Отличительная желудка протеом жидкости при раке желудка показывает диагностический profile

мульти-биомаркеров Отличительная желудка протеом жидкости при раке желудка показывает диагностический профиль мульти-биомаркеров
Аннотация
Справочная
Общая выживаемость рака желудка остается на низком уровне, главным образом потому, что там нет надежных методов идентификации очень излечимо ранней стадии заболевания. Multi-белок профилирование желудочного сока, полученного из анатомического участка патологии, может выявить диагностические протеомические отпечатки пальцев.
Методы
профили Белковые сгенерированные из образцов желудочного жидкости от 19 рака желудка и 36 больных доброкачественной gastritides подвергались плановым, клинически -indicated гастроскопии с использованием поверхности с повышенной лазерной десорбцией /ионизацией времени пролета масс-спектрометрии нескольких массивов белковых. Протеомные особенности сравнивались значимости анализа алгоритма микрочипов и двухсторонним иерархической кластеризации. Второй ослепил набор образцов (24 рака желудка и 29 клинически доброкачественные gastritides) был использован для проверки.
Результаты
По значимости analysyis из микрочипов, 60 протеомические особенности были повышающей регуляции и 46 понижающей регуляции в образцах рака желудка (р
&л; 0,01). Multimarker кластеризация показал две отличительные протеомические профили независимо от возраста и этнической принадлежности. Восемнадцать из 19 образцов рака, сгруппированных вместе (чувствительность 95%) в то время как 27/36 проб нераковых сгруппированных во второй группе. Девять образцов неонкологические, что кластерные с образцами рака включали 5 предраковых поражений (1 аденоматозных полипов и 4 метаплазии кишечного тракта). Проверка с использованием второго набора образцов показал чувствительность и специфичность 88% и 93%, соответственно. Положительная прогностическая ценность объединенных данных была 0,80. Выбранный пептид последовательности идентифицировали пепсиногена С и пепсина пептида, активации, как значительно понижающей регуляции и альфа-дефенсина, как значительно повышающей регуляции.
Заключение
Этот простой и воспроизводимой multimarker протеомики анализа могут дополнить клиническую оценку гастроскопическое симптоматических пациентов для повышения точность диагностики рака желудка и предраковых поражений.
Предпосылки
в отличие от других распространенных видов рака, прогноз для большинства больных раком желудка бедных и улучшилась немного в течение последних нескольких десятилетий. Пятилетние показатели выживаемости при раке желудка значительно ниже всех основных видов рака, кроме рака печени, поджелудочной железы и пищевода [1]. Принимая во внимание, что рак желудка на ранней стадии, имеет гораздо лучший прогноз (5-летняя выживаемость примерно 90%), чем поздних стадиях рака желудка (5-летняя выживаемость 3-10%) [2, 3], глобальная смертность от рака желудка должно существенно уменьшить путем меры, которые приводят к опухоли понижения стадии в момент первоначального диагноза.
