Il proteoma del liquido gastrico distintivo nel carcinoma gastrico rivela un profile

diagnostico multi-biomarker del proteoma del liquido gastrico distintivo nel carcinoma gastrico rivela un profilo diagnostico multi-biomarker
Abstract
sfondo
sopravvivenza cancro gastrico Nel complesso rimane scarsa soprattutto perché ci esistono metodi affidabili per l'identificazione di malattia in stadio precoce altamente curabile. Multi-proteina profilatura dei fluidi gastrici, ottenuto dal sito anatomico della patologia, potrebbe rivelare le impronte digitali di proteomica diagnostici.
Metodi Profili proteici sono stati generati da campioni di liquido gastrico di 19 cancro gastrico e 36 benigne gastritides pazienti sottoposti elettiva, clinicamente gastroscopia -indicated per mezzo del laser desorbimento /ionizzazione tempo di volo spettrometria di massa superficiale maggiore su più array ProteinChip. Caratteristiche proteomica sono stati confrontati con analisi di significatività di algoritmo microarray e bidirezionale clustering gerarchico. Un secondo set di campioni in cieco (24 tumori gastrici e 29 gastritides clinicamente benigni) è stato utilizzato per la convalida.
Risultati
da importanza analysyis di microarray, 60 funzioni di proteomica sono up-regolati e 46 sono stati down-regolato nei campioni di cancro gastrico (p
< 0,01). Multimarker raggruppamento ha mostrato due profili distintivi proteomica indipendenti di età ed etnia. Diciotto dei 19 campioni tumorali raggruppati insieme (sensibilità 95%), mentre 27/36 di campioni non tumorali raggruppati in un secondo gruppo. Nove campioni non tumorali che raggruppati con i campioni di cancro inclusi lesioni pre-maligne 5 (1 polipi adenomatosi e 4 metaplasia intestinale). Convalida utilizzando un secondo set campione ha mostrato la sensibilità e la specificità di essere 88% e 93% rispettivamente. Il valore predittivo positivo dei dati combinati era 0.80. peptide selezionato sequenziamento identificato pepsinogen C e pepsina Un peptide di attivazione significativamente down-regolato e alfa-defensine significativamente up-regolata.
Conclusione
Questo semplice e riproducibile analisi proteomica multimarker potrebbe integrare la valutazione gastroscopic clinica dei pazienti sintomatici per migliorare accuratezza diagnostica per il cancro gastrico e lesioni pre-maligne.
Sfondo
a differenza di altri tumori comuni, la prognosi per i pazienti affetti da cancro gastrico più è povero e ha migliorato poco nel corso degli ultimi decenni. I tassi di sopravvivenza a cinque anni per il cancro gastrico sono notevolmente inferiori a tutti i principali tipi di cancro, tranne i tumori del fegato, del pancreas e dell'esofago [1]. Dato che il cancro gastrico precoce ha una prognosi molto migliore (sopravvivenza a 5 anni di circa il 90%) rispetto a cancro gastrico avanzato (sopravvivenza a 5 anni 3-10%) [2, 3], la mortalità globale da cancro gastrico dovrebbe diminuire sostanzialmente da misure che si traducono in downstaging di tumori al momento della diagnosi iniziale.
