 46 proteomické funkcie. (Údaje z rôznych podmienok, napríklad tekutiny a pelety, rovnako ako rôzne povrchy, boli jednoducho sčítané dohromady ako charakteristické rysy pre SAM. Markers hlásené SAM v oboch pelety a supernatantu frakcie boli ručne identifikované a reprezentované iba raz v zozname po tom, čo boli považované za biologicky významné). Výrazne down-regulované markery zahrnuté 1884, 2428, 2594, 2840, 4050, 11720, 13700 Da; významne up-regulované markery zahrnuté 1761, 1831, 3372, 3443, 3605, 5160, 6780 Da. (Väčšina významných markerov boli objavené na WCX2 a IMAC-meď (II), a následne Sax2). na 106 výrazne odlišnými vlastnosťami proteomických (ďalší súbor 1) na báze bola vykonaná obojsmerný hierarchickej clustering analýzy (dvojrozmerná úplná väzba). Väčšina prípadov rakoviny žalúdka boli zoskupené dohromady, aby vytvorili výrazný skupinu (obrázok 3 a ďalší súbor 2). Analýza hlavných komponentov z rovnakého dátumu tiež ukázala, že rakovina a benígne vzorky by mohli byť tiež rozdelené do dvoch skupín, s 2 falošne negatívnych výsledkov (čo predstavuje duplicitné analýzy toho istého prípadu) a falošne pozitívnych výsledkov 9, v tomto poradí (obrázok 4). vzorka tekutiny jeden rakovina žalúdka (z prípadu stupne Aj zle diferencované adenokarcinómom žalúdka) klastre medzi vzorkami bez nádorového ochorenia; všetky ostatné štyri čo najskôr (stupne 0 a I) pacienti správne zoskupené sa vzorky od 14 pacientov s štádiu II - IV rakoviny žalúdka, takže celkový diagnostickú citlivosť 95% (18/19 pacientov s rakovinou žalúdka) na tréningovom sete. Obrázok 3 Expresia rozdiel mapa žalúdočných tekutín a pelety výťažky proteínov nastavených cvičné vzorky na štyroch ProteinChip polia, zobrazené v obojsmerné hierarchického zhlukovaniu. Významné Proteomické funkcie sú zobrazené zvisle. Intenzita odtieňoch sivej indikuje stupeň relatívnej úrovni proteínu, vyššia alebo nižšia, než je stredná hodnota. Prípady Pacient sú prezentované vo vodorovnej polohe; Väčšina pacientov s rakovinou žalúdka sú tesne zoskupené. Tento obrázok ukazuje hodnotu horného kvartilu úplného obrazu (pozri ďalší súbor 2 za celý obraz).
Obrázok 4 Analýza hlavných komponentov dej proteomických rysov tréning set vzoriek. Jedna rovina (označený čiernou linkou) rozdeľuje vzorky do dvoch skupín s 1 negatívne chyby (znázornené na duplicitných miest) a 9 falošných poplachov.
Deväť z 36 vzoriek nerakovinotvorných v sade tréningového zoskupený so vzorkami s rakovinou (špecificita 75%). Z nich jeden mal dysplastických adenomatóznej polyp - prekancerózne lézie [19]. Medzi ďalšie 8 pacientov, 6 sa klinicky smeruje biopsiou, ktoré ukázali, črevné metaplázia u 4 pacientov (67%). Osem pacientov bez rakoviny, ktorých žalúdočné tekutiny proteínové profily zoskupené v normálnej skupine tiež došlo ku klinicky smerujúce slizníc biopsia, ktoré ukázali, črevné metaplázia u 2 pacientov (25%). Preskúmanie 1000 po sebe idúcich žalúdočných biopsiou pre všetky indikácie ukázal celkový výskyt črevnej metaplázia v General Hospital v Singapure počas sledovaného obdobia o 30%. To kontrastuje s prevahou aspoň 67% črevnej metaplázia medzi klinicky benígnych prípadoch, ktorých proteomická profily klastre užšiu spoluprácu s žalúdočnými prípadov rakoviny než u iných normál, v súlade s črevnej metaplázia bytia prechodný stav pri prechode normálnej žalúdočnej epitelu žalúdočnej adenokarcinóm , Presná identifikácia črevnej metaplázia endoskopicky je známe, že je nepresný [20]. Tak, karcinómu žalúdka typu proteomická odtlačkov prstov je možná citlivým indikátorom prítomnosti tohto pre-malígne lézie u pacientov s klinicky diagnostikovaný benígne ochorenie žalúdka.