Хотя гастроскопия является золотым стандартом для диагностики рака желудка, его точность не столь высока, как для доброкачественных заболеваний желудка, таких как пептической язвы, особенно в географических регионах от низкой до средней желудочной распространенности рака. Процент пропущенного диагноза рака, сообщается как 4,6%, 14% и даже 33% [4-6], не является незначительным. Даже в Японии, ложные отрицательные темпы, как сообщается, 19% [7]. Эти данные согласуются с положительной прогностической ценностью только 0,4 - 0,7 для эндоскопической диагностики рака желудка в различных центрах [8-10]. Хотя доля пропущенных диагнозов появляется небольшое, абсолютное число больных отказано польза от диагноза на излечимой стадии не является незначительным. Даже при умеренно низкой ложноположительного диагностической ставке 5%, более чем 47000 рака желудка были бы пропущены в одной стране низкой распространенности в одиночку (США) в течение одного года, 2000 [11]. Эндоскопическая оценка часто включает в себя биопсию слизистой оболочке, но нет никаких клинических стандартов либо оптимального количества биопсий или анатомических областей, которые должны быть выбраны. Часто приводимый рекомендация состоит в том, чтобы принять по крайней мере семь биопсию, чтобы правильно диагностировать рак желудка [12]. В этом исследовании, однако, полностью 17% всех поражений впоследствии показанных злокачественными считались доброкачественными по эндоскопии. Таким образом, эндоскопическое исследование слизистой оболочки страдает от вариации между наблюдателями, неоптимальным корреляции с гистопатологией, трудности в выявлении подслизистых рака и беспрепятственное визуализацию всех анатомических субрегионов например . После предыдущей операции желудка [13, 14]
желудочную жидкость состоит из смеси растворимых и секретируемых эксфолиативных клеточных белков из всей слизистой оболочки желудка - в том числе областей, которые не могут быть оценены адекватно по оптоволоконной гастроскопии. Поэтому мы рассуждали, что Протеомные профиль желудочной жидкости, как правило, рассматривается в качестве отходов побочного продукта при гастроскопической экспертизы, могли бы с пользой дополнить традиционную клиническую оценку путем предоставления «молекулярной биопсии», которая эффективно образцы всю слизистую оболочку желудка, особенно в качестве методов обнаружения белка, такие как масс-спектрометрия может быть очень чувствительным. Если выполняется в течение от клинических показаний гастроскопии, получение желудочного сока не увеличивает инвазивность процедуры. В отличие от плазмы протеома, желудочный протеом жидкости, вероятно, будет менее сложным, но обогащены специфических биомаркеров, генерируется непосредственно на месте заболевания. Те же биомаркеров, даже если они присутствуют в плазме, могут быть ослаблены за пределы обнаружения и смеси с другими более обильными системных белков, которые отражают одновременно патофизиологических условиях (например, сопутствующего заболева-), а не анатомической болезни сайт-специфичной.
Мы исследовали новый подход к разработке биомаркеров для рака желудка по профилированию растворимые секретируемые пептиды присутствуют в эндоскопически придыханием желудочной жидкости и белков, извлеченной из слущенных эпителиальных клеток, также извлекаемых при эндоскопии поверхностной повышенной лазерной десорбцией-ионизацией времени пролета (SELDI TOF) масс-спектрометрии. Наши результаты свидетельствуют о том, что несколько белковых биомаркеров из источника органоспецифической т.е. желудочного сока, генерировать отличительный желудка подпись рака, которая заслуживает дальнейшего развития в качестве инструмента для улучшения диагностической точности гастроскопии и имеет потенциал для выявления ранней стадии рака желудка и предраковых поражения (кишечная метаплазия и дисплазия).
Методы
Клинические образцы
желудочном соке были получены при гастроскопии из голодавших в течение ночи пациентов видели в больнице общего профиля Сингапура. Протокол исследования был одобрен Комитетом по этике больницы общего профиля Сингапура. и соответствовали положениям Хельсинкской декларации 1995 г. Показания к гастроскопии были исключительно клиническим и не зависели от исследования. Первоначальный анализ был проведен на обучающей выборке из 19 образцов из гистологически доказанным желудка аденокарциномы (13 типа кишечного тракта, 4 диффузного типа, 1 смешанный тип, 1 неопределенными) [15] и 36 образцов от больных с клинически доброкачественных условиях желудка. Средний возраст 19 пациентов рака желудка (13 мужчин, 6 женского, 17 китайских, 2 индийский) было 68 лет. Распределение американского Объединенного комитета по рака (AJCC) клинической стадии была стадия 0 (1 пациент), этап I (4 больных), стадия IV (10 больных) II (2 больных) стадия, стадия III (2 больных) и. Средний возраст 36 пациентов с доброкачественными желудочных условиях (19 мужчин, 17 женского, 33 китайских, 2 малайских, 1 индийский) было 57 лет. Клинические диагнозы после эндоскопии больных нераковых были нормальными (9), антральный гастрит (9), гастрит (6), язвенной болезни (4), грыжа пищеводного отверстия диафрагмы (3), гиперпластические полипы (2), пищевод Барретта (1), фундальный рубец (1) и аденоматозных полипов (1).
