De kenmerkende maagsap proteoom bij maagkanker blijkt dat er een multi-biomarker diagnostische profiel

De kenmerkende maagsap proteoom bij maagkanker blijkt dat er een multi-biomarker diagnostische profiel
Abstracte achtergrond
Overall maag kanker overleven blijft slecht vooral omdat er geen betrouwbare methoden voor het identificeren van zeer te genezen vroeg stadium van de ziekte. Multi-eiwit profilering van maagsappen, verkregen uit de anatomische plaats van pathologie, kunnen diagnostische proteomics vingerafdrukken te onthullen.
Methods
eiwitprofielen werden gegenereerd uit maagsap monsters van 19 maagkanker en 36 goedaardige gastritides patiënten die een electieve, klinisch -indicated gastroscopie met behulp van oppervlakte-versterkte laser desorptie /ionisatie time-of-flight massaspectrometrie op meerdere ProteinChip arrays. Proteomics kenmerken werden vergeleken door betekenis analyse van microarray-algoritme en twee-weg hiërarchische clustering. Een tweede verblind sample set (24 maagkanker en 29 klinisch goedaardige gastritides) werd gebruikt voor de validatie.
Resultaten
Door betekenis analysyis van microarray, 60 proteoom features waren up-gereguleerd en 46 werden down-gereguleerd in maagkanker monsters (p Restaurant < 0,01). Multimarker clustering toonde twee onderscheidende proteomics profielen onafhankelijk van leeftijd en etniciteit. Achttien van de 19 kanker monsters geclusterd (sensitiviteit 95%), terwijl 27/36 van niet-kanker monsters geclusterd in een tweede groep. Negen niet-kanker monsters die geclusterd met samples kanker opgenomen 5 pre-maligne laesies (1 adenomateuze poliep en 4 intestinale metaplasie). Validatie met behulp van een tweede monster set toonde de sensitiviteit en specificiteit 88% en 93%, respectievelijk te zijn. Positieve voorspellende waarde van de gecombineerde gegevens was 0,80. Geselecteerde peptide-sequentiebepaling geïdentificeerd pepsinogen C en pepsine A activering peptide als significant down-gereguleerd en alfa-defensin als significant up-gereguleerd.
Conclusie
Deze eenvoudige en reproduceerbare multimarker proteomics assay kon aanvullen klinische gastroscopisch evaluatie van symptomatische patiënten te verbeteren diagnostische nauwkeurigheid voor maagkanker en pre-maligne laesies. achtergrond
in tegenstelling tot andere veel voorkomende vormen van kanker, de prognose voor de meeste patiënten met maagkanker is slecht en heeft iets meer dan de afgelopen decennia verbeterd. Vijf jaar te overleven tarieven voor maagkanker zijn aanzienlijk lager dan alle belangrijke vormen van kanker met uitzondering van kanker van de lever, alvleesklier en de slokdarm [1]. Gezien het feit dat vroege stadium maagkanker heeft een veel betere prognose (5-jaars overleving ongeveer 90%) dan gevorderde maagkanker (5-jaars overleving 3-10%) [2, 3], de wereldwijde sterfte aan maagkanker moet aanzienlijk afnemen maatregelen die leiden tot downstaging van tumoren bij de eerste diagnose.