Sebbene gastroscopia è il gold standard per la diagnosi del cancro gastrico, la sua precisione non è alto come lo è per le malattie gastriche benigne come ulcere peptiche, in particolare nelle regioni geografiche di basso a intermedio prevalenza cancro gastrico. La percentuale di diagnosi di cancro perdere, segnalato come 4.6%, 14% e addirittura il 33% [4-6], non è insignificante. Anche in Giappone, il tasso di falsi negativi è stato segnalato per essere il 19% [7]. Questi dati sono in linea con il valore predittivo positivo di soli 0,4-,7 per la diagnosi endoscopica di cancro gastrico in diversi centri [8-10]. Anche se la percentuale di mancate diagnosi appare piccolo, il numero assoluto di pazienti negato il beneficio della diagnosi in una fase curabile non è trascurabile. Anche a un modesto basso tasso di diagnosi di falsi positivi del 5%, più di 47.000 tumori gastrici sarebbero state perse nel solo un paese basso prevalenza (USA) in un solo anno, 2000 [11]. valutazione endoscopica include spesso biopsie della mucosa, ma non ci sono standard clinici sia per il numero ottimale di biopsie o regioni anatomiche che dovrebbero essere campionate. Una raccomandazione comunemente citato è quello di prendere almeno sette biopsie di diagnosticare correttamente cancro gastrico [12]. In questo studio però, pienamente il 17% di tutte le lesioni in seguito dimostrato di essere maligni sono stati considerati benigne in endoscopia. Così, l'esame della mucosa endoscopica soffre di variazione inter-osservatore, la correlazione non ottimale con istopatologia, difficoltà nel rilevare tumori sottomucosa e la visualizzazione senza ostacoli di tutti i sub-regioni anatomiche ad esempio . Dopo chirurgia gastrica precedente [13, 14]
fluido gastrico costituito da una miscela di secreti solubile e esfoliazione proteine ​​cellulari dall'intero mucosa gastrica - comprese regioni che non possono essere adeguatamente valutati da gastroscopia fibre ottiche. Abbiamo quindi ragionato che il profilo di proteomica del liquido gastrico, generalmente considerato come uno spreco sottoprodotto durante l'esame gastroscopic, potrebbe utilmente completare valutazione clinica convenzionale, fornendo una 'biopsia molecolare' che di fatto campioni l'intera mucosa gastrica, tanto più che le tecniche di rilevazione delle proteine ​​tali come la spettrometria di massa può essere altamente sensibile. Se eseguita durante il corso della gastroscopia indicazione clinica, ottenendo fluido gastrico non aumenta l'invasività della procedura. A differenza del proteoma del plasma, il proteoma del liquido gastrico è probabile che sia meno complessa, ma arricchito di biomarcatori specifici per la malattia, che viene prodotto direttamente presso il sito della malattia. Gli stessi marcatori, anche se presenti nel plasma, possono essere diluiti oltre i limiti di rilevazione e mescolati con altre proteine ​​sistemiche più abbondanti che riflettono le condizioni fisiopatologiche concomitanti (ad esempio malattie concomitanti), piuttosto che la malattia site-specific anatomica.
abbiamo studiato un nuovo approccio per sviluppo biomarcatori per il cancro gastrico profilando peptidi secreti solubili presenti nel liquido gastrico per via endoscopica aspirato e le proteine ​​estratte da cellule epiteliali espansa, recuperati anche durante l'endoscopia dalla superficie-enhanced laser desorbimento-ionizzazione tempo di volo (SELDI TOF) spettrometria di massa. I nostri risultati suggeriscono che più biomarcatori proteici da una fonte specifica per organo cioè fluido gastrico, generare una firma distintiva cancro gastrico che merita ulteriore sviluppo come uno strumento per migliorare l'accuratezza diagnostica della gastroscopia e ha un potenziale per la rilevazione di cancro gastrico in fase iniziale e pre-maligne lesioni (metaplasia intestinale e displasia).
Metodi
campioni clinici
fluidi gastrici sono stati ottenuti durante la gastroscopia di una notte a digiuno pazienti visitati presso l'Ospedale Generale di Singapore. Il protocollo di studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Ospedale Generale di Singapore. e conformi alle disposizioni della Dichiarazione di Helsinki 1995. Le indicazioni per gastroscopia erano esclusivamente clinica e erano indipendenti dello studio. L'analisi iniziale è stata eseguita su un training set di 19 campioni provenienti da istologicamente provata adenocarcinoma gastrico (13 di tipo intestinale, 4 di tipo diffuso, 1 di tipo misto, 1 indeterminato) [15] e 36 campioni di pazienti con condizioni gastrica clinicamente benigne. L'età media dei 19 pazienti affetti da cancro gastrico (13 maschi, 6 femmine, 17 cinesi, 2 indiani) era di 68 anni. Distribuzione per Joint Committee on Cancer (AJCC) stadiazione clinica era stadio 0 (1 paziente), stadio I (4 pazienti), fase II (2 pazienti), stadio III (2 pazienti) e stadio IV (10 pazienti). L'età media dei 36 pazienti con condizioni gastriche benigne (19 maschi, 17 femmine; 33 cinesi, 2 malesi, 1 indiano) era di 57 anni. diagnosi cliniche dopo l'endoscopia di pazienti non oncologici erano normali (9), gastrite antrale (9), gastrite (6), ulcera (4), ernia iatale (3), polipi iperplastici (2), esofago di Barrett (1), fundica cicatrice (1) e polipi adenomatosi (1).