алгоритм классификации, разработанной из обучающего набора была проверена путем ослепленный анализа набора проверки, состоящей из еще 24 гистологически подтвержденный желудочных аденокарциномы (10 кишечного типа, 7 типа диффузного, 1 смешанный тип, 5 неопределенными, 1 нейроэндокринной) и 29 клинически доброкачественные образцы желудка. Средний возраст этих 24 больных раком желудка (18 мужчин, 6 женщин, 21 китайский, 3 малайский) было 70 лет. Распределение по AJCC клинической стадии был I (5 пациентов) стадии (4 больных) II стадия, стадия III (2 больных) и стадии IV (12 больных). Один пациент в проверке обоснованности отказалась от дальнейшего расследования и не может быть поставлена. Средний возраст 29 нераковых больных (11 мужчин, 18 женщин, 26 китайских, индийских 2, 1 Малайский) было 47 лет. Клинические диагнозы после гастроскопии больных нераковых были гастрит (14), фундальную полипы железа (2), острая язва желудка (2), дуоденит (2), грыжа пищеводного отверстия (1) и нормальный (8). Ни один из
что у больных раком желудка получили какой-либо формы лечения рака во время гастроскопии.
Принимая учебных и проверочных дел вместе, 19% (8/43) и 29% (19/65) пациентов с раком желудка и доброкачественной желудка условия, соответственно, были положительными на H. Pylori
, разницей, что не было статистически значимым путем точного критерия Фишера (2-сторонний р
значение = 0,4508).
сбор и обработка проб
Желудочный жидкость отсасывали в стерильный контейнер при начале эндоскопии, присвоен код обезличенной и немедленно помещают на лед. Крово- или иктерический образцы были отвергнуты. Только клинически подозрительные повреждения слизистой оболочки были биопсию по усмотрению эндоскопистом. Желудочном соке центрифугировали при 180 г в течение 6 мин при температуре 4 ° С, от чего супернатант снова центрифугировали при 16 100 г в течение 30 мин при температуре 4 ° С. Пеллеты были объединены с обоих центрифугировани. Супернатанты быстродействующие хранились отдельно от гранул при температуре -80 ° С.
Протеин профилирование
После оттаивания, по 10 мкл каждого образца желудочной жидкости наносили на различные химические поверхности белковых массивов (Ciphergen Biosystems Inc, Калифорния , США): (а) медь (II), с иммобилизованным металлом Сродство Захват (IMAC3) в присутствии 100 мкл 1 моль /л мочевины, 1 г /л 3 - [(3-холамидопропил) диметиламмонио] -1-пропансульфонат ( CHAPS), 0,3 моль /л KCl, коктейль ингибиторов протеаз (Roche Diagnostics, Mannheim, Германия), 50 моль /л Трис HCl, рН 7,5; (Б) Слабая катионит (WCX2 и CM10) в присутствии 100 мкл 50 ммоль /л ацетата натрия, 1 г /л октиловом глюкопиранозида, ингибиторов протеаз, рН 5; (В) сильная анионообменная (SAX2) в присутствии 100 мкл 50 ммоль /л Трис HCl, 1 г /л CHAPS, ингибитор протеаз, рН 8; и (d) гидрофобного взаимодействия (Н50) в присутствии 100 мкл 5 мл /л трифторуксусной кислоты. После промывки 100 мкл тех же самых соответствующих буферов, синапиновая кислота была добавлена ​​для облегчения десорбции и ионизации. Чипы были проанализированы с помощью SELDI-TOF-MS (PBSII, Ciphergen Biosystems Inc). Раки и средства управления были перемешаны и работать одновременно на одном чипе и на нескольких чипов, чтобы свести к минимуму микросхемы к микросхеме вариацию.
Желудочные гранулы жидкость ресуспендировали в 25 мкл 6 моль /л тиоцианата гуанидина, 5 г /л октильными глюкопиранозид, 0,1 моль /л Hepes, рН 7, и 100-200 мкл 9 моль /л мочевины, 2 г /л CHAPS, 50 ммоль /л Трис HCl, рН 7,5 при помощи вортекса в течение 45 мин при температуре 4 ° с. После центрифугирования при 20 000 г в течение 5 мин, 10 мкл экстракта наносили на белковых матриц, как описано выше.
