El proteoma fluido gástrico distintivo en el cáncer gástrico revela un perfil de diagnóstico de múltiples biomarcadores

El proteoma fluido gástrico distintivo en el cáncer gástrico revela un perfil de diagnóstico de múltiples biomarcadores
Resumen Antecedentes

la supervivencia global de cáncer gástrico sigue siendo pobre principalmente porque no existen métodos fiables para la identificación de enfermedad en estadio temprano altamente curable. perfilado de múltiples proteínas de los fluidos gástricos, obtenida a partir del sitio anatómico de la patología, podría revelar huellas dactilares proteómicos de diagnóstico.
Métodos
perfiles de proteína se generan a partir de muestras de fluidos gástricos del cáncer gástrico y 19 de 36 pacientes sometidos a gastritis benignos electiva, clínicamente gastroscopia -indicated usando láser de desorción /ionización por espectrometría de masas de tiempo de vuelo de superficie mayor de múltiples arreglos de ProteinChip. características de proteómica se compararon mediante análisis de la importancia del algoritmo de microarrays y bidireccional agrupación jerárquica. Se utilizó un segundo conjunto de muestras ciego (24 cánceres gástricos y 29 gastritis clínicamente benignos) para la validación
. Resultados fotos: por analysyis importancia de microarrays, 60 características proteómicos fueron reguladas y 46 se redujeron regulado en muestras de cáncer gástrico (p
< 0,01). agrupación mostró dos marcadores múltiples perfiles proteómicos distintivas independientes de la edad y origen étnico. Dieciocho de 19 muestras de cáncer agrupados juntos (sensibilidad 95%), mientras que 27/36 de las muestras no cancerosas agrupados en un segundo grupo. Nueve muestras no cancerosas que se agrupan con las muestras de cáncer incluyen lesiones premalignas 5 (1 pólipos adenomatosos y 4 metaplasia intestinal). Validación usando un segundo conjunto de muestras mostró la sensibilidad y especificidad de un 88% y 93%, respectivamente. El valor predictivo positivo de los datos combinados fue de 0,80. la secuenciación de péptidos seleccionada identificada pepsinógeno C y pepsina Un péptido de activación como significativamente reducido regulado y alfa-defensin como significativamente hasta reguladas.
Conclusión
Este simple y reproducible ensayo proteómico marcadores múltiples podrían complementar la evaluación clínica de los pacientes gastroscopic sintomáticos para mejorar precisión diagnóstica para el cáncer gástrico y lesiones pre-malignas.
Antecedentes
a diferencia de otros tipos comunes de cáncer, el pronóstico de los pacientes con cáncer gástrico más es pobre y no ha mejorado mucho en los últimos decenios. las tasas de supervivencia de cinco años para el cáncer gástrico son considerablemente más bajos que los principales tipos de cáncer, excepto el cáncer de hígado, páncreas y esófago [1]. Dado que el cáncer gástrico etapa inicial tiene un pronóstico mucho mejor (supervivencia a 5 años de aproximadamente el 90%) que el cáncer gástrico avanzado (supervivencia a 5 años 3-10%) [2, 3], la mortalidad mundial por cáncer gástrico debe disminuir sustancialmente medidas que se traducen en disminución del parámetro tumores en el momento del diagnóstico inicial.