Hoewel gastroscopie is de gouden standaard voor diagnose maagkanker, de nauwkeurigheid is niet zo hoog als voor benigne maag- ziekten zoals maagzweren, vooral in geografische regio van lage tot intermediaire maagkanker prevalentie. Het percentage gemiste kankerdiagnose, gerapporteerd als 4,6%, 14% en zelfs 33% [4-6], is niet onbelangrijk. Zelfs in Japan, werd de valse negatieve waarden werden gerapporteerd 19% te zijn [7]. Deze gegevens zijn consistent met de positieve voorspellende waarde van slechts 0,4-0,7 voor endoscopische diagnose van maagkanker in verschillende centra [8-10]. Hoewel het aantal gemiste diagnoses klein lijkt, het absolute aantal patiënten geweigerd behoeve van diagnose in een uithardbare stadium niet verwaarloosbaar. Zelfs bij een bescheiden lage vals-positieve diagnose-tarief van 5%, zou meer dan 47.000 maagkanker zijn gemist in een lage prevalentie land alleen (USA) in een jaar, 2000 [11]. Endoscopische beoordeling omvat vaak mucosale biopsies maar er zijn geen klinische standaarden voor zowel het optimaal aantal biopsieën of anatomische gebieden die moeten worden bemonsterd. Een vaak aangehaald aanbeveling om ten minste zeven biopten naar juiste diagnose van maagkanker [12]. In deze studie echter volledig 17% van alle laesies vervolgens getoond kwaadaardig werden beschouwd goedaardige op endoscopie. Zo endoscopische mucosale onderzoek lijdt aan inter-observer variatie, suboptimale correlatie met histopathologie, moeilijkheden bij het opsporen van kanker submucosale en ongehinderde visualisatie van alle anatomische deelgebieden bijv. . Na eerdere maagchirurgie [13, 14]
maagsap bestaat uit een mengsel van uitgescheiden oplosbaar en afgebladderd cellulaire eiwitten van het gehele maagslijmvlies - inclusief gebieden die niet voldoende kan worden beoordeeld door fiberoptische gastroscopie. Wij zijn dan ook gemotiveerd dat de proteomics profiel van maagsap, meestal beschouwd als een verspilling bijproduct tijdens gastroscopisch onderzoek, kan een nuttige aanvulling conventionele klinische evaluatie door middel van een 'moleculaire biopsie' die effectief monsters de hele maagslijmvlies, vooral omdat eiwit detectietechnieken zoals massaspectrometrie kan zeer gevoelig zijn. Indien uitgevoerd tijdens klinisch aangewezen gastroscopie verkrijgen maagsap niet het invasieve karakter van de procedure te verhogen. In tegenstelling tot de plasma proteoom, het maagsap proteoom zal waarschijnlijk minder complex maar verrijkt in ziekte-specifieke biomarkers, rechtstreeks gegenereerd op de ziekteplaats worden. Dezelfde biomarkers, ook indien aanwezig in plasma, kan worden verdund na de detectiegrenzen en gemengd met andere overvloediger systemische eiwitten die gelijktijdige pathofysiologische weerspiegelen (bijv comorbide ziekten), in plaats van anatomische plaats-specifieke ziekte.
we hebben een nieuwe aanpak voor de ontwikkeling biomarkers maagkanker onderzocht door profilering oplosbare uitgescheiden peptiden aanwezig in endoscopisch afgezogen maagsap en eiwitten geëxtraheerd uit afgeschilferde epitheelcellen, ook tijdens endoscopie teruggewonnen door oppervlakte-versterkte laser-desorptie-ionisatie time-of-flight (SELDI TOF) massaspectrometrie. Onze resultaten suggereren dat meerdere eiwit biomarkers van een orgaan-specifieke source dwz maagsap, het genereren van een kenmerkende maag handtekening kanker die verdient verdere ontwikkeling als een instrument voor het verbeteren van de diagnostische nauwkeurigheid van gastroscopie en heeft potentieel voor het opsporen vroeg stadium maagkanker en pre-maligne laesies (intestinale metaplasie en dysplasie).
Methods
klinische monsters
maagsappen werden verkregen tijdens gastroscopie overnachtende nuchtere patiënten gezien op de Singapore General Hospital. De studie protocol werd goedgekeurd door de ethische commissie van de Singapore General Hospital. en in overeenstemming met de bepalingen van de Verklaring van Helsinki 1995. Indicaties voor gastroscopie waren uitsluitend klinische en waren onafhankelijk van de studie. Eerste analyse werd uitgevoerd op een trainingsset van 19 monsters van histologisch bewezen gastrische adenocarcinomen (13 intestinale type 4 diffuse type 1 gemengd type 1 onbepaald) [15] en 36 monsters van patiënten met klinisch goedaardige maagaandoeningen. De gemiddelde leeftijd van 19 maagkanker patiënten (13 mannen, 6 vrouwen, 17 Chinese, Indiase 2) was 68 jaar. Verdeling door de Amerikaanse Joint Committee on Cancer (AJCC) klinische stadiëring was fase 0 (1 patiënt), fase I (4 patiënten), fase II (2 patiënten), fase III (2 patiënten) en stadium IV (10 patiënten). De gemiddelde leeftijd van 36 patiënten met een goedaardige maag omstandigheden (19 mannen, 17 vrouwen, 33 Chinese, 2 Maleis, 1 Indiase) was 57 jaar. Klinische diagnoses na endoscopie niet-kankerpatiënten normaal waren (9), antrale gastritis (9), gastritis (6), zweren (4), hiatus hernia (3), hyperplastische poliepen (2), Barrett's slokdarm (1), fundus litteken (1) en adenomateuze poliepen (1). Ondernemingen de classificatie-algoritme ontwikkeld op basis van de training set werd getest door verblind analyse van een validatie set bestaande uit een andere 24 histologisch bevestigde maag adenocarcinomen (10 intestinale type 7 soort diffuse, 1 gemengde type 5 onbepaald, 1 neuro-endocriene) en 29 klinisch benigne ulcus monsters. De gemiddelde leeftijd van deze 24 maagkanker patiënten (18 mannen, 6 vrouwen, 21 Chinees, Maleis 3) was 70 jaar. Verdeling AJCC klinische stadiëring was stadium I (5 patiënten), fase II (4 patiënten), fase III (2 patiënten) en stadium IV (12 patiënten). Eén patiënt in de validatie set daalde verder onderzoek en kon niet worden opgevoerd. De gemiddelde leeftijd van 29 niet-kanker patiënten (11 mannen, 18 vrouwen, 26 Chinese, 2 Indiaas, 1 Maleische) was 47 jaar. Klinische diagnoses na gastroscopie niet-kankerpatiënten waren gastritis (14), fundic gland poliepen (2), acute maagzweer (2), duodenitis (2), hiatus hernia (1) en normaal (8). Geen van
de maagkanker patiënten hadden enige vorm van behandeling van kanker bij de gastroscopie ontvangen.