Карте ретентат генерироваться, в которой отдельные белки отображаются в виде отдельных пиков на основе их массы к заряду , Данные, полученные в протеомическим спектров были проанализированы с помощью экспресс Ciphergen Software Manager данных с Pattern Track и двухсторонним алгоритма иерархической кластеризации. Унифицированные пики сигнала к шуму выше 3 были нормированы полного ионного тока. Протеомные особенности были дополнительно проанализированы с помощью анализа значимости микрочипов (SAM) программного обеспечения из Стэнфордского университета. Пакет был разработан для решения проблем, характерных для анализа микрочипов данных (отношение сигнал дисперсии шума, отличного от гена к гену, большое количество точек данных из небольшого количества образцов), но мы обнаружили, что это применимо к анализу протеомики данных, а также. Алгоритм программного обеспечения был описан Tusher и др
. [16]. Вкратце она определена метрика называется относительная разность для измерения разности между двумя или более группами данных, вместо величины р
. Он использовал вариант способа самонастройки и многократно делится заданный набор данных (спектры, содержащие протеомические функции в данном исследовании) случайным образом на две группы, чтобы вычислить относительную разность для каждой из перестановок. Число перестановок было установлено, чтобы быть в этом исследовании, 1000 и программное обеспечение вычислен 1000 относительная разность значений для каждого протеомического функции. Относительная разность конкретной группе интереса (наблюдается относительная разность) была по сравнению со средней относительной разности от всех перестановок (ожидаемая относительная разность) каждой функции и функция оценивали как вверх или вниз регулируется в соответствии с ли его наблюдаемая относительная разница была больше или меньше его ожидаемой относительной разностью некоторого порога. Программное обеспечение оценило уровень ложных обнаружения (также определено в [16]) для каждого порогового значения, что при условии Косвенным средства для установки обрезания. Маркеры, идентифицированные этим способом были статистически значимыми. Частота ложных открытие было установлено, чтобы быть меньше, чем 0,05 в данном исследовании.
Для проверки маркеров, выявленных SAM, вторая партия из 53 ослепленных образцов были добавлены к набору данных для иерархической кластеризации с использованием программного обеспечения диспетчера Ciphergen Экспресс данных. В то время как известные образцы, используемые для выбора SAM маркеры должны были хорошо выступить в кластеризация, ослепленные образцы были включены, чтобы проверить, насколько хорошо маркеры обобщаются неизвестных образцов. Результаты кластеризации были просто по сравнению с истинной идентичности образцов и не передовые метода классификации или любое другое программное обеспечение было использовано в проверке. Идентификация
биомаркировки
Желудочные белков жидкостных фракционировали с помощью анионообменной хроматографии (Q HyperD , Ciphergen Biosystems Inc.), используя скачкообразные изменения рН для элюирования. Белки в 50 ммоль /л Трис HCl, 1 г /л октиловом глюкопиранозида, рН 8 Элюанты дополнительно очищали на катионообменной массиве (LWCX30) с использованием 50 ммоль /л ацетата натрия, 1 г /л октил глюкопиранозид, рН 5 в качестве обязательного и промывочный буфер. После добавления альфа-циано-4-гидроксикоричной энергия кислоты поглощающими молекулами (Ciphergen Biosystems Inc.), нераспределенной белки анализировали с помощью PBSII и Q-TOF (Waters /Micromass) оснащен интерфейсом (белковых PCI 1000, Ciphergen Biosystems Inc.) , Белки характеризовались МС /МС фрагментации и идентификация была сделана поиска в базе данных с Маскот (Matrix Science Ltd., Лондон, Великобритания).
