Le protéome du liquide gastrique distinctif dans le cancer gastrique révèle un profile

diagnostic multi-biomarqueur Le protéome du liquide gastrique distinctif dans le cancer gastrique révèle un profil de diagnostic multi-biomarqueur
Résumé de l'arrière-plan
survie au cancer gastrique global reste faible, surtout parce qu'il n'y a pas de méthodes fiables pour identifier la maladie à un stade précoce hautement curable. Multi-protéines profilage des fluides gastriques, obtenu à partir du site anatomique de la pathologie, pourrait révéler des empreintes digitales protéomiques de diagnostic.
Méthodes
profils protéiques ont été générés à partir des échantillons de fluides gastriques de 19 cancer gastrique et 36 bénignes gastritides patients subissant élective, cliniquement gastroscopie -indicated utilisant désorption /ionisation laser à temps de vol spectrométrie de masse en surface renforcée sur plusieurs baies de ProteinChip. caractéristiques protéomiques ont été comparés par une analyse de l'algorithme de microarray et dans les deux sens classification hiérarchique importance. Un second ensemble d'échantillons en aveugle (24 cancers gastriques et 29 gastritides cliniquement bénignes) a été utilisé pour la validation
. Résultats
Par signification analysyis de microréseau, 60 caractéristiques protéomiques étaient régulés à la hausse et 46 ont été régulés à la baisse dans les échantillons de cancer gastrique (p
< 0,01). clustering MultiMarker a montré deux profils protéomiques distinctifs indépendamment de l'âge et l'origine ethnique. Dix-huit des 19 échantillons de cancer regroupés (sensibilité 95%), tandis que 27/36 des échantillons non cancéreux regroupés dans un deuxième groupe. Neuf échantillons non-cancéreuses qui regroupés avec des échantillons de cancer inclus lésions 5 pré-malignes (1 polype adénomateux et 4 intestinale métaplasie). Validation à l'aide d'un second ensemble d'échantillons a montré la sensibilité et la spécificité à 88% et 93%, respectivement. La valeur prédictive positive des données combinées a été de 0,80. séquençage du peptide sélectionné identifié pepsinogène C et pepsine Un peptide d'activation comme significativement régulée à la baisse et l'alpha-défensines comme significativement régulée à la hausse.
Conclusion
Ce test protéomique multimarqueurs simple et reproductible pourrait compléter l'évaluation de gastroscopique clinique des patients symptomatiques pour améliorer la précision du diagnostic pour le cancer gastrique et des lésions pré-malignes.
Contexte
Contrairement à d'autres cancers courants, le pronostic des patients atteints de cancer gastrique plus est pauvre et a peu améliorée au cours des dernières décennies. Les taux de survie à cinq ans pour le cancer gastrique sont considérablement plus bas que tous les principaux cancers sauf les cancers du foie, du pancréas et de l'œsophage [1]. Étant donné que le cancer gastrique à un stade précoce a un bien meilleur pronostic (survie à 5 ans environ 90%) que pointe le cancer gastrique (survie à 5 ans 3-10%) [2, 3], la mortalité globale par cancer gastrique devrait diminuer sensiblement par mesures qui se traduisent par downstaging des tumeurs au moment du diagnostic initial.