nemen training en validatie gevallen samen, 19% (8/43) en 29% (19/65) van de patiënten met maagkanker en benigne maag- voorwaarden, respectievelijk, waren positief voor H. pylori
, een verschil dat door Fisher's exact test (2-zijdige p
value = 0,4508) niet significant was.
Sample inzameling en verwerking
maagsap werd opgezogen in een steriele container bij aanvang van endoscopie, toegewezen een geanonimiseerde code en onmiddellijk op ijs geplaatst. Bloed- of-gal gekleurde monsters werden afgewezen. Enige klinisch verdachte mucosale laesies biopsie ter beoordeling van de endoscopist. Maagsappen werden gecentrifugeerd bij 180 g gedurende 6 minuten bij 4 ° C, waarna de supernatant werd opnieuw gecentrifugeerd bij 16 100 g gedurende 30 minuten bij 4 ° C. Pellets uit beide centrifugeringen werden gecombineerd. De high-speed supernatanten werden gescheiden van de korrels bewaard bij -80 ° C.
Proteïneprofilering
Na ontdooien werd 10 gl van elk monster maagvloeistof toegepast op verschillende chemische oppervlakken van ProteinChip arrays (Ciphergen Biosystems Inc., Californië , USA): (a) koper (II) geïmmobiliseerd metaal affiniteitsinvangmiddel (IMAC3) in aanwezigheid van 100 pl 1 mol /l ureum, 1 g /l 3 - [(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propaansulfonaat ( CHAPS), 0,3 mol /l KCl, proteaseremmer cocktail (Roche Diagnostics, Mannheim, Duitsland), 50 mol /L Tris-HCl, pH 7,5; (B) Zwakke kationenuitwisselingsvermogen (WCX2 en CM10) in aanwezigheid van 100 ul van 50 mmol /l natriumacetaat, 1 g /l octyl- glucopyranoside, cocktail van proteaseremmers, pH 5; (C) Strong Anion Exchange (SAX2) in aanwezigheid van 100 ul van 50 mmol /L Tris-HCl, 1 g /l CHAPS, cocktail van proteaseremmers, pH 8; en (d) Hydrofobe Interactie (H50) in aanwezigheid van 100 ul van 5 ml /l trifluorazijnzuur. Na wassen met 100 ul van dezelfde respectieve buffers werd sinapinezuur toegevoegd desorptie en ionisatie vergemakkelijken. De chips werden geanalyseerd door SELDI-TOF-MS (pBSII, Ciphergen Biosystems Inc). Kanker en controles werden vermengd en samenvallen op dezelfde chip en meerdere chips chip-to-chip variatie te minimaliseren. Ondernemingen De maagsap pellets werden geresuspendeerd in 25 gl 6 mol /l guanidine thiocyanaat, 5 g /l octyl glucopyranoside, 0,1 mol /l Hepes pH 7 en 100-200 pl 9 mol /l ureum, 2 g /l CHAPS, 50 mmol /L Tris-HCl, pH 7,5 door vortexen gedurende 45 minuten bij 4 ° C. Na centrifugatie bij 20 000 g gedurende 5 minuten, werd 10 ul van het extract aangebracht op ProteinChip arrays zoals hierboven beschreven.