Pacientov s rakovinou žalúdka v tréningu nastavenej boli podstatne staršie (priemerný vek 67,7 rokov) ako u pacientov s benígnych žalúdočných podmienok (priemerný vek 56,6) (p
= 0,0062). Riešiť možnosť, že proteínové profily boli v súvislosti s vekom alebo etnický pôvod, sme znovu analyzuje údaje o podskupiny čínskych pacientov nad 55 rokov veku. To malo za následok 1/17 rakoviny chybne (rovnaký nádor, ktorý bol chybne, keď bolo analyzovaných všetkých 19 karcinómov; citlivosť 94%) a 4/17 kontrol chybne (tie isté 4 ovládacie prvky, ktoré patrili medzi 9 chybne benígnych prípadoch, špecifickosť 76,5%) .
ďalej sme testovali skutočnú výkonnosť proteomických profilov v rozlišovacím rakovinou od nezhubných vzoriek v druhej sérii 53 zaslepených vzoriek žalúdočnej tekutiny a pelety extrakt (24 karcinómov žalúdka a 29 benígnych žalúdočných ochorení) (ďalšie súbor 3). Dvadsať jedna zo 24 karcinómov žalúdka boli správne identifikované (citlivosť 88%) a 2 z 29 benígnych vzoriek boli chybne klasifikované (špecificita 93%) (obrázok 5). Obrázok 5 Expresia rozdiel mapa žalúdočnej šťavy a výťažky pelety proteínov set vzoriek overovacích na štyroch ProteinChip polí, zobrazí sa v obojsmerné hierarchického zhlukovaniu. Významné Proteomické funkcie sú zobrazené vodorovne. Intenzita červenej alebo zelenej farby indikuje stupeň relatívnej úrovni proteínu, vyššia alebo nižšia, než je stredná hodnota. Prípady Pacient sú prezentované vo zvislom smere; Väčšina pacientov s rakovinou žalúdka sú pevne zoskupené.
Vybrané proteomických markery (na základe významu skóre určí SAM) boli čiastočne purifikované na ProteinChip poľa a identifikované priamo na škvrny od kolízií indukovanej disociácie sekvenovania (Obrázok 6). Niekoľko z významne down-regulované markerov u pacientov s nádorovým ochorením, znázornených na obrázkoch 1 a 2, 1881,9 Da, 2041,0 Da, 2188,1 Da a 2387,3 Da, boli identifikované ako pepsinogénu C a pepsín aktivačný peptidové fragmenty (tabuľka 1). Sú up-regulované triplet markery u pacientov s rakovinou, znázornené na obrázkoch 2, 7 a ďalší súbor 4 boli identifikované, že alfa-defenzínov 1,2,3. Intenzita rozptylu grafy ukazujú veľmi podstatné rozdiely v priemerných intenzít defenzínov a pepsínu fragmentu medzi benígne kontroly a vzorky karcinómu žalúdka tekutín (p = 0,003 a
0.00002, v danom poradí) (obrázok 8). Pomocou ELISA špecifické pre pepsinogénu C, sme potvrdili výrazne nižšie koncentrácie v rakovinových tekutinách žalúdka (11,9 ± 0,1 ng /ug celkového proteínu, priemer ± SEM pre n = 6) v porovnaní s benígne vzoriek (21,5 ± 1,4 ng /ug celkového proteínu n =. 23) v treťom sete vzorky (p = 0,0126
; Studentov nepárový dvojstranný t
test). ELISA vykonaná na rovnakom súbore vzoriek pre hladiny defenzínov vykazujú vyššie koncentrácie vo vzorkách karcinómu žalúdka (63,4 ± 9,2 pg /ug celkového proteínu, priemer ± SEM pre n = 6) ako u benígnych vzoriek (46,2 pg /ug celkového proteínu, priemer ± SEM n = 23) ((p = 0,0654
; Student t
test) .Table 1 peptid sekvencie identifikovanej MS //MS
Peptidy m /z China Sequence
Protein zápasu
Mowse † skóre
Mowse skóre s významnou homológiou
2386.29
FLKKHNLNPARKYFPQWKA
Pepsín aktivačný peptid
35 Hotel > 28
2187,12
FLKKHNLNPARKYFPQW
Pepsin aktivačný peptid
18 Hotel > 26
2040,03
LKKHNLNPARKYFPQW
Pepsín aktivačný peptid
28 Hotel > 26
1775,95
FLKKHNLNPARKYF
Pepsin aktivačný peptid
47 Hotel > 26
1628,84
LKKHNLNPARKYF
Pepsín aktivačný peptid
40 Hotel > 28
1880,92
LRTHKYDPAWKYRF
pepsinogénu C aktivačný peptid
31 Hotel > 22
† Mowse skóre = -10Log ( P), kde P = pravdepodobnosť, že zápas je náhodná udalosť (P Hotel < 0,05) m /z China, hmotnosť /náboj
Obrázok 6 s vysokým rozlíšením, hmotnostné spektrum frakcionované tekutín proteínov žalúdočné na LWCX30 ProteinChip pole, získané na QTOF vybavenom PCI1000 rozhraním. V rámčeku piky boli podrobené analýze fragmentačnej kolízií indukovanej disociácie MS /MS.