Aunque gastroscopia es el estándar de oro para el diagnóstico de cáncer gástrico, su precisión no es tan alta como lo es para las enfermedades gástricas benignas tales como úlceras pépticas, especialmente en las regiones geográficas de baja prevalencia de cáncer gástrico intermedio. El porcentaje de diagnóstico de cáncer perdidas, informó como 4,6%, 14% e incluso 33% [4-6], no es insignificante. Incluso en Japón, se informó que la tasa de falsos negativos que ser 19% [7]. Estos datos son consistentes con el valor predictivo positivo de sólo 0,4 a 0,7 para el diagnóstico endoscópico de cáncer gástrico en diferentes centros [8-10]. Aunque la proporción de diagnósticos fallidos parece pequeño, el número absoluto de pacientes niega el beneficio del diagnóstico en una etapa curable no es despreciable. Incluso a una tasa de falsos positivos de diagnóstico moderadamente baja del 5%, más de 47.000 cánceres gástricos se han perdido en un país de baja prevalencia solo (EE.UU.) en un solo año, de 2000 [11]. evaluación endoscópica con frecuencia incluye biopsias de la mucosa, pero no hay estándares clínicos, ya sea para el número óptimo de biopsias o las regiones anatómicas que deben ser incluidos en la muestra. Una recomendación comúnmente citado es tomar por lo menos siete biopsias para diagnosticar correctamente el cáncer gástrico [12]. En este estudio, sin embargo, totalmente 17% de todas las lesiones posteriormente demostrado ser maligno se considera benigno en la endoscopia. Así, el examen endoscópica de la mucosa sufre de variación entre observadores, la correlación con la histopatología subóptima, dificultad en la detección de cánceres de la submucosa y la visualización sin obstáculos de todas las sub-regiones anatómicas, por ejemplo, . Después de la cirugía gástrica anterior [13, 14]
fluido gástrico consiste en una mezcla de proteínas celulares secretadas solubles y exfoliadas de toda la mucosa gástrica - incluyendo las regiones que no pueden ser evaluados adecuadamente por gastroscopia con fibra óptica. Por lo tanto, razonó que el perfil proteómico de fluido gástrico, generalmente considerado como un subproducto de desecho durante la gastroscopia, convendría complementar la evaluación clínica convencional, proporcionando una "biopsia molecular" que efectivamente muestras de toda la mucosa gástrica, especialmente en las técnicas de detección de proteínas tales como la espectrometría de masas puede ser muy sensible. Si se realiza durante el curso de la gastroscopia clínicamente indicado, la obtención de fluido gástrico no aumenta la invasividad del procedimiento. A diferencia del proteoma del plasma, el proteoma fluido gástrico es probable que sea menos complejo, pero enriquecido en biomarcadores específicos de la enfermedad, que se genera directamente en el sitio de la enfermedad. Los mismos marcadores biológicos, incluso si está presente en el plasma, se pueden diluir más allá de los límites de detección y se mezcla con otras proteínas sistémicas más abundantes que reflejan las condiciones fisiopatológicas concurrentes (por ejemplo, enfermedades comórbidas), en lugar de la enfermedad específica del sitio anatómico.
Hemos investigado un enfoque novedoso para biomarcadores en desarrollo para el cáncer gástrico mediante el perfilado péptidos secretados solubles presentes en el fluido y proteínas gástrica endoscópica aspirado extraído de células epiteliales exfoliadas, también se recuperaron durante la endoscopia por láser de desorción-ionización tiempo de vuelo mayor superficie (SELDI TOF) espectrometría de masas. Nuestros resultados sugieren que múltiples biomarcadores de proteínas a partir de una fuente específica de órgano, es decir, fluido gástrico, generar una firma distintiva del cáncer gástrico que merece mayor desarrollo como una herramienta para mejorar la precisión diagnóstica de la gastroscopia y tiene potencial para detectar el cáncer de estómago en estadio temprano y premalignas lesiones (metaplasia intestinal y displasia).
Métodos
muestras clínicas