Een retentaat kaart gegenereerd waarin afzonderlijke eiwitten werden als afzonderlijke pieken op basis van hun massa verhouding laden . Gegevens van het proteomics spectra werden geanalyseerd door Ciphergen Express Data Manager Software met Pattern Track en twee-weg hiërarchische clustering algoritme. Uitgelijnd pieken met de signaal-ruis verhouding hoger dan 3 werden genormaliseerd door de totale ion stroom. Proteomics kenmerken werden verder geanalyseerd met behulp van de betekenis analyse van microarrays (SAM) software van Stanford University. De verpakking is ontworpen om problemen in microarray data analyse (signaal-ruisverhouding variantie verschillend van gen tot gen groot aantal datapunten van een klein aantal monsters) aanpakken maar we vonden het ook gelden voor proteooomdata analyse. Het algoritme van de software werd beschreven door Tusher et al
. [16]. In het kort is gedefinieerd een statistiek genaamd het relatieve verschil meten van het verschil tussen twee of meer groepen gegevens in plaats van het p
waarde. Het gebruik van een variant van de werkwijze bootstrapping en herhaaldelijk verdeeld een bepaalde gegevensset (spectra die het proteomische functies in deze studie) willekeurig in twee groepen om het relatieve verschil voor elk van de permutaties berekenen. Het aantal permutaties werd ingesteld op 1000 in deze studie en de software berekende relatieve 1000 verschilwaarden voor elke proteomische functie. Het relatieve verschil van de bepaalde categorie plaats (waargenomen relatieve verschil) vergeleken met de gemiddelde relatieve verschil van alle permutaties (verwachte relatieve verschil) van elke functie en de functie werd beoordeeld op- of neerwaarts gereguleerd naargelang zijn de waargenomen relatieve verschil groter of kleiner dan de verwachte relatieve verschil door een drempel. De software naar schatting een valse ontdekking rate (ook gedefinieerd in referentie [16]) voor elke drempelwaarde die een indirecte manier om de cutoff stellen verstrekt. De merkers die door deze werkwijze waren statistisch significant. De valse ontdekking werd ingesteld op minder dan 0,05 in deze studie zijn. Belgique Om de markeringen die door SAM valideren, een tweede partij van 53 blinde monsters werden toegevoegd aan de dataset voor hiërarchische clustering met het Ciphergen Express Data Manager. Hoewel de bekende monsters gebruikt door SAM om de markers te selecteren werden verwacht om goed te presteren in de clustering, werden de blinde monsters opgenomen om te testen hoe goed de markers te generaliseren naar onbekende monsters. De resultaten van de clusters werden eenvoudig vergeleken met de ware identiteit van de monsters en geen geavanceerde indeling Werkwijze of andere software werd gebruikt bij de validatie.
Biomarker identificatie
maagsap eiwitten werden gefractioneerd door anion uitwisselingschromatografie (Q HyperD , Ciphergen Biosystems Inc.), middels stapsgewijze veranderingen in pH voor elutie. Eiwitten in 50 mmol /L Tris-HCl, 1 g /l octyl- glucopyranoside, werden pH 8 elutiemiddelen verder gezuiverd op een kationenuitwisseling array (LWCX30) middels 50 mmol /l natriumacetaat, 1 g /l octyl- glucopyranoside, pH 5 als bindend en wasbuffer. Na toevoeging van a-cyano-4-hydroxykaneelzuur energie absorberende moleculen (Ciphergen Biosystems Inc.) werden de vastgehouden eiwitten geanalyseerd door pBSII en Q-TOF (Waters /Micromass) met een ProteinChip interface (PCI 1000, Ciphergen Biosystems Inc) . Eiwitten werden gekenmerkt door MS /MS fragmentatie en de identificatie werd uitgevoerd door de database zoeken met Mascot (Matrix Science Ltd., Londen, UK).
