Erottuva mahanestettä proteomiin mahasyövän paljastaa monen biomarkkereiden diagnostinen profiili

Erottuva mahanestettä proteomiin mahasyövän paljastaa monen biomarkkereiden diagnostinen profiili
tiivistelmä
tausta
Kaiken mahasyövän selviytymisen edelleen heikko lähinnä siksi ei ole olemassa luotettavia menetelmiä tunnistaa erittäin parannettavissa alkuvaiheessa tauti. Multi-proteiini profilointi mahanesteille saatu anatominen sivuston patologian, voisi paljastaa diagnostinen proteomic sormenjälkiä. Tool Menetelmät
Protein profiilit kertyi mahanestettä näytteistä 19 mahasyövän ja 36 hyvänlaatuisia gastritides elektiivisen, kliinisesti -indicated gastroskopia käyttämällä pinta-avusteinen laser desorptio /ionisaatio-of-lennon massaspektrometriaa useita ProteinChip paneelit. Proteomic ominaisuuksia verrattiin merkitys analyysi microarray algoritmin ja kaksisuuntainen hierarkkinen klusterointi. Toinen sokaissut vedostulostus (24 syöpien ja 29 kliinisesti hyvänlaatuisia gastritides) käytettiin vahvistettavaksi.
Tulokset
By merkitys analysyis microarray, 60 proteomic ominaisuudet olivat säädelty ja 46 alassäädetty mahasyövän näytteissä (p
< 0,01). Multimarker klustereiden havaittiin kaksi erottuva proteomic profiilit riippumaton iästä ja etnisen. Kahdeksantoista 19 syöpänäytteissä ryhmittyivät yhteen (herkkyys 95%), kun taas 27/36 ulkopuolisten syöpänäytteissä ryhmittyneet toiseen ryhmään. Yhdeksän kuin syöpä näytteet, klusteroituja syöpään näytteet ovat 5 premaligneja leesioita (1 adenomatoottisen polyyppi ja 4 suoliston metaplasiaa). Validation käyttäen toista näyte joukko osoitti herkkyys ja tarkkuus on 88% ja 93%, vastaavasti. Positiivinen ennustearvo yhdistetyn datan oli 0,80. Valitut peptidisekvensoinnilla tunnistettu pepsinogeeni C ja pepsiini aktivointi peptidi merkittävästi alassäädetty ja alfa-defensiini niin merkittävästi säädelty.
Johtopäätös
yksinkertainen ja toistettavissa multimarker proteomic määritys voisi täydentää kliinisiä gastroskopisten arviointi oireenmukaista potilaiden parantamiseksi diagnostinen tarkkuus mahasyövän ja premaligneja vaurioita.
Tausta
Toisin kuin muut yhteiset syöpien ennustetta useimmille mahasyöpäpotilaista on huono ja se on parantunut vain vähän viime vuosikymmenten. Viiden vuoden eloonjäämisluvut mahasyövän ovat huomattavasti alhaisemmat kuin kaikki suuret syövät paitsi syövät maksan, haiman ja ruokatorven [1]. Koska alkuvaiheessa mahasyövän on paljon parempi ennuste (5 vuoden pysyvyys noin 90%) kuin edennyt mahasyöpä (5 vuoden pysyvyys 3-10%) [2, 3], globaali kuolleisuus mahasyöpä pitäisi vähentää oleellisesti toimenpiteitä, jotka johtavat downstaging kasvainten aikaan alustavan diagnoosin.
Vaikka gastroskopia- on kultakantaan mahasyövän diagnosointiin, sen tarkkuus ei ole niin korkea kuin se on hyvänlaatuinen mahalaukun sairauksien kuten mahahaava, etenkin maantieteellisillä alueilla alhaisen tai keskitason mahasyövän esiintyvyys. Prosenttiosuus jäi syövän diagnoosin ilmoitetaan 4,6%, 14% ja jopa 33% [4-6], ei ole merkityksetön. Myös Japanissa, väärä negatiivinen korko ilmoitettiin olevan 19% [7]. Nämä tiedot ovat sopusoinnussa positiivinen ennustearvo vain +0,4-+0,7 Endoskooppisen diagnosointiin mahasyöpä eri keskuksissa [8-10]. Vaikka osuus jäi diagnoosit ilmestyy pieni, absoluuttinen määrä potilaita evätään eduksi diagnoosi klo parannettavissa ei ole vähäpätöinen. Jopa vaatimattomasti alhainen vääriä positiivisia diagnostinen korko 5%, enemmän kuin 47000 mahasyövistä olisi jäänyt yhdessä alhaisen esiintyvyyden maa yksinään (USA) yhden vuoden aikana, 2000 [11]. Endoskooppinen arviointi sisältyy usein limakalvojen koepaloja mutta ei ole kliinisiä standardeja joko optimaalinen määrä koepaloja tai anatomiset alueet, jotka olisi otettava näyte. Yleisesti mainittu suositus on otettava vähintään seitsemän koepaloja oikein diagnosoida mahasyövän [12]. Tässä tutkimuksessa kuitenkin täysin 17% kaikista vaurioiden myöhemmin osoittautuneet pahanlaatuinen katsottiin hyvänlaatuinen päälle tähystykseen. Siten endoskooppinen limakalvon tutkimus kärsii inter-tarkkailija vaihtelua, optimaalinen korrelaatio histopatologia, vaikeuksia havaita limakalvon alaista syöpien ja esteetön visualisointi kaikkien anatomista seutukuntien esim kun edellinen mahalaukun leikkauksen [13, 14].
