O proteoma fluido gástrico distintivo no cancro gástrico revela um perfil de diagnóstico multi-biomarcador

O proteoma fluido gástrico distintivo em câncer gástrico revela um perfil de diagnóstico multi-biomarcador da arte abstracta
Fundo
de sobrevivência de câncer gástrico geral continua pobre, principalmente porque não existem métodos confiáveis ​​para identificar a doença altamente curável fase inicial. profiling Multi-proteína de fluidos gástricos, obtido a partir da localização anatômica da patologia, poderia revelar impressões digitais proteômicas de diagnóstico.
Métodos
perfis de proteína foram gerados a partir de amostras de fluido gástrico de 19 cancro gástrico e 36 pacientes gastrites benignos submetidos de forma eletiva, clinicamente gastroscopia -indicated usando dessorção /ionização espectrometria de superfície melhorada, a laser time-of-flight em massa em várias matrizes ProteinChip. características proteômicas foram comparadas por análise de significância de algoritmo de microarray e duas vias de agrupamento hierárquico. Um segundo conjunto de amostras cego (24 cânceres gástricos e 29 gastrites clinicamente benignos) foi utilizado para validação
. Resultados
por significado analysyis de microarray, 60 características proteômicas foram up-regulada e 46 foram regulados negativamente em amostras de câncer gástrico (p
< 0,01). MultiMarker agrupamento mostrou dois perfis distintos de proteômica, independentemente da idade e etnia. Dezoito das 19 amostras de câncer agrupadas (sensibilidade de 95%), enquanto 27/36 de amostras não-cancerosas agrupadas em um segundo grupo. Nove amostras não-cancerosas que agruparam com amostras de câncer incluídos lesões 5 pré-malignas (1 pólipos adenomatosos e 4 de metaplasia intestinal). Validação usando um segundo conjunto de amostras mostrou a sensibilidade e a especificidade de ser 88% e 93%, respectivamente. O valor preditivo positivo dos dados combinados foi de 0,80. sequenciação de péptidos selecionados identificados pepsinogen C e pepsina Um peptídeo de ativação como significativamente regulada para baixo e alfa-defensinas como significativamente sobre-regulada.
Conclusão
Este ensaio proteômica MultiMarker simples e reprodutível poderia complementar a avaliação gastroscópico clínico de pacientes sintomáticos para melhorar a precisão do diagnóstico de câncer gástrico e lesões pré-malignas.
Fundo
ao contrário de outros tipos de câncer, o prognóstico para pacientes com câncer gástrico mais é pobre e tem melhorado pouco ao longo dos últimos várias décadas. as taxas de sobrevivência de cinco anos para o câncer gástrico são consideravelmente mais baixos do que todos os principais tipos de câncer, exceto os cancros do fígado, pâncreas e esôfago [1]. Dado que o cancro fase inicial gástrica tem um prognóstico muito melhor (sobrevivência de 5 anos cerca de 90%) do que avançado câncer gástrico (5 anos de sobrevida 3-10%) [2, 3], a mortalidade global de câncer gástrico deve diminuir substancialmente por medidas que resultam em downstaging de tumores no momento do diagnóstico inicial.