se obtuvieron los fluidos gástricos durante la gastroscopia de ayuno durante la noche los pacientes atendidos en el hospital general de Singapur. El protocolo de estudio fue aprobado por el Comité de Ética del Hospital General de Singapur. y conformes a las disposiciones de la Declaración de Helsinki de 1995. Las indicaciones para la gastroscopia eran exclusivamente clínico y fueron independientes del estudio. El análisis inicial se realizó en un conjunto de entrenamiento de 19 muestras de histológicamente probada adenocarcinomas gástricos (13 de tipo intestinal, 4 de tipo difuso, 1 de tipo mixto, 1 indeterminada) [15] y 36 muestras de pacientes con condiciones gástricas clínicamente benignos. La edad media de 19 pacientes con cáncer gástrico (13 hombres, 6 mujeres; 17 chinos, indios 2) fue de 68 años. Distribución por American Joint Committee on Cáncer (AJCC) estadificación clínica era el estadio 0 (1 paciente), la etapa I (4 pacientes), fase II (2 pacientes), en estadio III (2 pacientes) y estadio IV (10 pacientes). La edad media de 36 pacientes con afecciones gástricas benignas (19 varones, 17 mujeres; 33 chinos, malayos 2, 1) de la India fue de 57 años. El diagnóstico clínico después de la endoscopia de pacientes sin cáncer fueron normales (9), gastritis antral (9), gastritis (6), úlcera (4), hernia hiatal (3), pólipos hiperplásicos (2), el esófago de Barrett (1), fúndica cicatriz (1) y pólipos adenomatosos (1). Francia el algoritmo de clasificación desarrollado a partir del conjunto de entrenamiento se puso a prueba mediante análisis ciego de un conjunto de validación consiste en otro 24 confirmó histológicamente adenocarcinomas gástricos (10 de tipo intestinal, 7 tipo difuso, 1 mixto tipo, 5 indeterminada, 1 neuroendocrino) y 29 muestras gástricas clínicamente benignos. La edad media de estos 24 pacientes con cáncer gástrico (18 varones, 6 mujeres; 21 chinos, malayos 3) fue de 70 años. Distribución por la estadificación clínica fue AJCC etapa I (5 pacientes), fase II (4 pacientes), en estadio III (2 pacientes) y estadio IV (12 pacientes). Un paciente en el conjunto de validación se redujo aún más la investigación y no pudo ser un montaje. La edad media de 29 pacientes no oncológicos (11 varones, 18 mujeres; 26 chinos, indios 2, 1 malayo) fue de 47 años. El diagnóstico clínico después de la gastroscopia de pacientes sin cáncer fueron gastritis (14), pólipos de glándulas fúndicas (2), la úlcera gástrica aguda (2), duodenitis (2), hernia hiatal (1) y normal (8). Ninguno de
los pacientes con cáncer gástrico habían recibido ningún tipo de tratamiento contra el cáncer en el momento de la gastroscopia.
Tomando casos de entrenamiento y validación en conjunto, el 19% (8/43) y 29% (19/65) de los pacientes con cáncer gástrico y gástrica benigna condiciones, respectivamente, fueron positivos para H. pylori
, una diferencia que no fue significativa por la prueba exacta de Fisher (2 caras p = 0,4508
valor).
recolección y el procesamiento de la muestra de fluido gástrico se
aspirado en un recipiente estéril al comienzo de la endoscopia, asignado un código anónima e inmediatamente colocado en hielo. Se rechazaron las muestras de sangre o teñido de bilis. Sólo clínicamente lesiones de la mucosa sospechosas biopsia se realizó a discreción del endoscopista. los fluidos gástricos se centrifugaron a 180 g durante 6 minutos a 4 ° C, a partir del cual el sobrenadante se centrifugó de nuevo a 16 100 g durante 30 minutos a 4 ° C. se combinaron Pellets de ambas centrifugaciones. Los sobrenadantes de alta velocidad se almacenan por separado de los gránulos a -80 ° C.
Protein perfiles
Después de la descongelación, 10 l de cada muestra de fluido gástrico se aplicó a diferentes superficies químicas de matrices ProteinChip (Ciphergen Biosystems Inc, California , EE.UU.): (a) de cobre (II) inmovilizados metal Affinity Capture (IMAC3) en presencia de 100 l de 1 mol /L de urea, 1 g /l 3 - [(3-colamidopropil) dimetilamonio] -1-propanosulfonato ( CHAPS), 0.3 mol /L KCl, cóctel inhibidor de proteasa (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania), 50 mol /L Tris HCl, pH 7,5; (B) de intercambio catiónico débil (WCX2 y CM10) en presencia de 100 l de acetato de 50 mmol /L de sodio, 1 g /L glucopiranósido octilo, cóctel inhibidor de proteasa, pH 5; (C) Strong Anion Exchange (de SAX2) en presencia de 100 l de 50 mmol /L Tris HCl, 1 g /L de CHAPS, cóctel inhibidor de proteasa, pH 8; y (d) de interacción hidrófoba (H50) en presencia de 100 l de ácido trifluoroacético 5 ml /L. Después de lavar con 100 l de los mismos tampones respectivos, se añadió ácido sinapínico para facilitar la desorción e ionización. Los chips se analizaron mediante SELDI-TOF-MS (pBSII, Ciphergen Biosystems Inc). Los cánceres y los controles se entremezclan y se ejecutan simultáneamente en el mismo chip y en varias fichas para minimizar la variación de chip a chip.
Los pellets de fluidos gástricos se volvieron a suspender en 25 l de 6 mol /l de tiocianato de guanidina, 5 g /l de octilo glucopiranósido, 0.1 mol /L de Hepes pH 7, y 100 a 200 l de 9 mol /L de urea, 2 g /l de CHAPS, 50 mmol /L Tris HCl, pH 7,5 por agitación durante 45 minutos a 4 ° C. Después de centrifugación a 20 000 g durante 5 minutos, 10 l de extracto se aplicó a matrices ProteinChip como se describe anteriormente.