Bien que gastroscopie est l'étalon-or pour le diagnostic de cancer de l'estomac, sa précision est pas aussi élevé que pour les maladies gastriques bénignes telles que les ulcères peptiques, en particulier dans les régions géographiques de faible à la prévalence du cancer gastrique intermédiaire. Le pourcentage du diagnostic du cancer raté, a rapporté que 4,6%, 14% et même 33% [4-6], est non négligeable. Même au Japon, le taux de faux négatifs a été signalé à 19% [7]. Ces données sont compatibles avec la valeur prédictive positive de seulement de 0,4 à 0,7 pour le diagnostic endoscopique du cancer gastrique dans différents centres [8-10]. Bien que la proportion de diagnostics manqués semble faible, le nombre absolu de patients a refusé le bénéfice du diagnostic à un stade curable est pas négligeable. Même à un taux de faux positifs de diagnostic modestement faible de 5%, plus de 47.000 cancers gastriques auraient été manqué dans un pays à faible prévalence seul (USA) en une seule année, 2000 [11]. l'évaluation endoscopique comprend fréquemment des biopsies muqueuses, mais il n'y a pas de normes cliniques pour soit le nombre optimal de biopsies ou les régions anatomiques qui doivent être échantillonnés. Une recommandation couramment citée est de prendre au moins sept biopsies pour diagnostiquer correctement le cancer gastrique [12]. Dans cette étude, cependant, totalement 17% de toutes les lésions suite révélées être malignes ont été considérées comme bénignes à l'endoscopie. Ainsi, l'examen endoscopique de la muqueuse souffre de variation inter-observateur, la corrélation suboptimale avec histopathologie, difficulté à détecter les cancers muqueux et la visualisation sans entrave de toutes les sous-régions anatomiques par exemple . Après la chirurgie gastrique précédente [13, 14]
fluide gastrique consiste en un mélange de protéines cellulaires sécrétées solubles et exfoliée de la totalité de la muqueuse gastrique - y compris les régions qui ne peuvent pas être évalués de manière adéquate par gastroscopie fibroscope. Nous avons donc raisonné que le profil protéomique de liquide gastrique, généralement considéré comme un déchet produit par lors de l'examen gastroscopique, pourrait utilement compléter l'évaluation clinique classique en fournissant une «biopsie moléculaire» que les échantillons de manière efficace l'ensemble de la muqueuse gastrique, d'autant plus que les techniques de détection des protéines telles comme la spectrométrie de masse peut être très sensible. Si elle est effectuée au cours de la gastroscopie cliniquement indiqué, l'obtention d'un liquide gastrique ne pas augmenter le caractère invasif de la procédure. A la différence du protéome plasma, le protéome de liquide gastrique est susceptible d'être moins complexe, mais enrichie en marqueurs biologiques spécifiques de la maladie, étant produit directement sur le site de la maladie. Les mêmes biomarqueurs, même si elle est présente dans le plasma, peuvent être dilués au-delà des limites de détection et en mélange avec d'autres protéines systémiques plus abondantes qui reflètent les conditions physiopathologiques concomitants (par exemple les maladies concomitantes), plutôt que de la maladie spécifique à un site anatomique.
Nous avons étudié une nouvelle approche pour les biomarqueurs en développement pour le cancer gastrique par profilage peptides sécrétés solubles présents dans le liquide gastrique et protéines endoscopically aspiration extrait des cellules épithéliales exfoliées, également récupérés au cours de l'endoscopie par surface améliorée laser désorption-ionisation à temps de vol (SELDI TOF) spectrométrie de masse. Nos résultats suggèrent que plusieurs biomarqueurs protéiques provenant d'une source spécifique d'organe-à-dire le liquide gastrique, générer une signature de cancer gastrique distinctif qui mérite d'être développée comme un outil pour améliorer la précision du diagnostic de la gastroscopie et a le potentiel pour détecter le cancer gastrique à un stade précoce et pré-malignes lésions (métaplasie intestinale et dysplasie).
Méthodes
échantillons cliniques
fluides gastriques ont été obtenus au cours de la gastroscopie de nuit à jeun patients vus à l'Hôpital général de Singapour. Le protocole d'étude a été approuvé par le Comité d'éthique de l'Hôpital général de Singapour. et conforme aux dispositions de la Déclaration d'Helsinki 1995. Les indications de gastroscopie étaient exclusivement clinique et étaient indépendants de l'étude. L'analyse initiale a été réalisée sur un ensemble de 19 échantillons provenant de histologiquement prouvé adénocarcinomes gastriques (13 de type intestinal, 4 de type diffus, 1 type mixte, 1 indéterminé) [15] et 36 échantillons de formation des patients avec des conditions gastriques cliniquement bénignes. L'âge moyen des 19 patients atteints de cancer gastrique (13 hommes, 6 femmes, 17 Chinois, 2 Indiens) était de 68 ans. Répartition par American Joint Committee on Cancer (AJCC) stade clinique était stade 0 (1 patient), stade I (4 patients), le stade II (2 patients), stade III (2 patients) et le stade IV (10 patients). L'âge moyen des 36 patients souffrant de maladies gastriques bénignes (19 hommes, 17 femmes; 33 chinois, malais 2, 1 Indien) était de 57 ans. Les diagnostics cliniques après endoscopie de patients non cancéreux étaient normaux (9), gastrite antrale (9), gastrite (6), l'ulcère (4), hernie hiatale (3), les polypes hyperplasiques (2), de l'oesophage de Barrett (1), fundique cicatrice (1) et polype adénomateux (1).