l'algoritmo di classificazione sviluppato dal training set è stato testato da analisi cieco di un insieme di validazione che consiste di un altro 24 istologicamente confermato adenocarcinoma gastrico (10 di tipo intestinale, 7 tipo diffuso, 1 mista tipo, 5 indeterminata, 1 neuroendocrino) e 29 campioni gastrici clinicamente benigne. L'età media di questi 24 pazienti affetti da cancro gastrico (18 maschi, 6 femmine, 21 cinesi, 3 malese) era di 70 anni. Distribuzione per AJCC stadiazione clinica era fase I (5 pazienti), fase II (4 pazienti), stadio III (2 pazienti) e stadio IV (12 pazienti). Un paziente nel set di validazione rifiutato ulteriori indagini e non poteva essere messa in scena. L'età media dei 29 pazienti non-cancro (11 maschi, 18 femmine; 26 cinesi, 2 indiani, 1 malese) era di 47 anni. diagnosi cliniche dopo gastroscopia dei pazienti non oncologici erano gastrite (14), fundica ghiandola polipi (2), ulcera gastrica acuta (2), duodenite (2), ernia iatale (1) e normale (8). Nessuno dei
i pazienti affetti da cancro gastrico avevano ricevuto alcuna forma di trattamento del cancro al momento della gastroscopia.
Prendendo i casi di formazione e validazione insieme, il 19% (8/43) e il 29% (19/65) dei pazienti con cancro gastrico e gastrica benigna condizioni rispettivamente, sono stati positivi per H. pylori
, una differenza che non è stata significativa per il test esatto di Fisher (2 lati p value = 0,4508
).
raccolta e il trattamento del campione
fluido gastrico è stato aspirato in un contenitore sterile a inizio endoscopia, assegnato un codice anonimo e immediatamente posti su ghiaccio. campioni di sangue o di bile macchiati sono state respinte. Solo clinicamente sospette lesioni della mucosa sono stati sottoposti a biopsia a discrezione del endoscopista. fluidi gastrici sono state centrifugate a 180 g per 6 minuti a 4 ° C, da cui il supernatante è stato nuovamente centrifugata a 16 100 g per 30 minuti a 4 ° C. Pellet di entrambe le centrifugazioni sono stati combinati. I surnatanti ad alta velocità sono stati conservati separatamente dalle pellet a -80 ° C.
Protein profiling
Dopo lo scongelamento, 10 ml di ogni campione di fluido gastrico è stato applicato a diverse superfici chimiche di array ProteinChip (Ciphergen Biosystems Inc, California , USA): (a) di rame (II) Immobilized metallo Affinity Capture (IMAC3) in presenza di 100 microlitri di 1 mol /L urea, 1 g /L 3 - [(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate ( CHAPS), 0,3 mol /L KCl, cocktail inibitore della proteasi (Roche Diagnostics, Mannheim, Germania), 50 mol /L TrisHCl, pH 7,5; (B) debole scambio cationico (WCX2 e CM10) in presenza di 100 ml di acetato di 50 mmol /L di sodio, 1 g /L ottile glucopiranoside, cocktail di inibitori delle proteasi, pH 5; (C) forte scambio anionico (SAX2) in presenza di 100 pl di 50 mmol /L TrisHCl, 1 g /L CHAPS, cocktail inibitore di proteasi, pH 8; e (d) interazione idrofobica (H50) in presenza di 100 ml di acido trifluoroacetico 5 mL /L. Dopo lavaggio con 100 ml della stessa rispettivi buffers, acido sinapico stato aggiunto per facilitare desorbimento e di ionizzazione. I chip sono stati analizzati mediante SELDI-TOF-MS (PBSII, Ciphergen Biosystems Inc.). Tumori e controlli sono stati mescolati ed eseguire contemporaneamente sullo stesso chip e su più chip per ridurre al minimo la variazione chip-to-chip.
I pellet fluidi gastrici sono stati risospesi in 25 ml di 6 mol /L guanidina tiocianato, 5 g /l ottil glucopiranoside, 0,1 mol /L Hepes pH 7, e 100-200 ml di 9 mol /L urea, 2 g /L CHAPS, 50 mmol /L TrisHCl, pH 7.5 vortex per 45 minuti a 4 ° C. Dopo centrifugazione a 20 000 g per 5 minuti, 10 ml di estratto è stato applicato agli array ProteinChip come sopra descritto.