Biomarker validatie Inloggen Deze werd uitgevoerd in een derde set van maagsap monsters genomen van goedaardige maag- en maagkanker patiënten. Elk vers verzamelde monster werd verwerkt om vaste verontreinigingen te verwijderen en om het eiwitgehalte te concentreren als volgt. Na toevoeging fenylmethaansulfonylfluoride tot een eindconcentratie van 0,2 mM, werd het monster 15 minuten gecentrifugeerd bij 500 g en 4 ° C. Proteaseremmers (Complete Mini ™, Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA) werden aan het supernatant toegevoegd, gevolgd door centrifugale membraanfiltratie bij 2 900 g en 15 ° C (Amicon Ultra-4 centrifugaal filterinrichting, 5 000 nominaal molecuulgewicht grens; Millipore, Billerica, MA, USA) tot het monster werd verlaagd tot 10-20% van het oorspronkelijke volume. Totale eiwitconcentratie werd bepaald door 2-D Quant Kit (Amersham Biosciences, Pisctaway, NJ, USA). Pepsinogeen C en alfa-defensin 1-3 werden bepaald door enzymgekoppelde immunoassay (ELISA) onder gebruikmaking van kits van Alpco Diagnostics (Salem, NH, USA) en Hycult biotechnologie B.V. (Uden, Nederland), respectievelijk. Elke verwerkte monster werd in tweevoud onderzocht voor pepsinogen C en defensin niveaus met behulp van protocollen van de leveranciers. Monsters voor pepsinogeen C assay werden pre-verdund 120-voudig. Concentraties van pepsinogeen C en alfa-defensin 1-3 werden afgeleid op basis van hun respectieve standaardcurves en uitgedrukt als ng (pepsinogeen C) of p (defensin) per microgram totaal eiwit maagsap.
Helicobacter pylori
aanwezigheid van H. pylori in de maag
weefsels werd geïdentificeerd door visualisatie van spiraalvormige microorganismen histologisch secties en /of immunohistochemie. Vier-micron weefsel secties werden de-gewaxt in xyleen en het verminderen van kwaliteiten van ethanol. Antigeenterugtrekking werd door verhitting in citraatbuffer, pH 6,0. Het primaire antilichaam tegen H. pylori
(1:50 verdunning; DAKO A /S, Glostrup, Denemarken) werd gevolgd door het secundaire antilichaam polymere verbinding (Envision Chem Mate, DAKO) en gevisualiseerd met behulp diaminobenzidine als chromogeen
. resultaten
Meerdere up- of down-gereguleerd eiwit biomarkers bij maagkanker werden ontdekt in maagsap. Een vertegenwoordiger proteomics kaart van maagsap wordt getoond in figuur 1. Het is een gel van een massaspectrum toont maagsap eiwitten selectief gebonden aan geïmmobiliseerd koper (II) metaalion in het molecuulgewichtstraject van 1500 Da tot 6000 Da. Significante eiwitmerkers bevonden neerwaarts gereguleerd bij kanker maagsap (p
< 0,01) zijn aangegeven met pijlen. Figuur 1 Expressie verschil kaart van maagsap op koper (II) geïmmobiliseerde metaal affiniteit capture ProteinChip array (IMAC3). Pijlen geven eiwitbiomarkers significant verschillend expressieniveau tussen de twee groepen van monsters.
Een vertegenwoordiger proteomische kaart van maagsap pellet extract wordt getoond in Figuur 2. De eiwitten werden selectief gebonden aan een kationenuitwisseling matrix oppervlak. Aanzienlijke eiwit markers gevonden om op- of neerwaarts gereguleerd bij maagkanker vloeistof pellet (p Restaurant < 0,01) zijn aangegeven met pijlen. Figuur 2 Expressie verschil kaart van maagsap pellet extract op kationuitwisseling ProteinChip array (WCX2). Pijlen geven eiwitbiomarkers significant verschillend expressieniveau tussen de twee groepen monsters
gemiddelde CV. (Variatiecoëfficiënt, cumulatieve 10-15 grote maagsap pieken per spectrum, n = 8) voor geïmmobiliseerde koper (II) ProteinChip matrix (IMAC3) was 12,8%, voor kationenuitwisseling array (WCX2) werd 15%, voor anionenuitwisseling array (SAX2) was 17,3%, en voor hydrofobe interactie chip (H50) was 13,6%. Deze CV waarden zijn in lijn met de reproduceerbaarheid beoordeling in de SELDI literatuur [17, 18].