l'algorithme de classification élaboré à partir de l'ensemble de la formation a été testé par une analyse en aveugle d'un ensemble de validation composé d'un autre 24 histologiquement confirmé adénocarcinomes gastriques (10 type intestinal, 7 type diffus, 1 mixte type 5 indéterminé, 1 neuroendocrine) et 29 échantillons gastriques cliniquement bénignes. L'âge moyen de ces 24 patients atteints de cancer gastrique (18 mâles, 6 femelles, 21 Chinois, 3 malais) était de 70 ans. Répartition par stade clinique AJCC était la phase I (5 patients), le stade II (4 patients), stade III (2 patients) et le stade IV (12 patients). Un patient dans l'ensemble de validation a refusé une enquête plus approfondie et n'a pas pu être mis en scène. L'âge moyen des 29 patients non cancéreux (11 hommes, 18 femmes; 26 chinois, 2 indiens, 1 malais) était de 47 ans. Les diagnostics cliniques après gastroscopie des patients non cancéreux étaient gastrite (14), les polypes des glandes fundiques (2), l'ulcère gastrique aigu (2), duodénite (2), hernie hiatale (1) et (8) normal.
Aucun les patients atteints de cancer gastrique avaient reçu toute forme de traitement du cancer au moment de la gastroscopie.
Prendre formation et de validation des cas ensemble, 19% (8/43) et 29% (19/65) des patients atteints de cancer gastrique et gastrique bénin conditions, respectivement, ont été positifs pour H. pylori
, une différence qui n'a pas été significative par le test exact de Fisher (2-sided valeur p = 0,4508
).
collecte et traitement d'échantillons
liquide gastrique a été aspiré dans un récipient stérile au début de l'endoscopie, attribué un code anonymisées et immédiatement placé sur la glace. des échantillons de sang ou de bile tachés ont été rejetées. Seulement cliniquement des lésions suspectes muqueuses ont été biopsiées à la discrétion de l'endoscopiste. les fluides gastriques ont été centrifugés à 180 g pendant 6 minutes à 4 ° C, à partir de laquelle le surnageant a été centrifugé de nouveau à 16 100 g pendant 30 minutes à 4 ° C. Pellets des deux centrifugations ont été combinées. Les surnageants à grande vitesse ont été stockés séparément des pastilles à -80 ° C.
Protein profilage
Après décongélation, 10 pi de chaque échantillon de liquide gastrique a été appliqué à différentes surfaces chimiques des tableaux de ProteinChip (Ciphergen Biosystems Inc, Californie , Etats-Unis): (a) cuivre (II) capture immobilisé en métal d'affinité (IMAC3) en présence de 100 ul de 1 mol /l d'urée, 1 g /l 3 - [(3-cholamidopropyl) diméthylammonio] -1-propanesulfonate ( CHAPS), 0,3 mol /L de KCl, cocktail inhibiteur de protease (Roche Diagnostics, Mannheim, Allemagne), 50 mol /L de Tris-HCl, pH 7,5; (B) Faible échange cationique (et WCX2 CM10) en présence de 100 ul d'acétate de 50 mmol /L de sodium, 1 g /l octyl glucopyrannoside, cocktail inhibiteur de protease à pH 5; (C) d'échange d'anions forte (SAX2) en présence de 100 ul de 50 mmol /L de Tris-HCl, 1 g /l CHAPS, cocktail inhibiteur de protease, à pH 8; et (d) Interaction Hydrophobe (H50) en présence de 100 pi d'acide trifluoroacétique à 5 mL /L. Après un lavage avec 100 ul des mêmes tampons respectifs, on a ajouté de l'acide sinapinique pour faciliter la désorption et l'ionisation. Les puces ont été analysées par SELDI-TOF-MS (pBSII, Ciphergen Biosystems Inc.). Les cancers et les contrôles ont été entremêlés et exécuter simultanément sur la même puce et puces multiples pour minimiser la variation puce-à-puce.