Una mappa retentato è stata generata in cui le singole proteine ​​sono state visualizzate come picchi separati sulla base della loro massa per caricare rapporto . I dati degli spettri proteomica sono stati analizzati mediante Ciphergen espresso software Data Manager con Track Pattern e bidirezionale algoritmo di clustering gerarchico. picchi allineati con rapporto segnale rumore superiore a 3 sono stati normalizzati dalla corrente totale di ioni. Caratteristiche proteomica sono stati ulteriormente analizzati utilizzando l'analisi di significatività di microarrays software (SAM) presso la Stanford University. Il pacchetto è stato progettato per affrontare problemi specifici per l'analisi dei dati di microarray (rapporto segnale-rumore scostamento diverso da gene a gene, gran numero di punti di dati da un piccolo numero di campioni), ma abbiamo trovato ad essere applicabili all'analisi dei dati proteomica pure. L'algoritmo del software è stato descritto da Tusher et al
. [16]. In breve ha definito una metrica denominata differenza relativa per misurare la differenza fra due o più gruppi di dati al posto del valore di p
. Si impiegato una variante del metodo bootstrap e ripetutamente diviso un dato insieme di dati (spettri contenente le caratteristiche proteomica in questo studio) a caso in due gruppi per calcolare la differenza relativa per ciascuna delle permutazioni. Il numero di permutazioni è stato impostato per essere 1000 in questo studio e il software calcola 1000 valori differenza relativa per ogni caratteristica proteomica. La differenza relativa del particolare gruppo di interesse (osservata differenza relativa) è stata confrontata con la differenza relativa media di tutte le permutazioni (differenza relativa prevista) di ciascuna funzione e la funzionalità è stato giudicato up- o down-regolato a seconda che la sua osservata differenza relativa di maggiore o minore rispetto al suo differenza relativa prevista entro una certa soglia. Il software ha stimato un tasso di scoperta falso (anche definito in riferimento [16]) per ogni valore di soglia che ha fornito un mezzo indiretto per impostare il taglio. I marcatori identificati da questo metodo sono risultate statisticamente significative. Il tasso di scoperta di falsi è stato impostato per essere inferiore a 0,05 in questo studio.
Per convalidare i marcatori identificati da SAM, un secondo lotto di 53 campioni in cieco sono stati aggiunti al set di dati per il clustering gerarchico utilizzando il software Ciphergen Express Data Manager. Mentre ci si aspettava i campioni noti utilizzati da SAM per selezionare i marcatori per eseguire bene nel clustering, i campioni in cieco sono stati inclusi per testare quanto bene i marcatori generalizzare a campioni sconosciuti. I risultati del raggruppamento sono stati semplicemente confrontati con la vera identità dei campioni e nessun metodo di classificazione avanzata o qualsiasi altro software è stato utilizzato per la convalida. Identificazione di biomarker

gastrico proteine ​​del fluido sono stati frazionati per cromatografia a scambio anionico (Q HyperD , Ciphergen Biosystems Inc.), con variazioni graduali di pH per eluizione. Proteine ​​in 50 mmol /L TrisHCl, 1 g /L ottile glucopiranoside, pH 8 eluenti sono stati ulteriormente purificati su una matrice a scambio cationico (LWCX30) utilizzando 50 mmol /L di acetato di sodio, 1 g /L ottile glucopiranoside, pH 5 come vincolante e tampone di lavaggio. Dopo l'aggiunta di molecole di energia acido assorbenti (Ciphergen Biosystems Inc.) alfa-ciano-4-idrossicinnamico, le proteine ​​trattenute sono stati analizzati mediante PBSII e Q-TOF (Waters /Micromass) dotato di una interfaccia ProteinChip (PCI 1000, Ciphergen Biosystems Inc) . Le proteine ​​sono state caratterizzate da MS /MS frammentazione e l'identificazione è stato fatto da ricerca del database con Mascot (Matrix Science Ltd., London, UK).