Un mapa retenido se generan en el que las proteínas individuales se muestran como picos separados sobre la base de su relación masa a carga . Los datos de los espectros de proteómica se analizaron mediante el Administrador de software Data Express Ciphergen con pista de patrones y de dos vías algoritmo de agrupamiento jerárquico. picos alineados con relación señal-ruido por encima de 3 se normalizaron por la corriente de iones total. características proteómicos fueron analizados utilizando el software de análisis de la importancia microarrays (SAM) de la Universidad de Stanford. El paquete fue diseñado para hacer frente a los problemas específicos de análisis de datos de microarrays (relación señal a ruido varianza diferente de un gen a gen, gran número de puntos de datos a partir de un pequeño número de muestras), pero nos pareció que fuera aplicable al análisis de datos proteómicos también. El algoritmo del software fue descrito por Tusher et al
. [dieciséis]. En breve se define una métrica denominada la diferencia relativa para medir la diferencia entre dos o más grupos de datos en lugar del valor p
. Se emplea una variación del método de bootstrapping y repetidamente divide un conjunto de datos dado (espectros que contiene las características de proteómica en este estudio) al azar en dos grupos para calcular la diferencia relativa para cada una de las permutaciones. El número de permutaciones se estableció a ser 1000 en este estudio y el software calcula 1000 valores de diferencia relativa para cada característica proteómico. La diferencia relativa de la agrupación particular de interés (observado diferencia relativa) se comparó con la diferencia relativa media de todas las permutaciones (se espera diferencia relativa) de cada característica y la función se consideró arriba o hacia abajo-regulada en función de que su diferencia relativa observada era mayor o menor que su diferencia relativa esperada por algún umbral. El software calcula una tasa de falso descubrimiento (también definida en la referencia [16]) para cada valor umbral que proporciona un medio indirecto para establecer el punto de corte. Los marcadores identificados por este método fueron estadísticamente significativas. La tasa de falso descubrimiento se estableció a ser inferior a 0,05 en este estudio.
Para validar los marcadores identificados por SAM, un segundo lote de 53 muestras ciegas se añadieron al conjunto de datos para el agrupamiento jerárquico mediante el programa informático Ciphergen Express Data. Si bien se esperaba que las muestras conocidas utilizadas por SAM para seleccionar los marcadores para un buen desempeño en la agrupación, se incluyeron las muestras ciegas para probar qué tan bien los marcadores generalizan a las muestras desconocidas. Los resultados de la agrupación simplemente se comparan con la verdadera identidad de las muestras y ningún método de clasificación avanzada o cualquier otro software fue utilizado en la validación.
Identificación de biomarcadores
proteínas del líquido gástrico se fraccionaron por cromatografía de intercambio aniónico (Q HyperD , Ciphergen Biosystems Inc.), utilizando cambios graduales en el pH para la elución. Las proteínas en el 50 mmol /L Tris HCl, 1 g /L glucopiranósido octilo, pH 8 eluyentes se purificaron adicionalmente en una matriz de intercambio catiónico (LWCX30) usando acetato de 50 mmol /L de sodio, 1 g /L glucopiranósido octilo, pH 5 como vinculante y tampón de lavado. Después de la adición de moléculas de ácido energía de absorción (Ciphergen Biosystems Inc.) alfa-ciano-4-hidroxicinámico, las proteínas retenidas se analizaron por pBSII y Q-TOF (Waters /Micromass) equipado con una interfaz ProteinChip (PCI 1000, Ciphergen Biosystems Inc) . Las proteínas se caracterizan por la fragmentación MS /MS y la identificación se realizó mediante una búsqueda de base de datos con la mascota (Matrix Science Ltd., Londres, Reino Unido). Validación de biomarcadores
Esto se llevó a cabo en un tercer conjunto de muestras de fluidos gástricos tomado de benigna gástrico y los pacientes con cáncer gástrico. Cada muestra recién recogida se procesa para eliminar los residuos sólidos y concentrar el contenido de proteína de la siguiente manera. Después de la adición de fluoruro de fenilmetanosulfonilo a una concentración final de 0,2 mM, la muestra se centrifugó durante 15 minutos a 500 g y 4 ° C. Se añadieron inhibidores de la proteasa (Complete Mini ™, Roche Ciencias Aplicadas, Indianapolis, IN, EE.UU.) al sobrenadante seguido de filtración por membrana centrífuga a 2 900 g, y 15 ° C (Amicon Ultra-4 dispositivo de filtro centrífugo, 5 000 límite de peso molecular nominal; Millipore, Billerica, MA, EE.UU.) hasta que la muestra se redujo a 10 a 20% de su volumen original. La concentración total de proteínas fue determinada por el Quant Kit de 2-D (Amersham Biosciences, Pisctaway, Nueva Jersey, EE.UU.). Pepsinógeno C y alfa-defensinas 1-3 concentraciones se determinaron por inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA) usando kits de Diagnóstico Alpco (Salem, NH, EE.UU.) y HyCult B.V. biotecnología (Uden, Países Bajos), respectivamente. Cada muestra procesada se ensayó por duplicado para pepsinógeno C y los niveles de defensinas utilizando protocolos de los proveedores. Las muestras para el ensayo de pepsinógeno C fueron previamente diluido 120 veces. Las concentraciones de pepsinógeno C y alfa-defensinas 1-3 se obtuvieron en función de sus respectivas curvas de calibración y se expresaron como ng (pepsinógeno C) o PG (defensinas) por microgramo de proteína total de fluido gástrico.