Les pastilles fluides gastriques ont été remises en suspension dans 25 pi de 6 mol /L guanidine thiocyanate, 5 g /L octyle glucopyranoside, 0,1 mol /L de HEPES, pH 7, et de 100 à 200 pi de 9 mol /L d'urée, 2 g /L de CHAPS, 50 mmol /L de Tris-HCl, pH 7,5 par vortex pendant 45 minutes à 4 ° C. Après centrifugation à 20 000 g pendant 5 minutes, 10 ul de l'extrait a été appliqué aux réseaux de ProteinChip comme décrit ci-dessus. Le plus une carte de rétentat a été généré dans laquelle les protéines individuelles ont été affichés sous forme de pics séparés sur la base de leur rapport masse sur charge . Les données des spectres protéomiques ont été analysés par Ciphergen Software Express Data Manager avec piste de motif et dans les deux sens algorithme de classification hiérarchique. pics alignés avec les rapports signal sur bruit supérieur à 3 ont été normalisés par le courant ionique total. caractéristiques protéomiques ont ensuite été analysées à l'aide de l'analyse des microréseaux (SAM) du logiciel de l'Université de Stanford de signification. Le paquet a été conçu pour répondre à des problèmes spécifiques à l'analyse des données de puces à ADN (rapport signal sur bruit variance différent du gène à un grand nombre de points de données à partir d'un petit nombre d'échantillons), mais nous avons trouvé qu'il soit applicable aux protéomique analyse des données ainsi. L'algorithme du logiciel a été décrit par Tusher et al
. [16]. En bref, il a défini une métrique appelée la différence relative pour mesurer la différence entre deux ou plusieurs groupes de données à la place de la valeur p de
. Il utilise une variante du procédé d'amorçage et divisé de façon répétée un ensemble de données (spectres contenant les caractéristiques protéomiques dans cette étude) au hasard en deux groupes pour calculer la différence par rapport à chacun des permutations. Le nombre de permutations a été fixé à 1000 dans cette étude et le logiciel calcule 1000 valeurs de différence relative pour chaque fonction protéomique. La différence relative du groupement d'intérêt particulier (observé différence relative) a été comparée à la différence moyenne relative de l'ensemble des permutations (différence relative attendue) de chaque fonction et la fonction a été jugée positive ou négative régulée selon que son la différence relative observée était plus grande ou plus petite que la différence relative attendue par un certain seuil. Le logiciel a estimé un taux de fausse découverte (également défini dans la référence [16]) pour chaque valeur de seuil qui a fourni un moyen indirect pour régler la fréquence de coupure. Les marqueurs identifiés par cette méthode étaient statistiquement significatives. Le taux de fausse découverte a été fixé à moins de 0,05 dans cette étude.
Pour valider les marqueurs identifiés par SAM, un deuxième lot de 53 échantillons en aveugle ont été ajoutés à l'ensemble de données pour la classification hiérarchique en utilisant le logiciel de gestion Ciphergen Data Express. Bien que les échantillons connus utilisés par SAM pour sélectionner les marqueurs étaient censés bien performer dans le clustering, les échantillons en aveugle ont été inclus pour tester la façon dont les marqueurs généralisent à des échantillons inconnus. Les résultats de la classification ont simplement été comparés à la véritable identité des échantillons et aucune méthode de classification avancée ou tout autre logiciel a été utilisé dans la validation. Identification
de Biomarker
protéines du liquide gastrique ont été fractionnés par chromatographie échangeuse d'anions (Q HyperD , Ciphergen Biosystems Inc.), en utilisant des modifications progressives de pH pour l'élution. Les protéines dans le 50 mmol /L de Tris-HCl, 1 g /l octyl glucopyrannoside pH 8 éluants ont ensuite été purifiés sur une matrice d'échange de cations (LWCX30) en utilisant de l'acétate 50 mmol /L de sodium, 1 g /l octyl glucopyrannoside pH 5 comme de liaison et tampon de lavage. Après l'addition de molécules absorbant l'énergie d'acide (Ciphergen Biosystems Inc.) alpha-cyano-4-hydroxycinnamique, les protéines retenues ont été analysées par pBSII et Q-TOF (Waters /Micromass) équipé d'une interface ProteinChip (PCI 1000, Ciphergen Biosystems Inc.) . Les protéines ont été caractérisées par MS /MS fragmentation et de l'identification a été réalisée par la recherche de base de données avec Mascot (matrice Science Ltd., Londres, Royaume-Uni).