Biomarker convalida
Questo è stato eseguito in una terza serie di campioni di fluidi gastrici tratto da benigna gastrica e pazienti affetti da cancro gastrico. Ogni campione raccolto di recente è stato elaborato per rimuovere i detriti solidi e di concentrare il contenuto proteico come segue. Dopo aver aggiunto phenylmethanesulfonyl fluoro ad una concentrazione finale di 0,2 mM, il campione è stato centrifugato per 15 minuti a 500 g e 4 ° C. Inibitori della proteasi (Complete Mini ™, Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA) sono stati aggiunti al surnatante seguita da filtrazione a membrana centrifuga a 2 900 g ed il dispositivo di 15 ° C (Amicon Ultra-4 centrifuga filtro, 5 000 limite nominale peso molecolare , Millipore, Billerica, MA, USA) finché il campione è stato ridotto a 10 - 20% del suo volume originale. concentrazione proteica totale è stata determinata dalla Quant Kit 2-D (Amersham Biosciences, Pisctaway, NJ, USA). Pepsinogeno C e alfa-defensine 1-3 concentrazioni sono stati determinati dai test immuno-enzimatico (ELISA) utilizzando kit da Alpco Diagnostics (Salem, NH, USA) e Hycult biotecnologia B.V. (Uden, Paesi Bassi), rispettivamente. Ogni campione è stato elaborato in duplicato per pepsinogeno C e livelli defensin utilizzando protocolli dei fornitori. I campioni per analisi pepsinogen C sono stati pre-diluiti 120 volte. Le concentrazioni di pepsinogeno C e alfa-defensine 1-3 sono stati ottenuti facendo riferimento alle rispettive curve standard ed espressi come ng (pepsinogeno C) o pg (defensin) per microgrammi di proteina del liquido gastrico totale.
Helicobacter pylori
Il presenza di H. pylori
nei tessuti dello stomaco è stato identificato dalla visualizzazione di microrganismi a spirale nelle sezioni istologia e /o mediante immunoistochimica. Quattro sezioni di tessuto-micron sono stati de-cerato in xilene e decrescenti gradi di etanolo. Antigen recupero sia per riscaldamento in tampone citrato, pH 6,0. L'anticorpo primario contro H. pylori
(1:50 diluizione; DAKO A /S, Glostrup, Danimarca) è stato seguito dal collegamento anticorpi polimerico secondario (Envision Chem Mate, DAKO) e visualizzati utilizzando diaminobenzidina come cromogeno
. risultati
più proteine ​​biomarcatori l'alto o verso il basso regolamentati a cancro gastrico sono stati scoperti nel liquido gastrico. Una mappa rappresentativa proteomica di fluido gastrico è mostrato in figura 1. Si tratta di una vista gel di spettro di massa mostra proteine ​​del fluido gastrico selettivamente legati al rame immobilizzato (II) ione metallico nell'intervallo di peso molecolare 1500 Da a 6000 Da. marcatori proteici significativi trovato per essere down-regolato nel liquido cancro gastrico (p
< 0,01) sono indicati da frecce. Figura 1 Espressione carta Differenza di liquido gastrico su rame (II) immobilizzato metallo affinità serie di cattura ProteinChip (IMAC3). Le frecce indicano biomarcatori proteici significativamente diversi a livello di espressione tra i due gruppi di campioni.
Una mappa rappresentante proteomica di gastrico pellet di estratto fluido è mostrato in Figura 2. Le proteine ​​sono state selettivamente legato a una superficie di ca matrice di scambio. marcatori proteici significativi trovati per essere up- o down-regolato in gastrica pellet fluido cancro (p
< 0,01) sono indicati da frecce. Figura 2 Espressione carta Differenza di gastrico pellet di estratto fluido sulla gamma di scambio cationico ProteinChip (WCX2). Le frecce indicano biomarker proteici significativamente diversi livelli di espressione tra i due gruppi di campioni
CV medio. (Coefficiente di variazione; cumulativo per 10-15 picchi principali fluidi gastrici per spettro, n = 8) per il rame immobilizzato (II) matrice ProteinChip (IMAC3) è stato del 12,8%, per il campo di scambio cationico (WCX2) era del 15%, per la serie a scambio anionico (SAX2) è stato del 17,3%, e per il chip interazione idrofobica (H50) è stato del 13,6%. Questi valori di CV sono in linea con la valutazione riproducibilità in letteratura SELDI [17, 18].