Embora gastroscopia é o padrão ouro para o diagnóstico de câncer gástrico, a sua precisão não é tão alta como é para doenças gástricas benignas, tais como úlceras pépticas, especialmente em regiões geográficas de baixa a prevalência de câncer gástrico intermediária. A percentagem de diagnóstico do cancro dispensada, reportado como 4,6%, 14% e até 33% [4-6], não é insignificante. Mesmo no Japão, a taxa de falso negativo foi relatado como sendo de 19% [7]. Estes dados são consistentes com o valor preditivo positivo de apenas 0,4-0,7 para o diagnóstico endoscópico de cancro gástrico em diferentes centros [8-10]. Embora a proporção de diagnósticos perdidas aparece pequena, o número absoluto de pacientes negado o benefício de diagnóstico em fase curável não é negligenciável. Mesmo a uma taxa de falsos positivos modestamente baixo de diagnóstico de 5%, mais de 47.000 cancros gástricos teria sido perdido em um país de baixa prevalência sozinho (EUA) em um único ano de 2000 [11]. avaliação endoscópica inclui frequentemente biópsias da mucosa, mas não existem padrões clínicos para tanto o número ideal de biópsias ou as regiões anatômicas que devem ser incluídos na amostra. Uma recomendação comumente citado é tomar pelo menos sete biópsias para diagnosticar corretamente o câncer gástrico [12]. Neste estudo no entanto, totalmente 17% de todas as lesões posteriormente se demonstrou ser maligno foram considerados benignos na endoscopia. Assim, o exame da mucosa endoscópica sofre de variação inter-observador, a correlação abaixo do ideal com histopatologia, dificuldade em detectar cancros da submucosa e visualização desimpedida de todas as sub-regiões anatômicas por exemplo . Após cirurgia gástrica anterior [13, 14]
fluido gástrico é constituído por uma mistura de proteínas celulares solúveis secretados e esfoliadas a partir de toda a mucosa gástrica - incluindo as regiões que não pode ser adequadamente avaliado por endoscopia de fibra óptica. Nós, portanto, fundamentado que o perfil proteômico de fluido gástrico, geralmente considerado como um desperdício de subprodutos durante o exame gastroscópico, poderia ser útil para completar a avaliação clínica convencional, proporcionando um 'biópsia molecular' que efetivamente amostras de toda a mucosa gástrica, especialmente como técnicas de detecção de proteínas tais como espectrometria de massa pode ser muito sensível. Se realizada durante o curso de gastroscopia clinicamente indicado, obtendo-se o fluido gástrico não aumenta a capacidade de invasão do procedimento. Ao contrário do proteoma do plasma, o proteoma fluido gástrico é provável que seja menos complexo mas enriquecida em biomarcadores específicos para a doença, a ser gerado directamente no local da doença. Os mesmos biomarcadores, mesmo se estiver presente no plasma, pode ser diluída para além dos limites de detecção e misturado com outras proteínas mais abundantes sistémicos que reflectem as condições fisiopatológicas concomitantes (por exemplo, doenças de co-morbilidade), em vez de doença específica do local anatómico.
Nós investigamos uma nova abordagem para biomarcadores em desenvolvimento para o câncer gástrico perfilando peptídeos secretados solúveis presentes em fluido gástrico por via endoscópica aspirado e proteínas extraídas de células epiteliais esfoliada, também recuperados durante a endoscopia a laser dessorção de ionização time-of-flight superfície melhorada, (SELDI TOF) espectrometria de massa. Nossos resultados sugerem que vários biomarcadores de proteína de uma fonte específica do órgão ou seja fluido gástrico, gerar uma assinatura câncer gástrico distinto que merece maior desenvolvimento como uma ferramenta para melhorar a precisão do diagnóstico de gastroscopia e tem potencial para a detecção de câncer gástrico estágio inicial e pré-malignas lesões (metaplasia intestinal e displasia).
Métodos
amostras clínicas
fluidos gástricos foram obtidos durante gastroscopia de jejum durante a noite pacientes atendidos no Hospital Geral de Cingapura. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê do Hospital Geral de Cingapura de Ética. e conformado com as disposições da Declaração de Helsinki de 1995. As indicações para gastroscopia eram exclusivamente clínico e eram independentes do estudo. análise inicial foi realizada em um conjunto de treinamento de 19 amostras de adenocarcinomas gástricos histologicamente comprovada (13 do tipo intestinal, 4 tipo difuso, um tipo misto, 1 indeterminada) [15] e 36 amostras de pacientes com condições gástricas clinicamente benignos. A idade média de 19 pacientes com câncer gástrico (13 do sexo masculino, 6 do sexo feminino; 17 chineses, 2 indiana) foi de 68 anos. Distribuição pelo Comité Misto americana sobre o Câncer (AJCC) estadiamento clínico foi palco 0 (1 paciente), a fase I (4 doentes), fase II (2 pacientes), fase III (2 pacientes) e estágio IV (10 pacientes). A idade média dos 36 pacientes com condições gástricas benignas (19 do sexo masculino, 17 do sexo feminino, 33 chineses, malaios 2, 1 indiana) foi de 57 anos. Os diagnósticos clínicos após a endoscopia de pacientes não-cancerosas foram normais (9), gastrite antral (9), gastrite (6), úlcera (4), hérnia hiatal (3), pólipos hiperplásicos (2), esôfago de Barrett (1), fúndica cicatriz (1) e pólipos adenomatosos (1).