Helicobacter pylori Francia El presencia de H. pylori
en los tejidos del estómago fue identificado por la visualización de los microorganismos en espiral en secciones histológicas y /o por inmunohistoquímica. secciones de tejido de cuatro micras se de-encerado en xileno y la disminución de los grados de etanol. La recuperación del antígeno era por calentamiento en tampón de citrato, pH 6,0. El anticuerpo primario frente a H. pylori gratis (dilución 1:50; Dako A /S, Glostrup, Dinamarca) fue seguido por el enlace de polímero anticuerpo secundario (Envision Chem Mate, Dako) y se visualizó usando diaminobencidina como cromógeno
. resultados
múltiples biomarcadores proteicos altura o hacia abajo regulados en el cáncer gástrico fueron descubiertos en el fluido gástrico. Un mapa proteómico representante de fluido gástrico se muestra en la Figura 1. Es una vista en gel de un espectro de masas que muestra las proteínas del líquido gástrico unidos selectivamente al cobre inmovilizado (II) de iones metálicos en el rango de peso molecular de 1.500 Da a 6.000 Da. marcadores de proteínas significativas encontradas para ser reguladas en el fluido gástrico cáncer (p Hotel < 0,01) se indican con flechas. Figura 1 Expresión mapa de diferencias de fluido gástrico en el cobre (II) inmovilizada de afinidad de metal matriz de captura ProteinChip (IMAC3). Las flechas indican biomarcadores de proteínas significativamente diferentes en el nivel de expresión entre los dos grupos de muestras.
Un mapa proteómico representante de precipitado de extracto fluido gástrico se muestra en la Figura 2. Las proteínas fueron atados selectivamente a una superficie de la matriz de intercambio catiónico. marcadores de proteínas importantes que se encuentran para ser hacia arriba o hacia abajo-regulada en el cáncer gástrico pellets de líquido (p Hotel < 0,01) se indican con flechas. Figura 2 Expresión mapa de diferencias de precipitado de extracto fluido gástrico en la matriz de intercambio catiónico ProteinChip (WCX2). Las flechas indican biomarcadores de proteínas significativamente diferentes en el nivel de expresión entre los dos grupos de muestras
CV promedio. (Coeficiente de variación; acumulada durante 10-15 picos principales de fluidos gástricos por espectro, n = 8) para el cobre inmovilizado matriz ProteinChip (II) (IMAC3) fue de 12,8%, para el conjunto de intercambio catiónico (WCX2) fue del 15%, para el conjunto de intercambio de aniones (de SAX2) fue del 17,3%, y para el chip de interacción hidrofóbica (H50) fue del 13,6%. Estos valores de CV están en línea con la evaluación de la reproducibilidad en la literatura SELDI [17, 18]. Fotos: por SAM análisis de todas las características de proteómica (número total de funciones 41 800, número medio por mapa retenido 314) en el extracto fluido y pelota gástrica , se encontraron 46 características proteómicos ser significativamente las reguladas en el cáncer gástrico y 60 características proteómicos fueron significativamente hasta reguladas en el cáncer gástrico. (Los datos de diferentes condiciones, por ejemplo, fluidos y sedimentar, así como diferentes superficies, fueron simplemente que suman ambos rasgos tan distintos para SAM. Marcadores reportados por SAM en ambas fracciones de pellets y sobrenadantes fueron identificados de forma manual y se representan sólo una vez en la lista después de que fueran considere biológicamente significativa). marcadores significativamente las reguladas incluyen 1884, 2428, 2594, 2840, 4050, 11720, 13700 Da; marcadores significativamente hasta regulados incluyen 1761, 1831, 3372, 3443, 3605, 5160, 6780 Da. (La