Da analisi SAM di tutte le funzioni di proteomica (numero totale di funzioni 41 800, il numero medio per retentato mappa 314) in estratto fluido e pellet gastrica , 46 funzioni di proteomica sono stati trovati ad essere significativamente down-regolati nel cancro gastrico e 60 caratteristiche proteomica erano significativamente up-regolato in cancro gastrico. (Dati da condizioni diverse, ad esempio, dei fluidi e pellet, così come superfici diverse, sono stati semplicemente aggregati insieme funzioni come distinte per SAM. Marcatori riportati da SAM in entrambi i pellet e surnatante frazioni sono stati identificati e rappresentati solo una volta nella lista dopo che erano manualmente ritenuti biologicamente significativa). marcatori significativamente down-regolato incluso 1884 2428, 2594, 2840, 4050, 11720, 13700 Da; marcatori significativamente up-regolati inclusi 1761, 1831, 3372, 3443, 3605, 5160, 6780 Da. (La maggior parte degli indicatori significativi sono stati scoperti su WCX2 e IMAC-rame (II), seguita da SAX2). Sulla base delle 106 significativamente diverse caratteristiche di proteomica (file aggiuntivo 1), è stata eseguita a due vie di analisi di clustering gerarchico (bidimensionale linkage completo). La maggior parte dei casi di cancro gastrico sono stati raggruppati insieme per formare un gruppo distintivo (Figura 3 e sui file 2). Analisi delle componenti principali dei dati stessi anche rivelato che il cancro e campioni benigni possono essere ben separati in due gruppi, con 2 negativi falsi (che rappresentano doppia analisi dello stesso caso) e 9 falsi positivi, rispettivamente (Figura 4). Un cancro gastrico campione di fluido (da un caso di stadio I scarsamente differenziato adenocarcinoma gastrico) cluster tra i campioni non tumorali; tutti gli altri 4 nelle fasi iniziali (fasi 0 e I) pazienti correttamente raggruppati con i campioni da 14 pazienti con stadio II - IV cancro gastrico, dando una sensibilità complessiva diagnostica del 95% (18/19 pazienti affetti da cancro gastrico) sul set di addestramento. Figura 3 Espressione carta Differenza di gastrici proteine ​​estratto fluido e pellet di campioni training set su quattro matrici ProteinChip, esposti in due vie clustering gerarchico. Caratteristiche proteomica significative vengono visualizzati in senso verticale. L'intensità della scala di grigi indica il grado di proteina livello relativo, superiore o inferiore al valore mediano. casi di pazienti sono presentate in orizzontale; la maggior parte dei pazienti affetti da cancro gastrico sono strettamente raggruppati insieme. Questa figura mostra quartile superiore dell'immagine completa (vedere file aggiuntive 2 per l'immagine completa).
Figura 4 Principal trama analisi delle componenti di caratteristiche proteomica di campioni di addestramento. Un unico piano (indicato con la linea nera) divide i campioni in due gruppi con 1 falso negativo (indicato in punti duplicati) e 9 falsi positivi.
Nove dei 36 campioni non tumorali nel training set cluster con i campioni di cancro (specificità 75%). Di questi, 1 aveva una displasia adenomatosa polipo - una lesione precancerosa [19]. Tra gli altri 8 pazienti, 6 avevano clinicamente diretto biopsie che rivelavano metaplasia intestinale in 4 pazienti (67%). Otto pazienti non-cancro i cui profili proteici dei fluidi gastrici raggruppati nel gruppo normale anche clinicamente diretto biopsie della mucosa che hanno mostrato metaplasia intestinale in soli 2 pazienti (25%). Una rassegna di 1000 biopsie gastriche consecutivi eseguiti per tutte le indicazioni ha mostrato una prevalenza di metaplasia intestinale nel General Hospital di Singapore durante il periodo di studio del 30%. Questo contrasta con la prevalenza di almeno il 67% di metaplasia intestinale tra i casi clinicamente benigni i cui profili di proteomica cluster più stretto contatto con casi di cancro gastrico che con altri normali, coerenti con metaplasia intestinale essendo uno stato intermedio nel passaggio del normale epitelio gastrico per adenocarcinoma gastrico . l'identificazione accurata di metaplasia intestinale mediante endoscopia è noto per essere imprecise [20]. Così, un cancro gastrico di tipo impronte digitali proteomica è forse un indicatore sensibile per la presenza di questa lesione pre-maligne tra i pazienti clinicamente diagnosticati come avere disturbi gastrici benigni.