Validation de biomarqueurs
Ceci a été réalisé dans un troisième ensemble d'échantillons de fluide gastrique prélevé bénigne l'estomac et les patients atteints de cancer gastrique. Chaque échantillon fraîchement prélevé a été traité pour éliminer les débris solides et de concentrer la teneur en protéines de la manière suivante. Après avoir ajouté du fluorure de phénylméthanesulfonyle à une concentration finale de 0,2 mM, l'échantillon a été centrifugé pendant 15 minutes à 500 g et 4 ° C. Les inhibiteurs de protéases (Complete Mini ™, Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA) ont été ajoutés au surnageant suivie d'une filtration à membrane centrifuge à 2 900 g et 15 ° C (Amicon-4 Ultra dispositif de filtre centrifuge, 5 000 limite nominale de poids moléculaire; Millipore, Billerica, MA, USA) jusqu'à ce que l'échantillon a été réduit à 10 - 20% de son volume initial. La concentration totale en protéine a été déterminée par le Kit 2 Quant-D (Amersham Biosciences, Pisctaway, NJ, USA). Pepsinogène C et 1-3 concentrations défensines alpha-ont été déterminées par dosage immuno-enzymatique (ELISA) en utilisant des kits de Alpco Diagnostics (Salem, NH, Etats-Unis) et Hycult biotechnologie B.V. (Uden, Pays-Bas), respectivement. Chaque échantillon traité a été testé en double pour pepsinogène niveaux de défensines en utilisant les protocoles des fournisseurs et C. Les échantillons pour pepsinogène C dosage ont été pré-dilué 120 fois. Les concentrations de pepsinogène C et 1-3 défensines alpha-ont été calculées en référence à leurs courbes étalons respectives et exprimées en ng (pepsinogène C) ou pg (défensines) par microgramme de protéines dans le liquide gastrique totale.
Helicobacter pylori
la présence de H. pylori dans
tissus de l'estomac a été identifié par la visualisation des micro-organismes en spirale dans des sections histologiques et /ou par immunohistochimie. coupes de tissus à quatre microns ont été dé-cirés dans le xylène et les qualités décroissantes d'éthanol. La récupération d'antigène a par chauffage dans un tampon de citrate, pH 6,0. L'anticorps primaire contre H. pylori
(dilution 1:50; DAKO A /S, Glostrup, Danemark) a été suivie par le lien de polymère d'anticorps secondaire (Envision Chem Mate, DAKO) et visualisé en utilisant diaminobenzidine comme chromogène
. Résultats
multiples biomarqueurs protéiques en amont ou en bas-réglementés dans le cancer gastrique ont été découverts dans le liquide gastrique. Une carte protéomiques représentatif de liquide gastrique est représenté sur la figure 1. Il est une vue en gel d'un spectre de masse montrant des protéines de fluides gastriques liés sélectivement au cuivre immobilisé (II), l'ion métallique dans la gamme de poids moléculaire de 1500 Da à 6000 Da. marqueurs protéiques importants trouvés être régulés à la baisse dans le liquide gastrique de cancer (p
< 0,01) sont indiquées par des flèches. Figure 1: Expression de différence de carte de liquide gastrique sur le cuivre (II) immobilisés par affinité métallique capture ProteinChip matrice (IMAC3). Les flèches indiquent des biomarqueurs protéiques significativement différentes dans le niveau d'expression entre les deux groupes d'échantillons.
Une carte protéomique représentant de l'extrait de culot liquide gastrique est montré dans la figure 2. Les protéines ont été sélectivement lié à une surface cation de réseau d'échange. marqueurs protéiques importants trouvés pour être en amont ou régulé à la baisse dans l'estomac pastille de fluide du cancer (p
< 0,01) sont indiquées par des flèches. Figure 2: Expression de l'extrait de carte de différence de pastilles de liquide gastrique sur matrice échangeuse de cations ProteinChip (de WCX2). Les flèches indiquent les biomarqueurs protéiques sensiblement différentes dans le niveau d'expression entre les deux groupes d'échantillons
CV Moyenne. (Coefficient de variation; cumulatif pour les 10-15 pics principaux fluides gastriques par spectre, n = 8) pour le cuivre immobilisé (II), réseau ProteinChip (IMAC3) était de 12,8%, pour l'échange de cations array (WCX2) a été de 15%, pour l'échange d'anions array (SAX2) était de 17,3%, et pour la puce d'interaction hydrophobe (H50) était de 13,6%. Ces valeurs de CV sont en ligne avec l'évaluation de la reproductibilité dans la SELDI littérature [17, 18].