Obrázok 7 s vysokým rozlíšením, hmotnostné spektrum žalúdočné tekutiny proteínov na H50 ProteinChip pole, získané na QTOF vybavenom PCI1000 rozhraním. Tento obrázok znázorňuje up-regulované triplet markery u karcinómu žalúdka. za celý obrázok nájdete ďalšie súbor 4.
Obrázok 8 bodová vykreslenie hodnôt intenzity defenzínov a pepsínu fragment súčasného vo vzorkách benígne kontroly a pacientov s karcinómom žalúdka z tréningového sady žalúdočných tekutín.
Diskusia
Naše dáta naznačujú, že spektrálna profil nefrakcionovaného žalúdočnej tekutiny môže byť užitočným doplnkom pre diagnózu a detekciu skoré štádiu ochorenia rakovinou, v kombinácii s klinickým endoskopicky. Najnovšie pokusy o identifikáciu proteínových biomarkerov rakoviny žalúdka boli skúmané sérum [21-29] a tkaniva [24, 30-37], a stále viac využívajú hmotnostnej spektrometrie. Staršie správy o sérologických testov jednotlivých známych nádorových markerov napr CEA, CA 19-9, CA 72-4, CA242 a TAG-72, majú všeobecne nízku citlivosť (menej ako 50%) [38-41]. Okrem toho je podstatné cross-pozitivita týchto nádorových markerov v non-karcinómov žalúdka napr. zvýšený CEA a mg7-Ag úrovne sú časté u kolorektálneho karcinómu, cholangiocarcinoma, karcinómom pankreasu, a to aj u zdravých kontrol [40, 23]. Niet divu, že tieto nádorové markery v sére nemajú zavedenú úlohu v žalúdku diagnostiku a skríning rakoviny, aj keď môžu slúžiť ako prognostické ukazovatele a skoré markery recidívy nasledujúce gastrektómii [39, 41, 42].
Rozhodli sme sa preskúmať proteomických profilov žalúdočné tekutiny pre biomarkerov ochorenie, pretože sa zdalo pravdepodobné, že porušenej sekréciu žalúdočnej proteínu v malígnych a premalígnych stavov, spojený s možnou prítomnosťou exfoliovaných nádorových buniek, by mohla vyvolať výrazné proteomických profilov. Ako pri hľadaní sérových biomarkerov, niekoľko skupín skúmali diagnostický nástroj známych nádorových markerov v žalúdočnej šťave. Ani CEA ani CA 19-9 pozitivita v žalúdočnej tekutine preukázala diagnostickú presnosť [43-46]. Alfa-1 antitrypsín v žalúdočnej šťavy bola nedávno opísaná ako rakovina žalúdka biomarker [47, 48].
Náš prístup k rozvoju citlivej metódy pre žalúdočné diagnostike rakoviny sa líši od predchádzajúcich štúdií tromi spôsobmi. Po prvé sme zvolili biologického vzorky, ktorý bol orgánovo špecifické (tj. Endoskopická odsať žalúdočné tekutiny), skôr než systémovým (tj. Sérum), úvaha, že molekulárne vlastnosti by sa s väčšou pravdepodobnosťou byť špecifické pre ochorenie. Po druhé, hmotnostná spektrometria nám umožnilo prijať objektívne prístup k zisťovanie báze. Po tretie, naše dáta generované profily viac proteomických markerov, ktoré sú stále považované za majúce vyššiu citlivosť a špecifickosť než jednoduché nádorových markerov [49, 50]. U rakoviny žalúdka, ktorý kombinuje ešte 2 alebo 3 nádorové markery dosiahnuť lepšiu diagnostická presnosť v porovnaní so samotným jedného markeru [38, 40].
Proteínové odtlačky prstov žalúdočnej šťavy u pacientov s karcinómom žalúdka ukázal celkom 106 proteomických funkcií, ktoré výrazne vzrástli - alebo down-regulované (Ďalšie súbory 1 a 3). Dva prominentné markery boli vybrané na identifikáciu pomocou MS /MS. Pepsinogén A a aktivačný peptidy pepsinogénu C boli down-regulované v žalúdočných tekutinách odstránených z žalúdkov s histologicky potvrdená adenokarcinómov. Štúdia kryostatových sekciách rakoviny žalúdka taktiež popísal významnej down-reguláciu pepsinogénu C, ktorá sa identifikuje pomocou MS /MS, v nádorovom tkanive [51].

• Genetické línií nediferencovaných typu žalúdočných karcinómov analyzovaných neriadené zhlukovaniu genómovej DNA čipu data
• Mir-146a rs2910164 G /C polymorfizmus a rakovina žalúdka citlivosť: meta-analysis