mahanestettä koostuu seoksesta erittyvän liukeneva ja kuorinnan solun proteiinien koko mahalaukun limakalvon - mukaan lukien alueet, joita ei voida riittävän hyvin arvioida lasikuitukaapeleissa gastroskopia. Siksi perusteltu, että proteomic profiilia mahanesteessä yleensä pidetä jätteenä sivutuotteena gastroskopisten tutkimus, olisi hyödyllistä täydentää kliinisiä arviointi tuottamalla "molekyyli koepala", joka tehokkaasti näytteet koko mahalaukun limakalvon, varsinkin kun proteiini havaitsemiseen tekniikoita, kuten massaspektrometria voi olla erittäin herkkä. Jos suoritettu aikana kliinisesti aiheellista tähystysmenetelmällä saaminen mahanesteen ei lisää invasiivisuus menettelyn. Toisin kuin plasma proteomin, mahalaukun nesteen Proteomi todennäköisesti vähemmän monimutkainen, mutta rikastettu tautikohtaisia ​​biomarkkerit, syntyy suoraan tautipaik-. Sama biomarkkerit, vaikka läsnä plasmassa, voidaan laimentaa rajojen ulkopuolella havaitsemisen ja sekoitetaan muiden runsaammin systeemisiä proteiineja, jotka heijastavat samanaikaisia ​​patofysiologisia (esim samanaikaiset sairaudet), mieluummin kuin anatominen paikkakohtaisia ​​tauti.
Olemme tutkineet uusi lähestymistapa kehittää biomarkkereita mahasyövän profiloidaan liukoisia, eritettyjä peptidejä läsnä endoskooppisesti hengittävillä mahanesteessä ja proteiinit uutetaan kuorinnan epiteelisolujen talteen myös aikana tähystys pinta-avusteinen laser desorptio-ionisaatio-of-lennon (seldi TOF) massaspektrometria. Tuloksemme viittaavat siihen, että useita proteiini biomerkkiaineissa elinspesifisellä lähde eli mahanesteessä, tuottaa erottuva mahasyövän allekirjoitus, joka ansaitsee edelleen kehittäminen välineenä parantaa diagnostista tarkkuutta gastroskopia ja on mahdollisuuksia havaita varhaisessa vaiheessa mahasyövän ja esipahanlaatuisessa vauriot (suoliston metaplasiaa ja dysplasia). Tool menetelmät
Kliiniset näytteet
Mahalaukun nesteitä saatiin aikana gastroskopia- yön yli paastonneilla potilailla nähty Singapore General Hospital. Tutkimuksen protokolla hyväksyi eettinen komitea Singapore General Hospital. ja sopeutui määräyksiä Helsingin julistuksen 1995. indikaatiot gastroskopiaa olivat yksinomaan kliinisiin ja olivat riippumattomia tutkimuksesta. Alustava analyysi suoritettiin koulutus joukko 19 näytteiden histologisesti todistettu mahalaukun adenokarsinooman (13 suolen tyyppiä, 4 hajanainen tyyppi, 1 sekamuotoinen, 1 määrittelemätön) [15] ja 36 näytteitä potilaista, joilla on kliinisesti hyvänlaatuinen mahalaukun olosuhteissa. Keski-ikä 19 mahasyöpäpotilaista (13 uros, 6 naisten, 17 kiinalaista, 2 Intian) oli 68 vuotta. Jakelu American sekakomitean Cancer (AJCC) kliininen lavastus oli vaiheen 0 (1 potilas), vaihe I (4 potilasta), vaihe II (2 potilasta), vaihe III (2 potilasta) ja vaihe IV (10 potilasta). Keskimääräinen ikä 36, joilla on hyvänlaatuinen mahalaukun olosuhteissa (19 uros, 17 naaras, 33 kiinalaista, 2 Malaiji, 1 Intian) oli 57 vuotta. Kliininen diagnoosi jälkeen endoskopia ei-syöpäpotilasta olivat normaalit (9), antraaligastriitin (9), gastriitti (6), haava (4), Palleatyrä (3), hyperplastinen polyypit (2), Barrettin ruokatorvi (1), fundic arpi (1) ja adenomatoottisen polyyppi (1).