mayoría de los marcadores significativos fueron descubiertos en WCX2 y IMAC-cobre (II), seguido SaX2). Sobre la base de las 106 características proteómicos significativamente diferentes (archivo adicional 1), se llevó a cabo de dos vías análisis de agrupamiento jerárquico (dos dimensiones vinculación completa). La mayor parte de los casos de cáncer gástrico fueron agrupados juntos para formar un grupo distintivo (Figura 3 y la disposición 2). Análisis de componentes principales de los mismos datos también revelaron que el cáncer y las muestras benignas podrían estar bien separados en dos grupos, con 2 falsos negativos (lo que representa el análisis por duplicado del mismo caso) y 9 falsos positivos, respectivamente (Figura 4). Una muestra de fluido cáncer gástrico (de un caso de la etapa I adenocarcinoma gástrico pobremente diferenciado) agrupado entre las muestras no cancerosas; todas las 4 primeras etapas de otros (estadios 0 y I) pacientes agrupados correctamente con muestras de 14 pacientes con estadio II - IV cáncer gástrico, dando una sensibilidad diagnóstica del 95% (18/19 pacientes con cáncer gástrico) en el conjunto de entrenamiento. Figura 3 Expresión mapa de diferencias de proteínas de extracto fluido y pelota gástrica de muestras de la serie de entrenamiento en cuatro matrices ProteinChip, que se muestran en bidireccional agrupación jerárquica. proteómicos características significativas se muestran verticalmente. La intensidad de la escala de grises indica el grado de nivel de proteína relativa, más alto o más bajo que el valor de la mediana. casos los pacientes se presentan horizontalmente; la mayoría de los pacientes con cáncer gástrico están estrechamente agrupados juntos. Esta figura muestra el cuartil superior de la imagen completa (por favor, véase la disposición 2 para la imagen completa).
Figura 4 gráfico de análisis de componentes principales de características proteómicos de muestras del conjunto de entrenamiento. Un solo plano (indicado por la línea de negro) divide las muestras en dos grupos con 1 falso negativo (que se muestra en los puntos duplicados) y 9 falsos positivos.
Nueve de 36 muestras no cancerosas en el entrenamiento conjunto agrupado con las muestras de cáncer (especificidad 75%). De éstos, 1 tenían un pólipo adenomatoso displásico - una lesión precancerosa [19]. Entre los otros 8 pacientes, 6 habían dirigido clínicamente biopsias revelaron que la metaplasia intestinal en 4 pacientes (67%). Ocho pacientes no cancerosas cuyos perfiles de proteínas en el líquido gástrico agrupado en el grupo normal también había dirigido clínicamente biopsias de la mucosa que mostraron metaplasia intestinal en sólo 2 pacientes (25%). Una revisión de 1000 biopsias gástricas consecutivas realizadas para todas las indicaciones mostró una prevalencia global de la metaplasia intestinal en el Hospital General de Singapur durante el período de estudio de 30%. Esto contrasta con la prevalencia de al menos el 67% de la metaplasia intestinal en casos clínicamente benignos cuyos perfiles proteómicos agrupado más de cerca con los casos de cáncer gástrico que con otros normales, de conformidad con metaplasia intestinal es un estado intermedio en la transición del epitelio gástrico normal a adenocarcinoma gástrico . La identificación exacta de metaplasia intestinal por endoscopia es conocido por ser inexacta [20]. Por lo tanto, una huella dactilar proteómica gástrico tipo de cáncer es, posiblemente, un indicador sensible para detectar la presencia de esta lesión pre-maligna entre los pacientes con diagnóstico clínico de los trastornos gástricos benignos.