Биомаркеров проверки
Это было выполнено в третьем наборе образцов желудочного жидкости, взятой из доброкачественной желудка и больных раком желудка. Каждый свежесобранных образец обрабатывают для удаления твердого мусора и сконцентрировать содержание белка следующим образом. После добавления фторида phenylmethanesulfonyl до конечной концентрации 0,2 мМ, образец центрифугировали в течение 15 мин при 500 г и 4 ° С. Ингибиторы протеаз (Полная Mini ™, Roche Applied Science, Индианаполис, штат Индиана, США) добавляли к надосадочной жидкости, с последующим центробежным мембранной фильтрацией в 2 900 г и ультра-4 центробежного фильтрующее устройство 15 ° C (Amicon, 5 000 номинальный предел молекулярной массы; Millipore, Биллерика, Массачусетс, США), пока образец был уменьшен до 10 - 20% от его первоначального объема. Общую концентрацию белка определяли с помощью 2-D Квант Kit (Amersham Biosciences, Pisctaway, NJ, USA). Пепсиноген C и альфа-дефенсина 1-3 концентрации определялись иммуноферментный анализ (ELISA) с использованием наборов из Alpco диагностики (Salem, NH, США) и Hycult биотехнологии B.V. (Уден, Нидерланды), соответственно. Обработанное образец в дубликатах для пепсиногена С и уровней дефенсина с использованием протоколов поставщиков. Образцы для анализа пепсиногена C были предварительно разбавлено 120 раз. Концентрации пепсиногена С и альфа-дефенсина 1-3 были получены путем ссылки на их соответствующих стандартных кривых и выражали в виде нг (пепсиногена С) или пг (дефенсина) на микрограмм от общего белка желудочной жидкости.
Helicobacter Pylori
наличие антихеликобактерной
в тканях желудка была определена с помощью визуализации спиральными микроорганизмов в разделах гистологии и /или с помощью иммуногистохимии. Четыре секции микронных ткани были де-вощеной в ксилоле и убывающих сортов этанола. Антиген поиска было путем нагревания в цитратном буфере, рН 6,0. Первичное антитело против хеликобактерной
(разведение 1:50; DAKO A /S, Glostrup, Дания) последовала ссылка вторичного полимерного антитела (Envision Chem Mate, DAKO) и визуализировали с использованием диаминобензидина в качестве хромогенного
. Результаты
Несколько вверх или вниз регулируемые белковые биомаркеры при раке желудка были обнаружены в желудочном соке. Представитель протеомические карта желудочной жидкости показана на рисунке 1. Она представляет собой вид геля масс-спектра, показывающий желудочные белки жидкость селективно связанных с иммобилизованным меди (II) иона металла в диапазоне молекулярных масс от 1500 Да до 6000 Да. Значительные маркеры белка, обнаруженное быть понижающей регуляции при раке желудка жидкости (р
&л; 0,01) обозначены стрелками. Рисунок 1 Экспрессия разница карта желудочном соке на меди (II) с иммобилизованным металлом сродства захвата белковых массив (IMAC3). Стрелки указывают белка биомаркеров существенно отличаются по уровню экспрессии между двумя группами образцов.
Представительная Протеомические карту желудочного экстракта гранул жидкости показан на рисунке 2. Белки избирательно связывается с поверхностью обмена массива катионом. Значительные белковые маркеры сочтенных вверх или вниз регулируется в желудочном гранулу жидкости рака (р
≪ 0,01), показаны стрелками. Рисунок 2. Экспрессия разница карта желудочного экстракта гранул жидкости на катионообменную массиве (белковых WCX2). Стрелки указывают белка биомаркеров значительно отличаются по уровню экспрессии между двумя группами образцов
Среднее CV. (Коэффициент вариации; кумулятивный 10-15 основных желудочных пиков жидкости в спектре, N = 8) для иммобилизованной меди белковых массив (II), (IMAC3) составила 12,8%, для катионообменной массива (WCX2) был 15%, для анионообменной массива (SAX2) составила 17.3%, а для гидрофобного взаимодействия чипа (H50) составила 13,6%. Эти значения CV в соответствии с оценкой воспроизводимости в SELDI литературе [17, 18].