Par l'analyse SAM de toutes les fonctionnalités de protéomique (nombre total de fonctions 41 800, le nombre moyen par rétentat carte 314) dans l'extrait fluide et pellet gastrique , 46 caractéristiques protéomiques se sont révélés être significativement régulés à la baisse dans le cancer gastrique et 60 caractéristiques protéomiques étaient significativement régulée à la hausse dans le cancer gastrique. (Les données de conditions différentes, par exemple, le liquide et le culot ainsi que des surfaces différentes, ont été simplement agrégées ensemble des caractéristiques distinctes pour SAM. Les marqueurs rapportés par SAM dans les deux fractions de granulés et de surnageant ont été identifiés et représentés une seule fois dans la liste après avoir été manuellement jugé biologiquement significatif). marqueurs de manière significative vers le bas réglementés inclus 1884, 2428, 2594, 2840, 4050, 11720, 13700 Da; marqueurs significativement régulés à la hausse inclus 1761, 1831, 3372, 3443, 3605, 5160, 6780 Da. (La plupart des marqueurs importants ont été découverts sur WCX2 et IMAC-cuivre (II), suivie par SAX2). Sur la base des 106 caractéristiques protéomiques significativement différentes (fichier additionnel 1), dans les deux sens hiérarchique analyse de la concentration (de liaison complète en deux dimensions) a été réalisée. La plupart des cas de cancer gastrique ont été regroupés ensemble pour former un groupe distinct (Figure 3 et fichiers supplémentaires 2). Analyse en composantes principales des mêmes données a également révélé que le cancer et les échantillons bénins pourraient être bien séparés en deux groupes, avec 2 faux négatifs (représentant une double analyse de la même affaire) et 9 faux positifs, respectivement (figure 4). Un échantillon de fluide de cancer gastrique (à partir d'un cas de la phase I de l'adénocarcinome gastrique peu différencié) regroupés dans des échantillons non-cancer; tous les 4 stade précoce autres (stades 0 et I) patients correctement regroupés avec des échantillons de 14 patients de stade II - IV cancer de l'estomac, ce qui donne une sensibilité diagnostique globale de 95% (18/19 patients atteints de cancer gastrique) sur l'ensemble de la formation. Figure 3 Expression différence carte de protéines gastriques de formation ensemble des échantillons sur quatre tableaux de ProteinChip, affichées dans les deux sens classification hiérarchique extrait fluide et granulés. caractéristiques protéomiques importantes sont affichées verticalement. L'intensité du niveau de gris indique le degré de niveau protéique relative, supérieure ou inférieure à la valeur médiane. cas des patients sont présentés horizontalement; la plupart des patients atteints d'un cancer de l'estomac sont étroitement groupés ensemble. Cette figure montre le quartile supérieur de l'image complète (voir fichier supplémentaire s'il vous plaît 2 pour l'image complète).
Figure 4 principal terrain d'analyse des composants de caractéristiques protéomiques d'échantillons d'ensemble de la formation. Un seul plan (désigné par la ligne noire) divise les échantillons en deux groupes avec 1 faux négatif (montré dans les points en double) et 9 faux positifs.
Neuf des 36 échantillons non-cancer dans l'ensemble de la formation en cluster avec les échantillons de cancer (spécificité 75%). Parmi ceux-ci, 1 avait un polype adénomateux dysplasique - une lésion précancéreuse [19]. Parmi les 8 autres patients, 6 avaient cliniquement réalisé des biopsies qui ont révélé la métaplasie intestinale chez 4 patients (67%). Huit patients non cancéreux dont les profils protéiques fluides gastriques regroupés dans le groupe normal avait aussi cliniquement réalisé des biopsies muqueuses qui ont montré une métaplasie intestinale en seulement 2 patients (25%). Un examen de 1000 biopsies gastriques consécutives réalisées pour toutes les indications a montré une prévalence globale de la métaplasie intestinale à l'hôpital général de Singapour au cours de la période de 30% de l'étude. Cela contraste avec la prévalence d'au moins 67% de la métaplasie intestinale chez les cas cliniquement bénignes dont le profil protéomique regroupés plus étroitement avec les cas de cancer gastrique qu'avec d'autres normals, compatibles avec la métaplasie intestinale étant un état intermédiaire dans la transition de l'épithélium gastrique normale à l'adénocarcinome gastrique . L'identification précise de la métaplasie intestinale par endoscopie est connu pour être inexacts [20]. Ainsi, une empreinte digitale protéomique type de cancer de l'estomac est peut-être un indicateur sensible de la présence de cette lésion pré-malignes chez les patients cliniquement diagnostiqués comme ayant des troubles gastriques bénins.