o algoritmo de classificação desenvolvido a partir do conjunto de treinamento foi testado por análise cego de um conjunto de validação composto por outros 24 confirmados histologicamente adenocarcinomas gástricos (10 tipo intestinal, 7 tipo difuso, um misto tipo, 5 indeterminado, 1 neuroendócrino) e 29 amostras gástricas benignas clinicamente. A idade média desses 24 pacientes com câncer gástrico (18 homens, 6 mulheres; 21 chineses, malaios 3) foi de 70 anos. A distribuição por estadiamento clínico AJCC foi FASE I (5 pacientes), fase II (4 pacientes), fase III (2 pacientes) e estágio IV (12 pacientes). Um paciente do conjunto de validação recusou uma investigação mais aprofundada e não poderia ser encenada. A idade média dos 29 pacientes não-cancerosas (11 do sexo masculino, 18 do sexo feminino, 26 chineses, indianos 2, 1 Malay) foi de 47 anos. Os diagnósticos clínicos após gastroscopia de pacientes não-cancerosas foram gastrite (14), pólipos fúndica glândula (2), úlcera gástrica aguda (2), duodenite (2), hérnia hiatal (1) e normal (8).
Nenhum dos os pacientes com câncer gástrico tinha recebido qualquer forma de tratamento do câncer no momento da gastroscopia.
Tomando casos de formação e validação em conjunto, 19% (8/43) e 29% (19/65) dos pacientes com câncer gástrico e gástrica benigna condições, respectivamente, foram positivos para H. pylori
, uma diferença que não foi significativa pelo teste exato de Fisher (2 lados p
value = 0,4508).
recolha e processamento das amostras
fluido gástrico foi aspirada para um contentor estéril a início de endoscopia, atribuído um código de anonimato e imediatamente colocado em gelo. amostras de Sangue ou manchado-biliares foram rejeitadas. Apenas clinicamente lesões nas mucosas suspeitas foram biopsiados a critério do endoscopista. fluidos gástricos foram centrifugadas a 180 g durante 6 minutos a 4 ° C, a partir do qual o sobrenadante foi centrifugado novamente a 16 100 g durante 30 minutos a 4 ° C. Pellets de ambas as centrifugações foram combinados. Os sobrenadantes de alta velocidade foram armazenadas separadamente a partir dos peletes a -80 ° C. Perfilamento
Proteína
Após descongelação, 10 ul de cada amostra de fluido gástrico foi aplicada a diferentes superfícies de matrizes químicas ProteinChip (Ciphergen Biosystems Inc, Califórnia , EUA): (a) de cobre (II) de Afinidade de metal Imobilizado de captura (IMAC3) na presença de 100 ul de 1 mol /L de ureia, 1 g /l de 3 - [(3-colamidopropil) dimetilamónio] -1-propanossulfonato ( CHAPS), 0,3 mol /L de KCl, cocktail inibidor de protease (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha), 50 mol /L de Tris HCl, pH 7,5; (B) fraco de permuta catiónica (WCX2 e CM10) na presença de 100 ul de 50 mmol /L acetato de sódio, 1 g /L glucopiranósido de octilo, cocktail inibidor de protease, de pH 5; (C) de troca aniónica forte (SAX2) na presença de 100 ul de 50 mmol /L de Tris HCl, 1 g /L de CHAPS, cocktail inibidor de protease, a pH 8; e (d) de Interacção Hidrofóbica (H50) na presença de 100 ul de 5 ml /L de ácido trif luoroacético. Após lavagem com 100 ul do mesmo tampão respectivas, o ácido sinapinico foi adicionado para facilitar a dessorção e ionização. Os chips foram analisados ​​por MS de SELDI-TOF-MS (pBSII, Ciphergen Biosystems Inc). Os cancros e os controlos foram misturados e executado simultaneamente no mesmo chip e em múltiplos chips para minimizar a variação de chip para chips.