Door Sam analyse van alle proteomics functies (totaal aantal functies 41 800, gemiddeld aantal per retentaat kaart 314) in maagsap en pellet extract , 46 proteomische functies bleken significant neerwaarts gereguleerd bij maagkanker en 60 proteomische functies aanzienlijk opgereguleerd bij maagkanker. (Gegevens van verschillende omstandigheden, bijvoorbeeld vloeistof en pellet evenals verschillende oppervlakken werden eenvoudigweg tegen elkaar samengevoegd als afzonderlijke functies voor SAM. Markers SAM gerapporteerd in zowel pellet en supernatans fracties werden handmatig geïdentificeerd en vertegenwoordigde slechts eenmaal in de lijst nadat zij geacht biologisch significant). Aanzienlijk down-gereguleerd markers opgenomen 1884, 2428, 2594, 2840, 4050, 11.720, 13.700 Da; significant up-gereguleerd markers opgenomen 1761, 1831, 3372, 3443, 3605, 5160, 6780 Da. (De meeste belangrijke merkers werden ontdekt op WCX2 en IMAC koper (II), gevolgd door SAX2). Op basis van de 106 significant verschillend proteomics functies (Extra-bestand 1), werd in twee richtingen hiërarchische clustering analyse (twee-dimensionale volledige koppeling) uitgevoerd. Het merendeel van de maagkanker gevallen werden geclusterd om een ​​onderscheidend groep (figuur 3 en Aanvullende bestandsinformatie 2) te vormen. Hoofdcomponent analyse van dezelfde gegevens bleek ook dat kanker en goedaardige monsters ook kunnen worden verdeeld in twee groepen, met 2 vals negatieve (die duplobepaling van dezelfde zaak) en 9 valse positieven, respectievelijk (figuur 4). Een maagkanker vloeistofmonster (van een geval van fase I slecht gedifferentieerd adenocarcinoom van de maag) geclusterd onder de monsters niet-kanker; alle andere 4 vroege fase (fase 0 en I) patiënten correct geclusterd met monsters van 14 patiënten met stadium II - IV maagkanker, het geven van een algemene diagnostische gevoeligheid van 95% (18/19 patiënten met maagkanker) op de training set. Figuur 3 Expressie verschil kaart van maagsap en pellet extract eiwitten van de training set monsters op vier ProteinChip arrays, weergegeven in twee richtingen hiërarchische clustering. Aanzienlijke proteomics functies worden verticaal weergegeven. De intensiteit van de grijsschaal geeft de mate van relatieve eiwitniveau, hoger of lager dan de mediaan. Patiënt gevallen worden horizontaal gepresenteerd; de meeste maagkanker patiënten worden dicht op elkaar geclusterd. Deze figuur toont het bovenste kwartiel van de volledige afbeelding (zie Extra file 2 voor de volledige afbeelding).
Figuur 4 Principal component analyse plot van proteomics kenmerken van de training set monsters. Een enkel vlak (aangeduid door de zwarte lijn) verdeelt de monsters in twee groepen met 1 fout-negatieve (getoond in tweevoud plekken) en 9 false positives.
Negen van 36 niet-kanker monsters in de training set gebundeld met de kanker monsters (specificiteit 75%). Hiervan 1 had een dysplastische adenomateuze poliep - een prekankerlaesie [19]. Onder de andere 8 patiënten hadden klinisch georiënteerde 6 biopsieën die intestinale metaplasie geopenbaard 4 patiënten (67%). Acht niet-kankerpatiënten die maagsap eiwitprofielen geclusterd in de normale groep was ook klinisch georiënteerde mucosale biopsies die intestinale metaplasie toonde slechts 2 patiënten (25%). Een overzicht van 1000 opeenvolgende maag biopsieën uitgevoerd voor alle indicaties toonde een totale prevalentie van intestinale metaplasie in de Singapore General Hospital tijdens de onderzoeksperiode van 30%. Dit in tegenstelling tot de prevalentie van ten minste 67% van intestinale metaplasie bij klinisch goedaardige gevallen waarvan de proteomische profielen nauwer geclusterd met maagkanker gevallen dan bij andere normals, in overeenstemming met intestinale metaplasie die een tussenstadium in de overgang van normale gastrische epitheel maagdarmkanker . Nauwkeurige identificatie van intestinale metaplasie door endoscopie bekend onnauwkeurige [20] is. Dus een maagkanker type fingerprint proteoom mogelijk een gevoelige indicator voor de aanwezigheid van deze premaligne laesie bij patiënten klinisch gediagnosticeerd als goedaardige maagaandoeningen.
Maagkanker patiënten in de trainingsprofilen waren beduidend ouder (gemiddelde leeftijd 67,7 jaar) dan patiënten met goedaardige maag voorwaarden (gemiddelde leeftijd 56,6) (p
= 0,0062). Om de mogelijkheid dat eiwitprofielen werden gerelateerd aan de leeftijd of etniciteit te pakken, we opnieuw geanalyseerde gegevens van de subset van de Chinese patiënten ouder dan 55 jaar. Dit resulteerde in 1/17 kanker onrechte (dezelfde tumor die werd onrechte wanneer alle 19 vormen van kanker werden geanalyseerd; sensitiviteit 94%) en 17/04 controles onrechte (dezelfde 4 controles die onder de 9 onrechte goedaardige gevallen waren; specificiteit 76,5%) .