Сэмом анализа всех протеомическим функций (общее количество функций 41 800, среднее число на карте задерживаемого 314) в желудочном соке и гранул экстракта , были найдены 46 протеомические функции, значительно понижающей регуляции при раке желудка и 60 протеомические функции были значительно повышающей регуляции при раке желудка. (Данные от различных условий, например, жидкости и гранул, а также различные поверхности, были просто объединены вместе как отдельные функции для SAM. Маркеры, о которых сообщают SAM в обоих осадок и надосадочную жидкость фракции вручную идентифицированы и представлены только один раз в списке после того, как они были считаются биологически значимыми). Значительно понижающего регулируемые маркеры включали 1884, 2428, 2594, 2840, 4050, 11720, 13700 Da; значительно повышающего регулируемые маркеры включали 1761, 1831, 3372, 3443, 3605, 5160, 6780 Da. (Большинство из значимых маркеров были обнаружены на WCX2 и IMAC-меди (II), с последующим SAX2). На основании 106 существенно различных протеомическим функций (дополнительный файл 1), двусторонний иерархический анализ кластеризации (двумерная полная связь) была выполнена. Большинство случаев рака желудка были сгруппированы вместе, чтобы сформировать отличительную группу (рисунок 3 и дополнительный файл 2). Основной компонент анализа тех же данных также показал, что рак и доброкачественные образцы могут быть также разделены на две группы, с 2-мя ложноотрицательных (представляющих дубликата анализ одного и того же случая) и 9 ложных срабатываний, соответственно (рисунок 4). Один рак желудка образец жидкости (от случая стадии я слабо дифференцированы аденокарциномы желудка) кластерном среди образцов нераковых; все остальные 4 ранней стадии (стадии 0 и I) пациенты правильно сгруппированы с образцами от 14 больных с II стадии - IV рака желудка, давая общую диагностическую чувствительность 95% (18/19 больных раком желудка) на обучающей выборке. Рисунок 3. Экспрессия разница карта желудочного сока и гранул экстракта белков подготовки образцов набора на четырех белковых массивов, отображаемых в двух направлениях иерархической кластеризации. Значительные протеомические функции отображаются вертикально. Интенсивность оттенков серого указывает на степень относительного уровня белка, выше или ниже среднего значения. случаи пациентов представлены в горизонтальном направлении; большинство больных раком желудка тесно сгруппированы вместе. На этом рисунке показана верхняя квартиль полного изображения (см дополнительный файл 2 для полного изображения). Рисунок 4
анализа главных компонент участок протеомическим особенностей обучающей выборки образцов. Одна плоскость (обозначается черной линией) разделяет образцы на две группы с 1 Ложноотрицательный (как показано на дублирующих пятен) и 9 ложных срабатываний.
Девять из 36 образцов нераковых в обучающем наборе кластерном с образцами рака (специфичность 75%). Из них 1 был диспластические аденоматозный полип - предраковое поражение [19]. Среди остальных 8 пациентов, 6 было клинически направлено биопсий, которые показали кишечной метаплазии у 4 больных (67%). Восемь пациентов неонкологические которых желудочный профили белковые жидкости группируются в нормальной группе был также клинически направленной мукозные биопсий, которые показали, кишечная метаплазия всего 2 пациентов (25%). Обзор 1000 последовательных желудочных биопсий, выполненных для всех показаний показал общую распространенность кишечной метаплазии в больнице общего профиля Сингапура за период исследования, 30%. Это контрастирует с преобладанием по крайней мере, 67% кишечной метаплазии среди клинически доброкачественных случаев, чьи Протеомные профили группируются более тесно связан с желудочным случаев заболевания раком, чем с другими нормалей, в соответствии с кишечной метаплазии является промежуточным состоянием при переходе нормального желудочного эпителия к аденокарциномы желудка , Точная идентификация кишечной метаплазией эндоскопически, как известно, неточны [20]. Таким образом, рак желудка типа Протеомные отпечатков пальцев, возможно, является чувствительным индикатором на наличие этого предракового поражения у больных клинически диагностированных как наличие доброкачественных расстройства желудка.