luokitus algoritmi kehitetty opetusjoukolla testattiin sokaissut analyysi validointi joukko koostuu toisen 24 histologisesti varmennettu mahalaukun adenokarsinooman (10 suolen tyyppi, 7 hajanainen tyyppi, 1 mixed tyyppi, 5 määrittelemätön, 1 neuroendokrii-) ja 29 kliinisesti hyvänlaatuinen mahalaukun näytteitä. Keskimääräinen ikä näistä 24 mahasyöpäpotilaista (18 urosta, 6 narttua, 21 kiinalaista, 3 Malaiji) oli 70 vuotta. Jakautuminen AJCC kliininen lavastus oli vaiheen I (5 potilasta), vaihe II (4 potilasta), vaihe III (2 potilasta) ja vaihe IV (12 potilasta). Yksi potilas validoinnissa joukko väheni lisätutkimuksia eikä sitä voitu lavastettu. Keski-ikä 29 kuin syöpäpotilailla (11 uros, 18 nainen, 26 kiinalaista, 2 Intian, 1 Malaiji) oli 47 vuotta. Kliininen diagnoosi jälkeen gastroskopia- kuin syöpäpotilailla oli gastriitti (14), fundic rauhanen polyypit (2), akuutti mahahaava (2), duodeniitti (2), Palleatyrä (1) ja normaali (8).
Mikään mahalaukun syöpä potilaat olivat saaneet minkäänlaista syöpähoidon aikaan gastroskopian.
ottaminen koulutus- ja validointi tapauksissa yhdessä, 19% (8/43) ja 29% (19/65) potilaista, joilla mahalaukun syövän ja hyvänlaatuisten maha- olosuhteet, vastaavasti, olivat positiivisia helikobakteeri
, ero, joka ei ollut merkittävä Fisherin eksakti testi (2-puolinen p
arvo = 0,4508).
Näytteen kerääminen ja käsittely
Mahalaukun neste ilmanotto steriiliin astiaan alkamista tähystys, osoitetaan tunnistetiedoista koodin ja laitettiin välittömästi jäihin. Veri- tai sapen-värjätty näytteet hylättiin. Vain kliinisesti epäilyttäviä limakalvomuutoksia otettiin biopsiat harkinnan on endoscopist. Mahanesteissä sentrifugoitiin 180 g: ssä 6 minuutin ajan 4 ° C: ssa, josta supernatantti sentrifugoitiin uudelleen 16 100 g: ssä 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Pelletit molemmista sentrifugointeja yhdistettiin. Nopea supernatantteja varastoitava erillään pellettien -80 ° C: ssa.
Protein profilointi
Sulatuksen jälkeen 10 pl kutakin mahanestettä näyte soveltaa eri kemiallisten pintojen ProteinChip array (Ciphergen Biosystems Inc., California , USA): (a) kupari (II) immobilisoidun Metal Affinity Capture (IMAC3), kun läsnä on 100 ui 1 mol /l ureaa, 1 g /l 3 - [(3-kolamidopropyyli) dimetyyliammonio] -1-propaanisulfonaatti ( CHAPS), 0,3 mol /l KCI: a, proteaasi-inhibiittori cocktail (Roche Diagnostics, Mannheim, Saksa), 50 mol /L Tris-HCl, pH 7,5; (B) Heikko kationinvaihto (WCX2 ja CM10), kun läsnä on 100 ui 50 mmol /l natriumasetaattia, 1 g /l oktyyliglykopryanosiidiä, proteaasiestäjäseostabletit, pH 5; (C) voimakasta anioninvaihtohartsia (SAX2), kun läsnä on 100 ui 50 mmol /L Tris-HCl, 1 g /l CHAPS, proteaasiestäjäseostabletit, pH 8; ja (d) hydrofobisen vuorovaikutuksen (H50), kun läsnä on 100 ui 5 ml /l trifluorietikkahappoa. Pesun jälkeen 100 ui samaa vastaavien puskureita, sinapiinihappoa lisättiin helpottamiseksi desorption ja ionisaatiota. Lastut analysoitiin SELDI-TOF-MS (pBSII, Ciphergen Biosystems Inc.). Syövät ja kontrollit sekoittuneet ja yhtäaikaisesti samalle sirulle ja useita siruja minimoimaan siru-to-chip vaihtelu.
Mahanestettä Pelletit resuspendoitiin 25 ui 6 mol /l guanidiinitiosyanaatti, 5 g /l oktyyli glukopyranosidi, 0,1 mol /l Hepes pH 7, ja 100-200 ui 9 mol /l ureaa, 2 g /l CHAPS, 50 mmol /L Tris-HCl, pH 7,5 vorteksoimalla 45 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Kun oli sentrifugoitu 20 000 g 5 minuuttia, 10 ui uutetta pantiin ProteinChip joukoissa, kuten edellä on kuvattu.