Pazienti affetti da cancro gastrico nella formazione set erano significativamente più anziani (media 67,7 anni anni) rispetto ai pazienti con patologie gastriche benigne (media 56,6 anni) (p = 0,0062
). Per affrontare la possibilità che i profili proteici hanno riguardato l'età o etnia, abbiamo dati del sottogruppo di pazienti cinesi sopra i 55 anni di età ri-analizzato. Ciò ha provocato 1/17 tumori erroneamente classificati (lo stesso tumore che è stato classificato erroneamente quando tutti i 19 tipi di cancro sono stati analizzati; sensibilità 94%) e 4/17 controlli erroneamente classificati (gli stessi 4 controlli che sono stati tra i 9 casi benigni erroneamente classificati; specificità 76,5%) .
Abbiamo poi testato le prestazioni effettive dei profili proteomici di cancro distintivo da campioni benigni in una seconda serie di 53 campioni in cieco gastrici fluido e pellet di estrazione (24 tumori gastrici e 29 disturbi gastrici benigni) (file aggiuntivo 3). Ventuno dei 24 tumori gastrici sono stati identificati correttamente (sensibilità 88%) e 2 su 29 campioni benigni sono stati erroneamente classificati (specificità 93%) (Figura 5). Figura 5 Espressione carta Differenza di gastrici proteine ​​del fluido e pellet di estratto di campioni set di validazione su quattro array ProteinChip, visualizzata in due vie clustering gerarchico. Caratteristiche proteomica significative vengono visualizzati in senso orizzontale. L'intensità dei colori rosso o verde indica il grado di proteina livello relativo, superiore o inferiore al valore mediano. casi di pazienti vengono presentati in verticale; la maggior parte dei pazienti affetti da cancro gastrico sono strettamente raggruppati insieme.
selezionati marcatori proteomica (sulla base di significatività punteggio determinato da SAM) erano semi-purificato su array ProteinChip e identificati direttamente sulle macchie da collisione indotta dissociazione sequenziamento (Figura 6). Molti dei marcatori significativamente down-regolato nei pazienti affetti da cancro mostrati nelle figure 1 e 2, 1881,9 Da, Da 2041,0, 2188,1 DA e 2387,3 Da, sono stati identificati per essere pepsinogeno C e pepsina A frammenti peptidici di attivazione (Tabella 1). I marcatori tripletta up-regolata nei pazienti affetti da cancro mostrati nelle figure 2, 7 e aggiuntive di file 4 sono stati identificati per essere alpha defensina-1,2,3. trame intensità dispersione mostrano differenze estremamente significative le intensità medie di defensin e pepsina frammento tra il controllo benigno e campioni di liquido di cancro gastrico (p,
= 0.003 e 0.00002, rispettivamente) (Figura 8). Utilizzando ELISA specifico per pepsinogen C, abbiamo confermato concentrazioni significativamente più basse nei fluidi di cancro gastrico (11,9 ± 0,1 ng /mg proteine ​​totali; media ± SEM n = 6) rispetto ai campioni benigni (21,5 ± 1,4 ng /mg di proteine ​​totali n =. 23) in un terzo set campione (p = 0,0126
; spaiato a due code t
test di Student). ELISA eseguito sullo stesso set di prova per i livelli defensin mostrato alte concentrazioni in campioni di cancro gastrico (63,4 ± 9,2 pg /mg proteine ​​totali; media ± SEM n = 6) rispetto ai campioni benigni (46,2 pg /mg proteine ​​totali; media ± sem n = 23) ((p = 0,0654
; t
test di Student) sequenze .table 1 Peptide identificati da MS //MS
Peptide m /z
Sequenza
proteico Partita
Mowse † segnare
Mowse segnare con una significativa omologia
2.386,29
FLKKHNLNPARKYFPQWKA
pepsina Un peptide di attivazione
35
> 28
2.187,12
FLKKHNLNPARKYFPQW
pepsina Un peptide di attivazione
18
> 26
2.040,03
LKKHNLNPARKYFPQW
pepsina Un peptide di attivazione
28
> 26
1.775,95
FLKKHNLNPARKYF
pepsina Un peptide di attivazione
47
> 26
1.628,84
LKKHNLNPARKYF
pepsina Un peptide di attivazione
40
> 28
1.880,92
LRTHKYDPAWKYRF
Pepsinogeno C attivazione peptide
31
> 22
† Mowse punteggio = -10Log ( P), dove P = probabilità che la partita è un evento casuale (P
< 0.05) m /z
, massa /carica
figura spettro di massa 6 ad alta risoluzione di frazionati proteine ​​fluidi gastrici in serie LWCX30 ProteinChip ottenuti su un QTOF dotato di interfaccia PCI1000. picchi in scatola sono stati sottoposti ad analisi frammentazione dissociazione indotta da collisione MS /MS.