We testen vervolgens de werkelijke prestaties van proteomische profielen onderscheiden kanker en goedaardige monsters in een tweede serie van 53 blinde maagsap en pellet extract monsters (24 en 29 maagkanker goedaardige maagaandoeningen) (aanvullende bestandsinformatie 3). Eenentwintig van 24 maagkanker werden correct geïdentificeerd (sensitiviteit 88%) en 2 van 29 benigne monsters werden onjuist geclassificeerd (specificiteit 93%) (Figuur 5). Figuur 5 Expressie verschil kaart van maagsap en pellet extract eiwitten van de validatie set monsters op vier ProteinChip arrays, weergegeven in twee richtingen hiërarchische clustering. Aanzienlijke proteomics functies worden horizontaal weergegeven. De intensiteit van de rode of groene kleur geeft de mate van relatieve eiwitniveau, hoger of lager dan de mediaan. Patiënt gevallen zijn verticaal gepresenteerd; meest maagkankerpatiënten zijn nauw geclusterd.
Geselecteerde proteomische markers (gebaseerd op significantie score bepaald door SAM) werden semi-gezuiverd op ProteinChip arrays en direct op plaatsen die door botsing geïnduceerde dissociatie sequentie (figuur 6). Verscheidene significant neerwaarts gereguleerd markers in kankerpatiënten getoond in figuren 1 en 2, 1881,9 Da, 2041,0 Da, 2188,1 Da en 2387,3 Da, werden geïdentificeerd pepsinogeen C en pepsine A activatie peptidefragmenten (tabel 1). De opwaarts gereguleerd triplet markers in kankerpatiënten getoond in figuren 2, 7 en aanvullende bestandsinformatie 4 werden geïdentificeerd alfa defensine-1,2,3 zijn. Intensiteit spreidingsdiagrammen vertonen een zeer significante verschillen in de gemiddelde intensiteiten van defensine en pepsine fragment tussen goedaardige controle en maagkanker vloeistofmonsters (p
= 0,003 en 0,00002 respectievelijk) (Figuur 8). Gebruikmaking van ELISA specifiek voor pepsinogeen C bevestigden we significant lagere concentraties bij maagkanker vloeistoffen (11,9 ± 0,1 ng /ug totaal eiwit; gemiddelde ± sem n = 6) in vergelijking met goedaardige monsters (21,5 ± 1,4 ng /ug totaal eiwit = n. 23) in een derde sample set (p = 0,0126
; Student's ongepaarde tweezijdige t
test). ELISA uitgevoerd op dezelfde sample set voor defensin niveaus werden hogere concentraties in maagkanker monsters (63,4 ± 9,2 pg /ug totaal eiwit; gemiddelde ± sem n = 6) dan bij goedaardige monsters (46,2 pg /ug totaal eiwit; gemiddelde ± sem n = 23) ((p = 0,0654
; Student's t Electronics Test) .table 1 Peptide sequenties geïdentificeerd door MS //MS
Peptide m /z
Sequence
Protein Match
Mowse † scoren
Mowse scoren met significante homologie
2.386,29
FLKKHNLNPARKYFPQWKA
Pepsine A activering peptide
35 Restaurant > 28
2.187,12
FLKKHNLNPARKYFPQW
Pepsin Een activering peptide
18 Restaurant > 26
2.040,03
LKKHNLNPARKYFPQW
Pepsine A activering peptide
28 Restaurant > 26
1.775,95
FLKKHNLNPARKYF
Pepsin Een activering peptide
47 Restaurant > 26
1.628,84
LKKHNLNPARKYF
Pepsine A activering peptide
40 Restaurant > 28
1.880,92
LRTHKYDPAWKYRF
Pepsinogen C activering peptide
31 Restaurant > 22
† Mowse score = -10Log ( P), waarbij P = kans dat de wedstrijd is een toevallige gebeurtenis (P Restaurant < 0,05) m /z
, massa /lading
Figuur 6 Hoge-resolutie massaspectrum van maagsap gefractioneerde eiwitten op LWCX30 ProteinChip matrix verkregen met een QTOF met een PCI1000 interface. Boxed pieken werden onderworpen aan fragmentatie analyse door botsing geïnduceerde dissociatie MS /MS.