Retentaatti kartta on tuotettu, jossa yksittäiset proteiinit näkyvät erillistä huippua perusteella niiden massan suhde varaukseen . Tiedot proteomic spektrit analysoitiin Ciphergen Express Data Manager Software Pattern Track ja kaksisuuntainen hierarkkinen klusterointialgoritmi. Tasattu huiput signaali-kohina suhteet yli 3 normalisoitiin kaikkien ionien virtaa. Proteomic ominaisuuksia analysoitiin edelleen käyttämällä merkitys analyysi mikrosiruja (SAM) ohjelmisto Stanfordin yliopistosta. Paketti on suunniteltu vastaamaan erityisongelmia microarray data-analyysi (signaalikohinasuhde varianssi eri geenistä toiseen, useita datapistettä pieni määrä näytteitä), mutta löysimme sen olevan sovellettavissa proteomiikka tietojen analysointi samoin. Algoritmi ohjelmisto on kuvattu Tusher et ai
. [16]. Lyhyesti se määritellään muuttuja kutsutaan suhteelliseksi ero mittaamiseksi ero kahden tai useampia datan sijasta p
arvo. Se työllisti muunnelma bootstrapping menetelmän ja toistuvasti jaettu tietyn datajoukon (spektri sisälsi proteomic ominaisuuksia tässä tutkimuksessa) satunnaisesti kahteen ryhmään voidaan laskea suhteellinen ero kunkin permutaatioista. Permutaatioiden lukumäärä oli asetettu 1000 tässä tutkimuksessa ja ohjelmiston lasketaan 1000 suhteellinen ero arvot kullekin Proteomiikan ominaisuus. Suhteellinen ero tiettyyn ryhmään kohteisiin (havaittu suhteellinen ero) verrattiin keskimääräinen suhteellinen ero kaikista permutaatioista (odotettu suhteellinen ero) kunkin ominaisuuden ja ominaisuus arvioitiin olevan ylä- tai alassäädetty mukaan, onko sen havaitun suhteellinen ero oli suurempi tai pienempi kuin sen odotettua suhteellinen ero joidenkin kynnystä. Ohjelmisto arvioitu väärä löytö määrä (myös määritelty viite [16]) kunkin kynnysarvon, joka tarjosi epäsuorasti asettaa sulku. Markkerit tunnistetaan tällä menetelmällä olivat tilastollisesti merkitseviä. Väärä löytö oli asetettu alle 0,05 tässä tutkimuksessa.
Validoimiseksi merkkiaineita tunnistetaan SAM, toinen erä 53 sokaissut näytteet lisättiin tietojen käyttöä varten hierarkkinen klusterointi käyttämällä Ciphergen Express Data Manager -ohjelmisto. Vaikka tunnetut näytteet käyttää SAM valitsemiseksi markkereita odotettiin suoriutuvat hyvin ryhmittely, sokaisi näytteet on testata, kuinka hyvin markkereita yleistää tuntemattomia näytteitä. Tulokset klusterointi yksinkertaisesti verrataan todellinen henkilöllisyys näytteiden ja ei kehittynyt luokitus menetelmää tai muuta ohjelmistoa käytettiin validoinnissa.
Biomarkkereiden tunnistus
mahanestettä proteiinit fraktioitiin anioninvaihtokromatografialla (Q HyperD , Ciphergen Biosystems Inc.) käyttäen vaiheittaista muutokset pH eluointiin. Proteiinit 50 mmol /L Tris-HCl, 1 g /l oktyyliglykopryanosiidiä, pH 8 Eluentit puhdistettiin edelleen kationinvaihto- array (LWCX30) käyttäen 50 mmol /L natriumasetaattia, 1 g /l oktyyliglykopryanosiidiä, pH 5, kuten sitovia ja pesupuskuria. Kun oli lisätty alfa-syano-4-hydroksikanelihappoa energiaa absorboivien molekyylien (Ciphergen Biosystems Inc.), säilytettyjen proteiinit analysoitiin pBSII ja Q-TOF (Waters /Micromass) varustettu ProteinChip Interface (PCI 1000, Ciphergen Biosystems Inc.) . Proteiinit ominaista MS /MS pirstoutuminen ja tunnistus suoritettiin tietokannasta haku Mascot (Matrix Science Ltd., London, UK).