Patients atteints de cancer gastrique dans la formation prévue étaient significativement plus âgés (67,7 âge moyen ans) que chez les patients souffrant de maladies gastriques bénignes (moyenne 56,6 ans) (p = 0,0062
). Pour faire face à la possibilité que les profils de protéines ont été liées à l'âge ou l'origine ethnique, nous les données du sous-ensemble de patients chinois au-dessus de 55 ans ré-analysé. Cela a abouti à 1/17 cancers (mal classés de la même tumeur qui a été mal classé quand les 19 cancers ont été analysés; sensibilité 94%) et 4/17 contrôles mal classés (les 4 mêmes contrôles qui ont été parmi les 9 cas bénins, mal classés spécificité 76,5%) .
Nous avons ensuite testé les performances réelles des profils protéomiques dans le cancer distinctif à partir d'échantillons bénignes dans une seconde série de 53 échantillons en aveugle gastriques fluides et granulés extrait (24 cancers gastriques et 29 troubles gastriques bénins) (fichiers supplémentaires 3). Vingt et un des 24 cancers gastriques ont été correctement identifiés (sensibilité 88%) et 2 de 29 échantillons bénins ont été mal classés (spécificité 93%) (figure 5). Figure 5 Expression différence carte de protéines du liquide et de l'extrait de granulés gastriques de validation ensemble des échantillons sur quatre tableaux de ProteinChip, affiché dans les deux sens classification hiérarchique. caractéristiques protéomiques importantes sont affichées horizontalement. L'intensité de la couleur rouge ou verte indique le degré de niveau protéique relative, supérieure ou inférieure à la valeur médiane. cas des patients sont présentées à la verticale; la plupart des patients atteints d'un cancer de l'estomac sont étroitement groupés ensemble.
marqueurs sélectionnés protéomiques (basé sur la signification classement déterminé par SAM) sont semi-purifiée sur des réseaux de ProteinChip et identifié directement sur les taches par séquençage de dissociation induite par collision (figure 6). Plusieurs de ces marqueurs significativement régulés vers le bas chez les patients cancéreux représentées sur les figures 1 et 2, 1881,9 Da, 2041,0 Da, 2188,1 Da et 2387,3 Da, ont été identifiés comme pepsinogène C et la pepsine A fragments de peptide d'activation (Tableau 1). Les marqueurs triplet régulés à la hausse chez les patients cancéreux représentés sur les figures 2, 7 et autres fichiers 4 ont été identifiés comme alpha défensines-1,2,3. parcelles intensité de dispersion montrent des différences très significatives dans les intensités moyennes des défensines et la pepsine fragment entre le contrôle bénigne et le cancer gastrique des échantillons de fluide (p = 0,003
et 0,00002, respectivement) (figure 8). Utilisation ELISA spécifique pour pepsinogène C, nous avons confirmé des concentrations significativement plus faibles dans les fluides de cancer gastrique (11,9 ± 0,1 ng /pg de protéine totale; moyenne ± n = 6.) par rapport à des échantillons bénins (21,5 ± 1,4 ng /pg de protéine totale n =. 23) dans un troisième ensemble d'échantillons (p = 0,0126
; apparié t à deux queues
test de Student). ELISA réalisée sur le même ensemble d'échantillons pour les niveaux de défensines ont montré des concentrations plus élevées dans les échantillons de cancer gastrique (63,4 ± 9,2 pg /pg de protéine totale; moyenne ± n = 6) que dans les échantillons bénins (46,2 pg /pg de protéine totale; moyenne ± n = 23) ((p = 0,0654
; t
test de Student) .Table 1 peptidiques séquences identifiées par MS //MS
Peptide m /z
Sequence
Protein match
Mowse † marquer
Mowse marquer avec une homologie significative
2.386,29
FLKKHNLNPARKYFPQWKA
pepsine 35
>la Une activation peptide; 28
2.187,12
FLKKHNLNPARKYFPQW de pepsine 18
et le gt d'une activation peptide; 26
2.040,03
LKKHNLNPARKYFPQW
pepsine 28
>la Une activation peptide; 26
1.775,95
FLKKHNLNPARKYF de pepsine 47
>la Une activation peptide; 26
1.628,84
LKKHNLNPARKYF
pepsine 40
>
Une activation peptide; 28
1.880,92
LRTHKYDPAWKYRF
pepsinogène C peptide d'activation
31
> 22
† Mowse score = -10Log ( P), où P = probabilité que le match est un événement aléatoire (P
< 0,05) m /z
, masse /charge
Figure 6 haute résolution spectre de masse de protéines du liquide gastrique fractionnées sur réseau LWCX30 ProteinChip obtenus sur un QTOF équipé d'une interface PCI1000. boxed pics ont été soumises à une analyse de la fragmentation par dissociation induite par collision MS /MS.