Pacientes con cáncer gástrico en el conjunto de entrenamiento fueron significativamente mayores (media de 67,7 años años) que los pacientes con afecciones gástricas benignas (media 56,6 años) (p = 0,0062
). Para hacer frente a la posibilidad de que los perfiles de proteína se relacionan con la edad o la etnia, que los datos del subgrupo de pacientes chinos mayores de 55 años de edad volvieron a analizar. Esto dio lugar a 1/17 cánceres mal clasificados (el mismo tumor que fue clasificado erróneamente cuando se analizaron los 19 tipos de cáncer, la sensibilidad 94%) y 4/17 controles mal clasificados (los mismos 4 controles que estaban entre los 9 casos benignos mal clasificados, especificidad 76,5%) .
próximo a prueba el rendimiento real de los perfiles proteómicos en cáncer de distinguir entre muestras benignas en una segunda serie de 53 muestras ciegas gástricos y de extracto de fluido (24 cánceres gástricos y 29 trastornos gástricos benignos) (archivo adicional 3). Veintiuno de los 24 cánceres gástricos fueron identificados correctamente (sensibilidad 88%) y 2 de 29 muestras benignas fueron clasificados erróneamente (especificidad 93%) (Figura 5). Figura 5 Expresión mapa de diferencias de proteínas del líquido y el precipitado de extracto de muestras gástricas conjunto de validación en cuatro matrices ProteinChip, representada en bidireccional agrupación jerárquica. características proteómicos significativas se muestran horizontalmente. La intensidad de los colores rojo o verde indica el grado de nivel de proteína relativa, más alto o más bajo que el valor de la mediana. casos los pacientes se presentan verticalmente; la mayoría de los pacientes con cáncer gástrico están estrechamente agrupados juntos.
seleccionadas marcadores proteómicos (basado en importancia puntuación de determinado por SAM) eran semi-purificada en matrices ProteinChip e identificado directamente en los puntos por secuenciación de disociación inducida por colisión (Figura 6). Varios de los marcadores significativamente las reguladas en pacientes con cáncer que se muestran en las figuras 1 y 2, 1.881,9 Da, 2.041,0 Da, 2.188,1 Da y 2387,3 Da, fueron identificados para ser pepsinógeno C y la pepsina A los fragmentos de péptido de activación (Tabla 1). Los marcadores triplete hasta reguladas en pacientes con cáncer que se muestran en las figuras 2, 7 y archivo adicional 4 se identificaron a ser alfa defensinas-1,2,3. parcelas intensidad de dispersión muestran diferencias altamente significativas en las intensidades medias de fragmento de defensina y pepsina entre el control benignos y muestras de fluido de cáncer gástrico (p = 0,003
y 0,00002, respectivamente) (Figura 8). El uso de ELISA específico para pepsinógeno C, confirmamos concentraciones significativamente más bajas en los fluidos de cáncer gástrico (proteína total de 11,9 ± 0,1 ng /g, con una media ± SEM n = 6) en comparación con las muestras benignas (21,5 ± 1,4 ng /mg de proteína total n =. 23) en un tercer conjunto de muestras (p = 0,0126
; no pareada de dos colas t de Student
). ELISA realizado en el mismo conjunto de muestras para los niveles de defensinas mostraron mayores concentraciones en las muestras de cáncer gástrico (proteína total 63,4 ± 9,2 pg /g, con una media ± SEM n = 6) que en las muestras benignas (proteína total 46,2 pg /g, con una media ± SEM n = 23) ((p = 0,0654
; t de Student
) secuencias .Tabla 1 péptido identificado por MS //MS
péptido m /z
Secuencia
proteína Partido
Mowse † anotar
Mowse anotar con homología significativa
2.386,29
FLKKHNLNPARKYFPQWKA
pepsina Un péptido de activación
35 Hotel > 28
2.187,12
FLKKHNLNPARKYFPQW
pepsina Un péptido de activación
18 Hotel > 26
2.040,03
LKKHNLNPARKYFPQW
pepsina Un péptido de activación
28 Hotel > 26
1.775,95
FLKKHNLNPARKYF
pepsina Un péptido de activación
47 Hotel > 26
1.628,84
LKKHNLNPARKYF
pepsina Un péptido de activación
40 Hotel > 28
1.880,92
LRTHKYDPAWKYRF
pepsinógeno C péptido de activación
31 Hotel > 22
† Mowse puntuación = -10Log ( P), donde P = probabilidad de que el partido es un evento aleatorio (P
< 0,05) m /z
, masa /carga
Figura 6 espectro de masas de alta resolución de las proteínas del líquido gástrico fraccionados en conjunto LWCX30 ProteinChip obtenidos en un QTOF equipado con una interfaz PCI1000. picos en caja fueron sometidos a análisis de la fragmentación por la disociación inducida por colisión MS /MS.