Biomarkkereiden validointi
suoritettiin kolmas sarja mahanesteen otettujen näytteiden hyvänlaatuinen maha- ja mahalaukun syöpäpotilailla. Jokainen juuri otettu näyte käsitelty poistamiseksi kiinteä jäte ja keskittää valkuaispitoisuus seuraavasti. Kun oli lisätty fenyylimetaanisulfonyylifluoridia lopulliseen pitoisuuteen 0,2 mM, näyte sentrifugoitiin 15 minuuttia 500 g ja 4 ° C: ssa. Proteaasi-inhibiittorit (Complete Mini ™, Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA) lisättiin supernatanttiin, jota seuraa keskipakoisvoiman membraanisuodatuksella 2 900 g: n ja 15 ° C (Amicon Ultra-4 keskipako suodatinlaite, 5 000 nimellinen molekyylipainoraja; Millipore, Billerica, MA, USA), kunnes näytteen pienennettiin 10-20% sen alkuperäisestä tilavuudesta. Kokonaisproteiinipitoisuus määritettiin 2-D Quant Kit (Amersham Biosciences, Pisctaway, NJ, USA). Pepsinogeeni C ja alfa-defensiini 1-3 pitoisuudet määritettiin entsyymi-linked immunoassay (ELISA) käyttäen tuotesarjoja Alpco Diagnostics (Salem, NH, USA) ja HyCult biotekniikka B.V. (Uden, Alankomaat), tässä järjestyksessä. Jokainen käsitelty näyte analysoitiin kahtena pepsinogeeni C ja defensiinisekvenssin tasot käyttäen toimittajien protokollia. Näytteet pepsinogeeni C määrityksessä olivat esilaimennettua 120-kertaisesti. Pitoisuudet pepsinogeeni C ja alfa-defensiini 1-3 saatiin viittaamalla niiden standardikäyriin ja ilmaistiin ng (pepsinogeeni C) tai s (defensiinisekvenssin) per mikrogramma kokonais- mahanesteen proteiinia.
Helicobacter pylori
läsnäolo helikobakteeri
vatsassa kudosten tunnistettiin visualisoinnin kierre mikro-organismien histologian kohdissa ja /tai immunohistokemiallisesti. Neljän mikronin kudosleikkeiden poistui-vahattu ksyleenissä ja vähentämällä laatuja etanolia. Antigeeni haku oli kuumentamalla sitraattipuskurissa, pH 6,0. Primaarista vasta-ainetta vastaan, H. pylori
(1:50 laimennos, DAKO A /S, Glostrup, Tanska) seurasi sekundaarinen vasta-aine polymeerin linkki (Envision Chem Mate, DAKO) ja visualisoitiin käyttäen diaminobentsidiiniä kromogeenina.
tulokset
Useita ylös- tai alaspäin säätelemä proteiini biomarkkerit mahasyövän löydettiin mahanesteessä. Edustaja proteomic kartta mahanestettä on esitetty kuvassa 1. Se on geeli näkymä massaspektri osoittaa mahanestettä proteiinit selektiivisesti sitoutuu immobilisoituun kupari (II) metalli-ioni on molekyylipaino alueella 1500 Da 6000 Da. Merkittävät proteiinimarkkereita havaittiin olevan alassäädetty syövän mahanesteessä (p
< 0,01) on osoitettu nuolilla. Kuva 1 Expression ero kartta mahanesteen kuparin (II) immobilisoitua metalli Affiniteettisieppausreaktiot ProteinChip array (IMAC3). Nuolet osoittavat proteiinin biomarkkereita merkittävästi erilainen ilmentyminen tasolla kahden ryhmän välillä näytteiden.
Edustaja proteomic kartta mahanestettä pelletti uute on esitetty kuviossa 2. Proteiinit selektiivisesti sitoutuneen kationinvaihto- array pinta. Merkittävät proteiinimarkkereita todettu ylös- tai alaspäin säädeltyjä mahasyövässä nestettä pelletti (p
< 0,01) on osoitettu nuolilla. Kuvio 2 Expression ero kartta mahanesteen pelletin uutteen kationinvaihto ProteinChip array (WCX2). Nuolet osoittavat proteiinin biomarkkereita merkittävästi erilainen ilmentyminen tasolla kahden ryhmän välillä näytteiden.
Average CV (variaatiokerroin kumulatiivinen 10-15 suurten mahanesteessä huippujen kohti spektrin, n = 8) immobilisoituneita kupari (II) ProteinChip array (IMAC3) oli 12,8%, sillä kationinvaihto array (WCX2) oli 15%, anioninvaihtokromatografian array (SAX2) oli 17,3%, ja hydrofobisen vuorovaikutuksen chip (H50) oli 13,6%. Nämä CV arvot ovat linjassa toistettavuus arvioinnin SELDI kirjallisuudessa [17, 18].