Os peletes fluidos gástricos foram ressuspensas em 25 ul de 6 moles /l de tiocianato de guanidina, 5 g /L de octilo glucopiranósido, 0,1 mol /L de Hepes pH 7, e 100-200 ul de 9 mol /L de ureia, 2 g /l de CHAPS, 50 mmol /L Tris-HCl, pH 7,5 em vortex durante 45 minutos a 4 ° C. Após centrifugação a 20 000 g durante 5 minutos, 10 ul do extracto foi aplicada a matrizes ProteinChip como descrito acima. Um mapa
retentado foi gerado em que as proteínas individuais foram apresentados como picos separados com base na sua razão massa por carga . Dados dos espectros proteômicas foram analisados ​​por Ciphergen Express Data Software Manager com Pattern Track and bidirecional algoritmo de agrupamento hierárquico. picos alinhados com sinal para relações de ruído acima de 3 foram normalizados pela corrente de íons total. características proteômicas foram ainda analisados ​​utilizando a análise de significância de microarrays software (SAM) da Universidade de Stanford. O pacote foi projetado para resolver problemas específicos de análise de dados microarray (Signal to Noise razão de variância diferente do gene a gene, o grande número de pontos de dados a partir de um pequeno número de amostras), mas que encontramos a ser aplicável a análise de dados de proteômica também. O algoritmo de software foi descrito por Tusher
et ai. [16]. Em breve definiu uma métrica chamada a diferença relativa para medir a diferença entre dois ou mais grupos de dados em vez do valor de p
. É empregue uma variação do método de bootstrapping e repetidamente dividido um determinado conjunto de dados (espectros contendo as características proteomic neste estudo) aleatoriamente em dois grupos para calcular a diferença relativa para cada um dos permutações. O número de permutações foi definida para ser 1000 neste estudo e o software calculado 1000 valores de diferença relativa para cada recurso proteómica. A diferença relativa do agrupamento particular de interesse (observada diferença relativa) foi comparada com a diferença relativa média de todas as permutações (diferença relativa esperada) de cada recurso e o recurso foi considerada positiva ou negativa regulada consoante o respectivo diferença relativa observada foi maior ou menor do que a sua diferença em relação esperado por alguns limiar. O software estimou uma taxa de descoberta de falsas (também definido em referência [16]) para cada valor limite que forneceu um meio indireto para definir o corte. Os marcadores identificados por este método foram estatisticamente significativas. A taxa de detecção falsa foi definida para ser inferior a 0,05 neste estudo.
Para validar os marcadores identificados por SAM, um segundo lote de 53 amostras cegas foram adicionados ao conjunto de dados para agrupamento hierárquico usando o software Ciphergen Express Dados Manager. Enquanto as amostras conhecidos utilizados pelo SAM para seleccionar os marcadores eram esperadas para um bom desempenho no agrupamento, as amostras cegas foram incluídos para testar o quão bem os marcadores generalizar para amostras desconhecidas. Os resultados do agrupamento estavam simplesmente comparada com a verdadeira identidade das amostras e nenhum método de classificação avançado ou qualquer outro software foi utilizado na validação.
Identificação Biomarcador
proteínas fluido gástrico foram fraccionados por cromatografia de permuta aniónica (Q HyperD , Ciphergen Biosystems Inc.), utilizando as alterações passo a passo no pH para a eluição. As proteínas no 50 mmol /L de Tris HCl, 1 g /L glucopiranósido de octilo, pH 8 eluentes foram ainda purificados numa matriz de permuta catiónica (LWCX30) usando 50 mmol /L acetato de sódio, 1 g /L glucopiranósido de octilo, pH 5 como ligação e tampão de lavagem. Após a adição de moléculas absorventes de energia (ácido Ciphergen Biosystems Inc.) alfa-ciano-4-hidroxicinâmico, as proteínas retidas foram analisados ​​por pBSII e Q-TOF (Waters /Micromass) equipado com uma interface ProteinChip (PCI 1000, Ciphergen Biosystems Inc) . As proteínas foram caracterizados por MS /MS de fragmentação e a identificação foi realizado por pesquisa de banco de dados com Mascot (Matrix Ciência Ltd., Londres, Reino Unido). Validação Biomarcador