Figura 7 espectro de masas de alta resolución de las proteínas del líquido gástrico en serie H50 ProteinChip obtenidos en un QTOF equipado con una interfaz PCI1000. Esta figura muestra los marcadores triplete hasta reguladas en el cáncer gástrico. Por favor, véase la disposición 4 para la imagen completa.
Figura 8 Gráficos de dispersión de los valores de intensidad de las defensinas y fragmento de la pepsina presentes en muestras de fluidos gástricos de control de benigna y pacientes con cáncer gástrico desde el conjunto de entrenamiento.
Discusión
Nuestros datos sugieren que el perfil espectral de fluido gástrico no fraccionada podría ser un complemento útil para el diagnóstico del cáncer y la detección de la enfermedad en estadio temprano, cuando se combina con gastroscopia clínica. La mayoría de los intentos recientes en la identificación de biomarcadores de proteínas para el cáncer gástrico han investigado el suero [21-29] y el tejido [24, 30-37], y se han utilizado cada vez más espectrometría de masas. informes anteriores de las pruebas serológicas de los marcadores tumorales conocidos individuales por ejemplo, CEA, CA 19-9, CA 72-4, CA242 y TAG-72, tiene por lo general una baja sensibilidad (< 50%) [38-41]. Además, no es sustancial transversal positividad de estos marcadores tumorales en cánceres no gástricos, por ejemplo, los niveles de CEA elevado y MG7-Ag son comunes en el cáncer colorrectal, colangiocarcinoma, carcinoma pancreático, e incluso en los controles sanos [40, 23]. No es sorprendente que tales marcadores tumorales séricos no tienen ningún papel establecido en el diagnóstico de cáncer gástrico y de cribado, aunque pueden servir como indicadores de pronóstico y marcadores tempranos de la enfermedad recidivante después de la gastrectomía [39, 41, 42].
Elegimos para examinar los perfiles proteómicos de fluido gástrico para biomarcadores de la enfermedad, ya que parecía probable que perturba la secreción gástrica proteína en estados malignos y premalignos, junto con la posible presencia de células cancerosas exfoliadas, podría generar perfiles proteómicos distintivos. Al igual que en la búsqueda de biomarcadores séricos, varios grupos han investigado la utilidad diagnóstica de los marcadores tumorales conocidos en el jugo gástrico. Ni tampoco CEA CA 19-9 positividad en el fluido gástrico ha demostrado precisión diagnóstica [43-46]. Alfa-1 antitripsina en el jugo gástrico se ha informado recientemente como un biomarcador de cáncer gástrico [47, 48].
Nuestro enfoque para desarrollar un método sensible para el diagnóstico de cáncer gástrico difiere de estudios previos de tres maneras. En primer lugar, se optó por una muestra biológica que era órgano-específica (es decir, fluido gástrico aspirado por endoscopia) en lugar de (es decir, suero) sistémica, el razonamiento de que las características moleculares serían más probable es que sea específica de la enfermedad. En segundo lugar, la espectrometría de masas nos permitió tomar un enfoque imparcial basado en el descubrimiento. En tercer lugar, nuestros datos generados perfiles de múltiples marcadores proteómicos que se consideran cada vez más como que tiene mayor sensibilidad y especificidad que los marcadores tumorales individuales [49, 50]. Para el cáncer gástrico, la combinación de 2 o incluso 3 marcadores tumorales obtenidos exactitud diagnóstica mejor en comparación con un solo marcador solas [38, 40]. Dactilares Proteína
de fluido gástrico de los pacientes con cáncer gástrico mostraron un total de 106 funciones de proteómica que fueron significativamente hasta - o-regulado (archivos adicionales 1 y 3). Se seleccionaron dos marcadores prominentes para la identificación por MS /MS. Pepsinógeno A y péptidos de activación pepsinógeno C se redujeron reguladas en los fluidos gástricos retirados de estómagos con adenocarcinomas histológicamente confirmado. Un estudio de secciones de criostato de cáncer gástrico ha informado también significativa la baja regulación de pepsinógeno C, identificado por MS /MS, en el tejido tumoral [51].

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