SAM analyysi kaikista proteomic ominaisuuksia (kokonaismäärä ominaisuuksia 41 800, keskimäärin per retentaatin kartta 314) mahanesteessä ja pelletti uutetta , 46 proteomic ominaisuudet havaittiin olevan huomattavasti alassäädetty mahasyövän ja 60 proteomic ominaisuudet olivat huomattavasti säädellään ylöspäin mahasyövän. (Tiedot eri olosuhteissa, esimerkiksi nesteen ja pelletti sekä erilaisia ​​pintoja, yksinkertaisesti yhteen yhdessä eri ominaisuuksia SAM. Markers ilmoittamat SAM sekä pelletti- ja pernatanttifraktioita käsin tunnistettu ja edusti vain kerran luettelossa, kun he olivat katsotaan biologisesti merkittävä). Huomattavasti alassäädetty markkereita mukana 1884, 2428, 2594, 2840, 4050, 11720, 13700 Da; merkitsevästi sääteli markkereita mukana 1761, 1831, 3372, 3443, 3605, 5160, 6780 Da. (Suurin osa merkittävistä markkereita löydetty WCX2 ja IMAC kupari (II), ja sen jälkeen SAX2). Perustuen 106 merkittävästi erilainen proteomic ominaisuuksia (Additional tiedosto 1), kaksisuuntainen hierarkkinen klusterointi analyysi (kaksiulotteinen täydellinen sidos) suoritettiin. Suurin osa mahasyöpä tapaukset ryhmittyneet yhteen muodostaen erottuva ryhmä (kuva 3 ja Additional tiedosto 2). Pääkomponenttianalyysin saman datan paljasti myös, että syöpä ja hyvänlaatuinen näytteet voitiin hyvinkin jaettu kahteen ryhmään, joissa 2 vääriä negatiivisia (eli kaksoismäärittämällä samaa tapausta) ja 9 vääriä positiivisia, vastaavasti (kuva 4). Yksi mahasyövän nestenäytteen (mistä kyse vaiheen I huonosti eriytetty mahalaukun adenokarsinooman) ryhmitelty keskuudessa ei-syöpä näytteitä; kaikki muut 4 varhaisessa vaiheessa (vaiheissa 0 ja I) potilaat oikein ryhmittyneet näytteiden kanssa 14 potilaalla vaiheen II - IV mahasyövän, jolloin yleinen diagnostinen herkkyys 95% (18/19 mahalaukun syöpäpotilaat) koulutusta asetettu. Kuvio 3 Expression ero kartta mahanesteen ja pelletti ote proteiineja opetusjoukolla näytteitä neljään ProteinChip paneelit, näkyy kaksisuuntainen hierarkkinen klusterointi. Merkittävät proteomic ominaisuudet näytetään pystysuunnassa. Intensiteetti harmaasävy ilmaisee asteen suhteellisen proteiinin taso, suurempi tai pienempi kuin mediaani. Potilastapausten esitetään vaakasuunnassa; Useimmissa mahasyöpäpotilaista ovat tiiviisti ryhmitelty yhteen. Tässä kuviossa esitetään yläkvartiili koko kuva (katso Muita tiedosto 2 koko kuva).
Kuva 4 Pääkomponenttianalyysi kuvaaja proteomic ominaisuuksia opetusjoukolla näytteitä. Yksi kone (merkitty mustalla viivalla) jakaa näytteet kahteen ryhmään 1 vääriä negatiivisia (esitetty kahtena täplät) ja 9 vääriä positiivisia.
Yhdeksän 36 syöpäsolujen näytettä harjoitussarjassa ryhmittyneet kanssa syöpänäytteissä (spesifisyys 75%). Näistä 1 oli dysplastic adenomatoottisen polyyppi - precancerous vaurio [19]. Muista 8 potilasta, 6 oli kliinisesti suunnattu koepaloja, joka paljasti suolen metaplasia 4 potilasta (67%). Kahdeksan ei-syöpäpotilaille, joiden mahanestettä proteiiniprofiileja ryhmittyneet normaalissa ryhmässä oli myös kliinisesti ohjannut limakalvojen koepaloja, jotka osoittivat suolen metaplasiaa vain 2 potilaalla (25%). Katsaus 1000 peräkkäisen mahalaukun koepaloja suoritetaan kaikille merkkejä osoitti levinneisyys suoliston metaplasiaa Singaporen General Hospital tutkimuksen aikana 30%. Tämä on ristiriidassa esiintyvyys vähintään 67% suoliston metaplasiaa keskuudessa kliinisesti hyvänlaatuisia tapauksissa jonka proteomic profiileja ryhmittyneet tiiviimmin mahasyövän tapaukset kuin muilla normaalit, sopusoinnussa suoliston metaplasiaa on välitila siirryttäessä normaalin mahalaukun epiteelin mahalaukun adenokarsinoomaa . Tarkka tunnistus suoliston metaplasiaa endoskopialla tiedetään olevan virheellisiä [20]. Siten mahasyöpä-tyyppinen proteomic sormenjälki on mahdollisesti herkkä indikaattori esiintyminen premaligneja vaurio potilailla kliinisesti diagnosoitu hyvänlaatuinen mahalaukun sairaudet.