Figura 7 spettro di massa ad alta risoluzione delle proteine ​​dei fluidi gastrici in serie H50 ProteinChip ottenuti su un QTOF dotato di interfaccia PCI1000. Questa figura mostra i marcatori tripletta up-regolati nel cancro gastrico. Si prega di consultare il file supplementare 4 per l'immagine completa.
Figura 8 lotti dispersione dei valori di intensità di defensin e frammenti di pepsina presente nei campioni di liquido gastrico di pazienti affetti da cancro gastrico dal training set di controllo benigno e.
Discussione
I nostri dati suggeriscono che il profilo spettrale del liquido gastrico non frazionata può essere un utile complemento per la diagnosi del cancro e l'individuazione di malattia in stadio precoce, quando combinato con gastroscopia clinica. La maggior parte dei recenti tentativi di identificare proteine ​​biomarcatori per il cancro gastrico hanno indagato siero [21-29] e il tessuto [24, 30-37], e hanno usato sempre la spettrometria di massa. i rapporti precedenti di saggi sierologici dei singoli marcatori tumorali noti ad esempio CEA, CA 19-9, CA 72-4, CA242 e TAG-72, hanno generalmente una bassa sensibilità (< 50%) [38-41]. Inoltre, vi è una sostanziale trasversale positività di questi marcatori tumorali nei tumori non-gastrici es livelli di CEA rialzato e MG7-Ag sono comuni nel tumore del colon-retto, colangiocarcinoma, carcinoma pancreatico, e persino nei controlli sani [40, 23]. Non a caso, tali marcatori tumorali non hanno alcun ruolo istituito nel gastrica diagnosi del cancro e di screening, anche se possono servire come indicatori prognostici e marcatori precoci di malattia recidivante seguenti gastrectomia [39, 41, 42].
Abbiamo scelto di esaminare i profili di proteomica di liquido gastrico di biomarcatori di malattia perché mi sembrava probabile che turbato la secrezione gastrica proteina negli stati maligni e pre-maligne, insieme alla possibile presenza di cellule tumorali espansa, potrebbe generare profili di proteomica distintivi. Come nella ricerca di biomarcatori sierici, diversi gruppi hanno indagato l'utilità diagnostica dei marcatori tumorali conosciute nel succo gastrico. Né CEA né CA 19-9 positività nel liquido gastrico ha dimostrato l'accuratezza diagnostica [43-46]. Alfa-1 antitripsina nel succo gastrico è stato recentemente segnalato come biomarker cancro gastrico [47, 48].
Nostro approccio allo sviluppo di un metodo sensibile per la diagnosi del cancro gastrico differiva da precedenti studi in tre modi. In primo luogo, abbiamo scelto un campione biologico che è stato organo-specifica (cioè succo gastrico per via endoscopica aspirato) piuttosto che (cioè il siero) sistemica, il ragionamento che le caratteristiche molecolari sarebbe più probabile essere specifica per la malattia. In secondo luogo, la spettrometria di massa ha permesso di adottare un approccio imparziale discovery-based. In terzo luogo, i nostri dati generati profili di più marcatori di proteomica che vengono sempre più considerati come aventi una maggiore sensibilità e specificità di marcatori tumorali singole [49, 50]. Per il cancro gastrico, combinando anche 2 o 3 tumorali marcatori raggiunti accuratezza diagnostica migliore rispetto alla sola un unico marcatore [38, 40].
Protein impronte digitali di liquido gastrico da pazienti affetti da cancro gastrico ha mostrato un totale di 106 funzioni di proteomica che erano significativamente up - o down-regolato (file complementari 1 e 3). Due indicatori importanti sono stati selezionati per l'identificazione da MS /MS. Pepsinogen A e peptidi di attivazione pepsinogeno C sono stati down-regolato nei fluidi gastrici rimosso da stomaci con istologicamente confermata adenocarcinomi. Uno studio di sezioni al criostato di cancro gastrico ha anche riferito significativo down-regulation di Pepsinogeno C, identificato da MS /MS, nel tessuto tumorale [51].

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