Figuur 7 hoge-resolutie massaspectrum van maagsap eiwitten op H50 ProteinChip matrix verkregen op een QTOF uitgerust met een PCI1000 interface. Deze figuur toont de up-gereguleerd triplet markers bij maagkanker. Lees ook de aanvullende bestand 4 voor de volledige afbeelding.
Figuur 8 Scatter plots van de intensiteit waarden van defensine en pepsine fragment aanwezig in maagsap monsters van goedaardige controle en maagkanker patiënten uit de training set.
Discussie
Onze gegevens suggereren dat het spectrale profiel van de gefractioneerde maagvloeistof een nuttige aanvulling voor kankerdiagnose en detectie van beginnende ziekte kan zijn, in combinatie met klinische gastroscopie. Meest recente pogingen tot het identificeren van eiwit biomarkers voor maagkanker hebben onderzocht serum [21-29] en weefsels [24, 30-37], en hebben steeds meer gebruikt massaspectrometrie. Oudere meldingen van serologische testen van individuele bekende tumormarkers bijv. CEA, CA 19-9, CA 72-4, CA242 en TAG-72, hebben over het algemeen een lage gevoeligheid (< 50%) [38-41]. Bovendien is er aanzienlijke cross-positiviteit van deze tumormarkers in niet-maagkanker b.v. verhoogde CEA en MG7-Ag levels zijn gebruikelijk in colorectale kanker, cholangiocarcinoom, pancreascarcinoom, en zelfs bij gezonde controles [40, 23]. Vanzelfsprekend, zoals serum tumormarkers geen gevestigde rol bij maagkanker diagnose en screening, hoewel ze als prognostische indicatoren en vroege markers van recidief na gastrectomie [39, 41, 42] kunnen dienen.
We kozen voor proteomische profielen te onderzoeken van maagsap ziekte van biomarkers omdat het leek waarschijnlijk dat de maag eiwitsecretie verstoord bij maligne en premaligne toestanden, samen met de mogelijke aanwezigheid geëxpandeerd kankercellen, onderscheidend proteomische profielen kunnen genereren. Zoals in de zoektocht naar serumbiomarkers hebben verschillende groepen de diagnostische bruikbaarheid van bekende tumor markers in maagsap onderzocht. Noch CEA noch CA 19-9 positiviteit in maagsap heeft diagnostische nauwkeurigheid [43-46] aangetoond. Alfa-1 antitrypsine in maagsap Nieuwe publicaties als maagkanker biomarker [47, 48].
Onze benadering van het ontwikkelen van een gevoelige werkwijze voor maagkanker diagnose verschilde van eerdere studies op drie manieren. Ten eerste, kozen we voor een biologisch monster dat orgaan-specifieke (dat wil zeggen endoscopisch opgezogen maagsap) in plaats van systemische (dat wil zeggen serum), redeneren dat de moleculaire eigenschappen meer kans zou zijn ziekte-specifieke was. Ten tweede, massaspectrometrie ons in staat om een ​​onbevooroordeelde-ontdekking gebaseerde aanpak. Ten derde, onze data gegenereerd profielen van meerdere proteomics markers die in toenemende mate als met een hogere gevoeligheid en specificiteit dan alleenstaande tumormarkers [49, 50] worden beschouwd. Voor maagkanker, een combinatie van zelfs 2 of 3 tumormarkers bereikt betere diagnostische nauwkeurigheid in vergelijking met een enkele marker alleen [38, 40].
Eiwit vingerafdrukken van maagsap van maagkanker patiënten vertoonden een totaal van 106 proteomics functies die aanzienlijk omhoog waren - of neerwaarts gereguleerd (Extra bestanden 1 en 3). Twee prominente markers werden geselecteerd voor identificatie door MS /MS. Pepsinogeen A en pepsinogen C activering peptiden werden down-gereguleerd in maagsappen uit magen met histologisch bevestigde adenocarcinomen. Een studie van cryostaatsecties van maagkanker is ook gemeld aanzienlijke neerwaartse regulatie van pepsinogeen C, die door MS /MS in tumorweefsel [51].

• Genetische lineages van ongedifferentieerde-type maagcarcinomen door onbewaakte clustering van genoom DNA microarray geanalyseerd data
• MiR-146a rs2910164 G /C polymorfisme en maagkanker gevoeligheid: een meta-analysis