Mahasyöpäpotilaista koulutukseen asetettu olivat huomattavasti vanhempia (keski-ikä 67,7 v) kuin potilailla, joilla on hyvänlaatuinen mahalaukun olosuhteissa (keski-ikä 56,6) (p
= 0,0062). Käsitellä sitä mahdollisuutta, että proteiiniprofiileja liittyi iän tai etnisen alkuperän, me uudelleen analysoi datan alijoukon kiinalaisten potilaiden yli 55-vuotiaita. Tämä johti 1/17 syövissä luokiteltu väärin (sama kasvain, joka oli luokiteltu väärin, kun kaikki 19 syövistä analysoitiin; herkkyys 94%) ja 4/17 valvonta luokitellut väärin (sama 4 valvontaa, joka olivat 9 luokiteltu väärin hyvänlaatuinen tapauksissa spesifisyys 76,5%) .
seuraavaksi testasimme todellista suorituskykyä proteomic profiilien erottavien syövän hyvänlaatuinen näytteistä toinen sarja 53 sokaissut mahanesteen ja pelletti uute näytteet (24 syöpien ja 29 hyvänlaatuisia mahalaukun sairaudet) (Additional tiedosto 3). Kaksikymmentäyksi 24 mahasyövistä tunnistettiin oikein (herkkyys 88%) ja 2 29 hyvänlaatuisia näytteitä luokiteltu väärin (spesifisyys 93%) (kuva 5). Kuva 5 Expression ero kartta mahanesteen ja pelletti ote proteiineja validointi joukko näytteitä neljään ProteinChip paneelit, näkyy kaksisuuntainen hierarkkinen klusterointi. Merkittävät proteomic ominaisuudet näyttöön vaakatasossa. Intensiteetti punainen tai vihreä väri osoittaa, missä määrin suhteellisen proteiinin taso, suurempi tai pienempi kuin mediaani. Potilastapausten esitetään pystysuunnassa; Useimmissa mahasyöpäpotilaista ovat tiiviisti ryhmitelty yhteen.
Valitut proteomic markkereita (perustuen merkityksestä pisteet määritettiin SAM) olivat puoliksi puhdistettu ProteinChip paneelit ja merkitä suoraan täplät törmäyksen aiheuttama dissosiaation sekvensointi (kuva 6). Useat merkittävästi alassäädetty markkereita syöpäpotilailla on esitetty kuvioissa 1 ja 2, 1881,9 Da, 2041,0 Da, 2188,1 Da ja 2387,3 Da, havaittiin olevan pepsinogeeni C ja pepsiini aktivointi peptidifragmenttien (taulukko 1). Ylös säädelty kolmikon markkereita syöpäpotilaiden kuvissa 2, 7 ja Additional tiedosto 4 tunnistettiin olevan alfa defensiinisekvenssin-1,2,3. Intensiteetti Sirontakuvaajien osoittavat erittäin merkittäviä eroja keskimääräisessä intensiteettien defensiinisekvenssin ja pepsiiniä fragmentti välillä hyvänlaatuinen ohjaus ja mahasyövän nesteen näytettä (p
= 0,003 ja 0.00002, vastaavasti) (kuvio 8). Käyttäen ELISA spesifinen pepsinogeeni C, varmistimme huomattavasti pienempi pitoisuuksina mahasyövän nesteissä (11,9 ± 0,1 ng /ug kokonaisproteiinia; keskiarvo ± sem n = 6.) verrattuna hyvänlaatuinen näytettä (21,5 ± 1,4 ng /ug kokonaisproteiinia. N = 23) kolmannessa näytejoukolla (p
= 0,0126; Opiskelijan parittomia kaksisuuntaisella t
testi). ELISA suoritettiin samasta näytteestä asetettu defensiinisekvenssin tasoilla osoitti korkeampia pitoisuuksia mahasyövän näytteistä (63,4 ± 9,2 pg /ug kokonaisproteiinia; keskiarvo ± sem n = 6) kuin hyvänlaatuinen näytteistä (46,2 pg /ug kokonaisproteiinia; keskiarvo ± sem n = 23) ((p
= 0,0654; Studentin t
testi) .table 1 Peptidisekvenssejä tunnistaa MS //MS
Peptide m /z
Sequence
Protein Match
Mowse † pisteet
Mowse pisteet merkittäviä homologia
2386,29
FLKKHNLNPARKYFPQWKA
Pepsin aktivointi peptidi
35
> 28
2187,12
FLKKHNLNPARKYFPQW
Pepsin aktivointi peptidi
18
> 26
2040,03
LKKHNLNPARKYFPQW
Pepsin aktivointi peptidi
28
> 26
1775,95
FLKKHNLNPARKYF
Pepsin aktivointi peptidi
47
> 26
1628,84
LKKHNLNPARKYF
Pepsin aktivointi peptidi
40
> 28
1880,92
LRTHKYDPAWKYRF
pepsinogeeni C aktivointi peptidi
31
> 22
† Mowse pisteet = -10Log ( P), missä P = todennäköisyys, että ottelu on satunnainen tapahtuma (P
< 0,05) m /z
, massa /varaus
Kuva 6 Korkean erotuskyvyn massaspektri hajanaisten mahanestettä proteiinien LWCX30 ProteinChip array hankitusta QTOF varustettu PCI1000 käyttöliittymä. Laatikoidut piikit alistettiin pirstoutumista analyysi törmäyksen aiheuttama dissosiaation MS /MS: llä.