Figure 7 à haute résolution du spectre de masse des protéines du liquide gastrique sur le tableau H50 ProteinChip obtenues sur un QTOF équipé d'une interface PCI1000. Cette figure montre les marqueurs de triplet régulés à la hausse dans le cancer gastrique. S'il vous plaît voir le fichier complémentaire 4 pour l'image complète.
Figure 8 diagrammes de dispersion des valeurs d'intensité des défensines et fragment de pepsine présent dans des échantillons de fluides gastriques de contrôle bénins et les patients atteints de cancer gastrique de l'ensemble de la formation.
Discussion
Nos données suggèrent que le profil spectral du liquide gastrique non fractionnée pourrait être un complément utile pour le diagnostic du cancer et la détection de la maladie à un stade précoce, lorsqu'il est combiné avec gastroscopie clinique. La plupart des tentatives récentes à l'identification de biomarqueurs de protéines pour le cancer gastrique ont étudié le sérum [21-29] et de tissus [24, 30-37], et ont de plus en plus utilisé la spectrométrie de masse. rapports plus anciens de tests sérologiques de marqueurs tumoraux connus individuels par exemple CEA, CA 19-9, CA 72-4, CA242 et TAG-72, ont généralement une faible sensibilité (< 50%) [38-41]. En outre, il est multi-positivité importante de ces marqueurs de tumeurs dans les cancers gastriques, par exemple non les niveaux de CEA soulevées et MG7-Ag sont fréquents dans le cancer colorectal, le cholangiocarcinome, le cancer du pancréas, et même chez les témoins sains [40, 23]. Sans surprise, ces marqueurs tumoraux sériques ont aucun rôle établi dans le diagnostic du cancer gastrique et le dépistage, même si elles peuvent servir d'indicateurs pronostiques et marqueurs précoces de la maladie récurrente suivantes gastrectomie [39, 41, 42].
Nous avons choisi d'examiner les profils protéomiques du liquide gastrique de biomarqueurs de la maladie, car il semblait probable que perturbé la sécrétion gastrique de protéines dans les états malignes et pré-malignes, associée à la présence éventuelle de cellules cancéreuses exfoliées, pourrait générer des profils protéomiques distinctifs. Comme dans la recherche de marqueurs biologiques sériques, plusieurs groupes ont étudié l'utilité diagnostique de marqueurs tumoraux connus dans le suc gastrique. Ni CEA ni CA 19-9 positivité dans le liquide gastrique a démontré la précision du diagnostic [43-46]. Alpha-1 antitrypsine dans le suc gastrique a été récemment rapporté comme un biomarqueur du cancer gastrique [47, 48].
Notre approche de l'élaboration d'une méthode sensible pour le diagnostic du cancer gastrique diffère des études précédentes de trois façons. Tout d'abord, nous avons choisi un échantillon biologique qui était spécifique d'organe (de liquide gastrique à savoir endoscopically aspiré) plutôt que systémique (sérum-à-dire), le raisonnement que les caractéristiques moléculaires seraient plus probablement spécifique de la maladie. Deuxièmement, la spectrométrie de masse nous a permis d'adopter une approche basée sur la découverte impartiale. Troisièmement, nos données générées profils de plusieurs marqueurs protéomiques qui sont de plus en plus considérés comme ayant une plus grande sensibilité et spécificité que les marqueurs tumoraux simples [49, 50]. Pour le cancer gastrique, combinant même 2 ou 3 marqueurs tumoraux obtenus précision meilleure diagnostic par rapport à un seul marqueur seul [38, 40].
Protéines empreintes digitales de liquide gastrique chez des patients atteints de cancer gastrique ont montré un total de 106 caractéristiques protéomiques qui étaient en forte hausse - ou régulés à la baisse (fichiers complémentaires 1 et 3). Deux marqueurs importants ont été sélectionnés pour l'identification par MS /MS. Pepsinogène A et peptides d'activation pepsinogène C ont été régulés à la baisse dans les fluides gastriques retirés de l'estomac avec histologiquement confirmé adénocarcinomes. Une étude des sections de cryostat de cancer gastrique a également rapporté une régulation négative significative du pepsinogène C, identifié par SM /SM, dans le tissu tumoral [51].

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