Esta foi realizada em um terceiro conjunto de amostras de fluidos gástricos feita a partir benigna gástrica e pacientes com câncer gástrico. Cada amostra recentemente recolhida foi processado para remover os resíduos sólidos e concentra-se o teor de proteína da seguinte maneira. Após a adição de fluoreto de fenilmetano-sulfonilo a uma concentração final de 0,2 mM, a amostra foi centrifugada durante 15 minutos a 500 g e 4 ° C. Os inibidores de protease (Completo Mini ™, Roche Applied Science, Indianapolis, IN, EUA) foram adicionados ao sobrenadante, seguido por filtração em membrana centrífuga a 2 900 g e o dispositivo de 15 ° C (Amicon Ultra-4 centrífuga de filtro, 5 000 limite de peso molecular nominal; Millipore, Billerica, MA, EUA) até que a amostra foi reduzida para 10 - 20% do seu volume original. A concentração total de proteína foi determinado pelo 2-D Quant Kit (Amersham Biosciences, Pisctaway, NJ, EUA). Pepsinogênio C e alfa-defensinas 1-3 concentrações foram determinados por imunoensaio ligado a enzima (ELISA), utilizando kits de diagnóstico Alpco (Salem, NH, EUA) e Hycult biotecnologia B.V. (Uden, Holanda), respectivamente. Cada amostra processada foi ensaiada em duplicado para pepsinogen C e os níveis de defensinas usando protocolos dos fornecedores. As amostras para ensaio de pepsinogénio C foram pré-diluídas 120 vezes. As concentrações de pepsinogênio C e 1-3-defensina alfa foram obtidos por referência a suas respectivas curvas padrão e expressos como ng (pepsinogen C) ou pg (defensinas) por micrograma de proteína fluido gástrico total.
Helicobacter pylori in the presença de H. pylori em tecidos
estômago foi identificada por visualização de microrganismos em espiral em secções histológicas e /ou por imunoistoquímica. Quatro secções de tecido foram-micron de-encerado em xileno e diminuindo os tipos de etanol. Antigen recuperação foi por aquecimento em tampão citrato, pH 6,0. O anticorpo primário contra o H. pylori
(diluição 1:50; Dako A /S, Glostrup, Dinamarca) foi seguido pela ligação de polímero anticorpo secundário (Envision Chem Mate, DAKO) e visualizadas utilizando diaminobenzidina como cromogénio
. resultados
vários biomarcadores de proteína para cima ou para baixo-regulados em cancro gástrico foram descobertos em fluido gástrico. Um mapa proteomic representante de fluido gástrico é mostrado na Figura 1. É uma vista em gel de um espectro de massa mostrando proteínas fluidos gástricos ligados selectivamente ao cobre imobilizada (II) de ião metálico na gama de peso molecular de 1500 Da a 6000 Da. marcadores de proteína significativas encontradas para ser sub-regulada no cancro do fluido gástrico (p
< 0,01) são indicados por setas. Figura mapa diferença 1 Expressão de fluido gástrico em cobre (II) de afinidade com metal imobilizado captura matriz ProteinChip (IMAC3). As setas indicam a proteína biomarcadores significativamente diferentes no nível de expressão entre os dois grupos de amostras.
Um mapa representativo de proteómica gástrica sedimento de extracto de fluido é mostrado na Figura 2. As proteínas foram selectivamente ligado a uma superfície da matriz de permuta catiónica. marcadores de proteína que se verificou serem importantes para cima ou para baixo-regulado em cancro gástrico sedimento fluido (p
< 0,01) são indicados por setas. Figura 2 Expressão mapa diferença de sedimento de extracto fluido gástrico na matriz de permuta catiónica ProteinChip (WCX2). As setas indicam a proteína biomarcadores significativamente diferentes no nível de expressão entre os dois grupos de amostras
CV médio. (Coeficiente de variação; cumulativa durante 10-15 picos principais de fluido gástrico por espectro, n = 8) para o cobre imobilizada matriz ProteinChip (II) (IMAC3) foi de 12,8%, para a matriz de permuta catiónica (WCX2) foi 15%, para a matriz de permuta aniónica (SAX2) foi de 17,3%, e para o chip de interacção hidrofóbica (H50) foi de 13,6%. Estes valores CV estão em linha com a avaliação reprodutibilidade na literatura SELDI [17, 18].