Kuva 7 Korkean erotuskyvyn massaspektri mahanestettä proteiineja H50 ProteinChip array hankitusta QTOF varustettu PCI1000 käyttöliittymä. Tässä kuviossa esitetään säädelty kolmikon merkkiaineiden mahasyövässä. Katso lisävarotoimenpide tiedosto 4 koko kuvaa.
Kuvioon 8 sirontakaavioissa voimakkuuden arvojen defensiinisekvenssin ja pepsiiniä fragmentti läsnä mahanesteessä näytteitä hyvänlaatuinen ohjaus ja mahasyövän potilaita opetusjoukolla.
Keskustelu
Tuloksemme viittaavat siihen, että spektrin profiilia fraktioimattoman mahanesteen voisi olla hyödyllinen lisä syövän diagnosointiin ja havaitseminen varhaisessa vaiheessa sairauden, kun se yhdistetään kliinisen gastroskopia. Uusimmat pyrkimykset tunnistaa proteiini biomarkkereita mahasyövän ovat tutkineet seerumin [21-29] ja kudosten [24, 30-37], ja ovat yhä käytössä massaspektrometrialla. Vanhemmat raportit serologisissa määrityksissä yksittäisten tunnettujen kasvainmerkkiaineet esim CEA, CA 19-9, CA 72-4, CA242 ja TAG-72, on yleensä alhainen herkkyys (< 50%) [38-41]. Lisäksi on huomattava rajat positiivisuus näiden tuumorimarkkereina kuin syöpien esim nosti CEA ja MG7-Ag tasot ovat yleisiä peräsuolen syöpä, kolangiokarsinooma, haimakarsinooma, ja jopa terveillä verrokeilla [40, 23]. Ei ole yllättävää, kuten seerumin tuumorimerkkiaineiden olla todettua roolia mahasyövässä diagnosointiin ja seulontaan, vaikka ne voivat toimia prognoosi- indikaattoreita ja varhainen merkkiaineiden uusiutuva sairaus seuraavista gastrectomy [39, 41, 42].
Päätimme tutkia proteomic profiileja mahanesteen tautien biomarkkereita, koska se näytti todennäköiseltä, että levoton mahalaukun proteiini eritystä pahanlaatuinen ja premaligneja valtioiden yhdistettynä mahdollisen esiintymisen kuorinnan syöpäsolujen, voisi tuottaa erottuva proteomic profiileja. Kuten etsittäessä seerumin biomarkkerit, useat ryhmät ovat tutkineet diagnostiikka-apuohjelman tunnettujen tuumorimarkkereina mahanesteessä. Kumpikaan CEA eikä CA 19-9 positiivisuuden mahanesteessä on osoittanut diagnostinen tarkkuus [43-46]. Alfa-1 antitrypsiini mahanesteessä on äskettäin raportoitu mahasyövän biomarkkereiden [47, 48].
Lähestymistapamme kehittää herkkä menetelmä mahasyövän diagnoosin erosi aiemmissa tutkimuksissa kolmella tavalla. Ensin päätimme biologisessa näytteessä, joka oli elinspesifiseen (ts endoskooppisesti hengittävillä mahanesteen) kuin systeemisen (eli seerumi), päättely, että molekyyli ominaisuudet olisivat todennäköisesti olemaan tautikohtaisia. Toiseksi, massaspektrometria meille mahdollisuuden ottaa puolueeton löytö perustuva lähestymistapa. Kolmanneksi, meidän tuotetut tiedot profiileja useiden proteomic markkereita, jotka ovat yhä katsoa suurempi herkkyys ja spesifisyys kuin yhden kasvainmerkkiaineet [49, 50]. Mahasyövän, yhdistämällä jopa 2 tai 3 kasvainmerkkiaineet saavutetaan parempi diagnostinen tarkkuus verrattuna yhden markkerin yksin [38, 40].
Protein sormenjäljet ​​mahanesteessä mahasyöpä potilaista havaittiin yhteensä 106 proteomic ominaisuuksia, jotka olivat merkittävästi ylös - tai alassäädetty (Additional tiedostoja 1 ja 3). Kaksi merkittävää markkereita valittiin tunnistamiseksi MS /MS. Pepsinogeeni A ja pepsinogeeni C aktivaation peptidit alassäädetty mahalaukun nesteiden poistaa vatsat kanssa histologisesti vahvistettu adenokarsinooman. Tutkimus kryostaattileikkeiden mahasyövän on myös raportoitu merkittäviä alas-säätely pepsinogeeni C, tunnistetaan MS /MS, kasvainkudoksessa [51].

• Geneettinen suvusta eriytymättömän-tyyppinen mahakarsinoomat analysoitiin ilman valvontaa klusterointi genomista DNA-siru data
• MiR-146a rs2910164 G /C polymorfismin ja mahasyövän alttiutta: meta-analysis