Por análise SAM de todos os recursos de proteômica (número total de recursos 41 800, número médio per mapa retido 314) em extrato fluido e pellet gástrica , 46 características proteômicas foram encontrados para ser significativamente regulada no cancro gástrico e 60 características proteômicas foram significativamente up-regulada no cancro gástrico. (Dados de diferentes condições, por exemplo, fluido e pelotas, bem como superfícies diferentes, simplesmente foram agregadas características distintas para SAM. Marcadores relatados por SAM em ambas as frações de pelotização e sobrenadante foram manualmente identificados e representavam apenas uma vez na lista depois de terem sido considerado biologicamente significativo). marcadores significativamente regulada incluído 1884, 2428, 2594, 2840, 4050, 11720, 13700 Da; marcadores significativamente up-regulamentados incluídos 1761, 1831, 3372, 3443, 3605, 5160, 6780 Da. (A maioria dos marcadores significativas foram descobertos em WCX2 e IMAC-cobre (II), seguido por SAX2). Com base nos 106 recursos proteômicas significativamente diferentes (arquivo adicional 1), foi realizada em dois sentidos análise de agrupamento hierárquico (bidimensional ligação completa). A maioria dos casos de cancro gástrico foram agrupados em conjunto para formar um grupo distinto (Figura 3 e o arquivo adicional 2). análise de componentes principais de dados o mesmo também revelou que o cancro e amostras benignas poderia ser bem separados em dois grupos, com 2 falsos negativos (o que representa uma análise em duplicado da mesma caso) e 9 falsos positivos, respectivamente (Figura 4). Uma amostra de fluido do cancro gástrico (a partir de um caso de fase I adenocarcinoma gástrico pouco diferenciado) agrupado entre amostras não cancerosas; todos os outros 4 no início do estágio (estágios 0 e I) pacientes corretamente agrupado com amostras de 14 pacientes com estágio II - câncer gástrico IV, dando uma sensibilidade geral de diagnóstico de 95% (18/19 pacientes com câncer gástrico) no conjunto de treinamento. Figura mapa diferença 3 Expressão da gástricas proteínas extrato fluido e pelotas de amostras conjunto de treinamento em quatro matrizes ProteinChip, exibidos em duas vias de agrupamento hierárquico. características proteômicas significativas são exibidas verticalmente. A intensidade da escala de cinza indica o grau de nível de proteína relativa, superior ou inferior ao valor mediano. Casos de pacientes são apresentados horizontalmente; a maioria dos pacientes com câncer gástrico estão fortemente agrupados juntos. Esta figura mostra o quartil superior da imagem completa (consulte arquivo adicionais 2 para a imagem completa).
Figura 4 plot análise de componentes principais de recursos proteômica de amostras do conjunto de treinamento. Um único plano (indicado pela linha preta) divide as amostras em dois grupos com um falso negativo (mostrado em pontos duplicados) e 9 falsos positivos.
Nove das 36 amostras não-cancerosas no conjunto de treinamento agrupado com as amostras de câncer (especificidade de 75%). Destes, uma tinha um pólipo adenomatosa displásico - uma lesão pré-cancerosa [19]. Entre os outros 8 pacientes, havia 6 clinicamente dirigido biópsias revelaram que a metaplasia intestinal em 4 pacientes (67%). Oito pacientes não oncológicos cuja perfis de proteína fluido gástrico agrupado no grupo normal também dirigiu clinicamente biópsias da mucosa que mostraram metaplasia intestinal em apenas 2 pacientes (25%). Uma revisão de 1000 biópsias gástricas consecutivos realizados para todas as indicações mostrou uma prevalência geral de metaplasia intestinal no Hospital Geral de Cingapura durante o período de estudo de 30%. Isto contrasta com a prevalência de pelo menos 67% de metaplasia intestinal em casos clinicamente benignos cujos perfis proteômica agrupado mais estreitamente com os casos de câncer gástrico do que com outras normais, de acordo com metaplasia intestinal ser um estado intermediário na transição do epitélio gástrico normal adenocarcinoma gástrico . A identificação precisa de metaplasia intestinal por endoscopia é conhecido por ser imprecisa [20]. Assim, uma impressão digital proteômica do tipo de câncer gástrico é, possivelmente, um indicador sensível para a presença desta lesão pré-maligna em pacientes clinicamente diagnosticados como tendo distúrbios gástricos benignos.
Pacientes com câncer gástrico no conjunto de treinamento eram significativamente mais velhos (idade 67,7 dizer anos) do que os pacientes com doenças gástricas benignas (média de idade de 56,6) (p = 0,0062
). Para lidar com a possibilidade de que perfis de proteínas foram relacionados à idade ou etnia, que os dados do subconjunto de pacientes chineses acima de 55 anos de idade re-analisados. Isto resultou em 1/17 cancros classificadas incorretamente (o mesmo tumor que foi erroneamente classificada quando todos os 19 tipos de câncer foram analisados, sensibilidade de 94%) e 4/17 controles mal classificados (os mesmos 4 controles que estavam entre os 9 casos benignos classificados incorretamente, especificidade 76,5%) .
Nós próxima testado o desempenho real dos perfis proteômicos no câncer de distinção a partir de amostras benignas em uma segunda série de 53 amostras cegas gástricas fluidos e sedimentos de extracto (24 cânceres gástricos e 29 distúrbios gástricos benignos) (arquivo adicional 3). Vinte e um dos 24 cânceres gástricos foram corretamente identificados (sensibilidade 88%) e 2 de 29 amostras benignas foram erroneamente classificadas (especificidade de 93%) (Figura 5). Figura mapa diferença 5 Expressão de proteínas do líquido e sedimento de extracto gástricos de amostras conjunto de validação em quatro matrizes ProteinChip, exibido em duas vias de agrupamento hierárquico. características proteômicas significativas são exibidas horizontalmente. A intensidade das cores vermelha ou verde indica que o grau de nível de proteína relativa, superior ou inferior ao valor mediano. Casos de pacientes são apresentados na vertical; a maioria dos doentes com cancro gástrico são fortemente agrupados em conjunto.
seleccionado marcadores proteomic (com base em registos de significância determinada por SAM) foram semi-purificado em matrizes ProteinChip e identificado directamente em manchas por sequenciação de dissociação induzida por colisão (Figura 6). Vários dos marcadores significativamente regulada para baixo em pacientes de cancro mostrados nas Figuras 1 e 2, 1881,9 Da, 2041,0 Da, 2188,1 Da e 2387,3 Da, foram identificados como sendo pepsinogénios C e pepsina A fragmentos de peptídeo de activação (Quadro 1). Os marcadores triplete-regulada em pacientes com câncer mostrados nas Figuras 2, 7 e adicionais de arquivo 4 foram identificados como sendo alfa defensina-1,2,3. parcelas intensidade de dispersão mostram diferenças altamente significativas nas intensidades médias de fragmento de defensinas e pepsina entre o controle benigno e amostras de fluidos câncer gástrico (p = 0,003
e 0,00002, respectivamente) (Figura 8). Usando ELISA específico para pepsinogen C, confirmamos concentrações significativamente mais baixas em fluidos câncer gástrico (11,9 ± 0,1 ng /g de proteína total, média ± SEM n = 6.) em comparação com amostras benignas (21,5 ± 1,4 ng /g de proteína total n =. 23) em um terceiro conjunto de amostras (p = 0,0126
; não emparelhado de duas caudas t
teste de Student). ELISA realizado no mesmo conjunto de amostras para os níveis de defensinas mostrou maiores concentrações em amostras de câncer gástrico (63,4 ± 9,2 pg /g de proteína total, média ± SEM n = 6) do que em amostras benignas (46,2 pg /g de proteína total, média ± SEM n = 23) ((p = 0,0654
; t
teste de Student) sequências .table 1 peptídeos identificados por MS //MS
Peptide m /z
Sequence
Protein Jogo
Mowse † marcar
Mowse marcar com homologia significativa
2.386,29
FLKKHNLNPARKYFPQWKA
pepsina A peptídeo de ativação
35 Restaurant > 28
2.187,12
FLKKHNLNPARKYFPQW
pepsina A peptídeo de ativação
18 Restaurant > 26
2.040,03
LKKHNLNPARKYFPQW
pepsina A peptídeo de ativação
28 Restaurant > 26
1.775,95
FLKKHNLNPARKYF
pepsina A peptídeo de ativação
47
> 26
1.628,84
LKKHNLNPARKYF
pepsina A peptídeo de ativação
40 Restaurant > 28
1.880,92
peptídeo de ativação LRTHKYDPAWKYRF
Pepsinogen C
31
> 22
† Mowse pontuação = -10Log ( P), onde P = probabilidade de que o jogo é um evento aleatório (P Art < 0,05) m /z
, massa /carga
Figura espectro de massa 6 de alta resolução de proteínas do líquido gástrico fracionados em conjunto LWCX30 ProteinChip obtidos em um QTOF equipado com uma interface PCI1000. picos em caixas foram submetidos à análise de fragmentação por dissociação induzida por colisão MS /MS.
Figura 7 espectro de massa de alta resolução de proteínas do líquido gástrico na matriz H50 ProteinChip obtidos em um QTOF equipado com uma interface PCI1000. Esta figura mostra os marcadores triplete-regulada no cancro gástrico. Por favor, veja arquivo adicionais 4 para a imagem completa.
Figura 8 Gráficos de dispersão de valores de intensidade de defensinas e fragmento de pepsina presente em amostras de fluido gástrico de controle benigno e pacientes com câncer gástrico do conjunto de treinamento.

Discussão Os nossos dados sugerem que o perfil espectral de fluido gástrico não fraccionada pode ser um adjuvante útil para o diagnóstico e detecção de doença fase precoce do cancro, quando combinado com a gastroscopia clínica. A maioria das tentativas recentes de identificar biomarcadores de proteína para câncer gástrico têm investigado o soro [21-29] e tecido [24, 30-37], e cada vez mais utilizada espectrometria de massa. relatórios mais antigos de testes sorológicos de marcadores tumorais conhecidos individuais por exemplo CEA, CA 19-9, CA 72-4, TAG-CA242 e 72, têm geralmente baixa sensibilidade (< 50%) [38-41]. Além disso, existe cruzada positividade substancial destes marcadores de tumores em cancros gástricos, por exemplo, não- níveis de CEA levantada e MG7-AG são comuns no cancro colorectal, colangiocarcinoma, carcinoma do pâncreas, e até mesmo em controles saudáveis ​​[40, 23]. Não surpreendentemente, esses marcadores tumorais soro não têm nenhum papel estabelecido no diagnóstico de câncer gástrico e de triagem, embora possam servir como indicadores prognósticos e marcadores precoces de doença recorrente seguintes gastrectomia [39, 41, 42].
Nós escolhemos para examinar perfis proteômicos de fluido gástrico para biomarcadores da doença porque parecia provável que a secreção de proteína perturbado gástrico em estados malignos e pré-malignos, juntamente com a possível presença de células cancerosas esfoliadas, poderia gerar perfis proteomic distintivas. Tal como na pesquisa de biomarcadores de soro, vários grupos têm investigado a utilidade de diagnóstico de marcadores tumorais conhecidos no suco gástrico. Nem CEA nem CA 19-9 positividade em fluido gástrico demonstrou precisão diagnóstica [43-46]. Antitripsina alfa-1 no suco gástrico, foi recentemente reportado como um biomarcador cancro gástrico [47, 48].
A nossa abordagem para o desenvolvimento de um método sensível para o diagnóstico do cancro gástrico diferiam de estudos anteriores de três maneiras. Primeiro, nós escolhemos uma amostra biológica que foi para órgãos-(fluido gástrico por via endoscópica aspirado ou seja) em vez de (soro ou seja) sistêmica, argumentando que as características moleculares seria mais provável que seja específica para a doença. Em segundo lugar, a espectrometria de massa nos permitiu ter uma abordagem baseada em descoberta imparcial. Em terceiro lugar, os nossos dados gerados perfis de múltiplos marcadores proteomic que são cada vez mais consideradas como tendo uma maior sensibilidade e especificidade do que os marcadores tumorais únicas [49, 50]. Para o câncer gástrico, combinando até mesmo 2 ou 3 marcadores tumorais alcançados melhor precisão diagnóstica em comparação com somente um único marcador [38, 40]. Impressões digitais de proteína
de fluido gástrico de pacientes com câncer gástrico mostrou um total de 106 recursos proteômicas que foram significativamente up - ou regulada (arquivos adicionais 1 e 3). Dois marcadores proeminentes foram seleccionados para identificação por MS /MS. Pepsinogen A e peptídeos de ativação pepsinogen C foram regulados negativamente em fluidos gástricos removidos de estômagos com diagnóstico histológico de adenocarcinomas. Um estudo de secções de crióstato de cancro gástrico também relatou significativa diminuição da regulação dos pepsinogénios C, identificado por MS /MS, em tecido de tumor [51].

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