Больных раком желудка в подготовке набора были значительно старше (средний возраст 67,7 лет), чем у пациентов с доброкачественными желудочных условиях (средний возраст 56,6) (р = 0,0062
). Для устранения возможности того, что профили белка были связаны с возрастом или этнической принадлежности, мы повторно проанализировали данные подмножества китайских пациентов старше 55 лет. Это привело к 1/17 рака (неправильно классифицированных той же опухоли, что было неправильно классифицирован, когда были проанализированы все 19 видов рака; чувствительность 94%) и 4/17 управления неправильно классифицированных (те же 4 управления, которые были среди 9 доброкачественных случаев неправильно классифицированных; специфичность 76,5%) .
Затем мы тестировали реальную производительность протеомическим профилей в различении рака от доброкачественных образцов во второй серии 53 ослепленных желудочной жидкости и осадка образцов экстракта (24 рака желудка и 29 доброкачественных заболеваний желудка) (дополнительный файл 3). Двадцать одна из 24 рака желудка были правильно идентифицированы (чувствительность 88%) и 2 из 29 доброкачественных образцов были ошибочно классифицированы (специфичность 93%) (рисунок 5). Рисунок 5 Выражение разница карта желудочного сока и экстракта гранул белков проверки набора образцов на четырех белковых массивов, отображаются в двух направлениях иерархической кластеризации. Значительные протеомические функции отображаются горизонтально. Интенсивность красного или зеленого цвета указывает на степень относительного уровня белка, выше или ниже среднего значения. случаи пациентов представлены вертикально; Большинство больных раком желудка тесно сгруппированы вместе.
Избранные протеомические маркеры (основываясь на значении, определенном Балл SAM) были полуочищенным на белковых массивов и определены непосредственно на местах путем столкновения индуцированной диссоциации последовательности (рисунок 6). Несколько значительно понижающей регуляции маркеров у больных раком, показанных на рисунках 1 и 2, 1881,9 Da, 2041,0 Da, 2188,1 Da и 2387,3 Da, были идентифицированы как пепсиногена С и пепсина Активации фрагменты пептида (таблица 1). В повышающей регуляции маркеров триплетных у больных раком, показанные на рисунках 2, 7 и дополнительный файл 4 были идентифицированы как альфа дефенсина-1,2,3. Интенсивность разброс участков показывают весьма существенные различия в средних интенсивностей дефенсина и пепсина фрагмента между доброкачественной контроля и рака желудка образцов жидкости (р = 0,003
и 0,00002, соответственно) (рисунок 8). С помощью ELISA специфичен для пепсиногена С, мы подтвердили значительно более низкие концентрации в желудочном соке рака (11,9 ± 0,1 нг /мкг общего белка, среднее значение ± СЭМ п = 6) по сравнению с доброкачественными образцами (21,5 ± 1,4 нг /мкг общего белка п =. 23) в третьем наборе образцов (р = 0,0126
; непарный двухсторонний критерий Стьюдента
). ELISA проводили на том же наборе образцов для уровней дефенсина показали более высокие концентрации в желудочном образцах рака (63,4 ± 9,2 пг /мкг общего белка, среднее значение ± СЭМ п = 6), чем в доброкачественных образцах (46,2 пг /мкг общего белка, среднее значение ± СЭМ п = 23) ((р = 0,0654
; критерий Стьюдента
) .table 1 пептидные последовательности, идентифицированные с помощью MS //MS
Пептид м /г

Последовательность

протеин Match

Mowse † оценка

Mowse оценка со значительной гомологии

2386.29
FLKKHNLNPARKYFPQWKA <бр> Пепсин активацию пептида
35
> 28
2187,12
FLKKHNLNPARKYFPQW
Пепсин активацию пептида
18
> 26
2040,03
LKKHNLNPARKYFPQW <бр> Пепсин активацию пептида
28
> 26
1775,95
FLKKHNLNPARKYF
Пепсин активацию пептида
47
> 26
1628,84
LKKHNLNPARKYF <бр> Пепсин активацию пептида
40
> 28
1880,92
LRTHKYDPAWKYRF
Пепсиноген C активации пептида
31
> 22
† Mowse оценка = -10Log ( P), где P = вероятность того, что совпадение является случайным событием (P &
л; 0,05) м /г
, масса заряда /
Рисунок 6 масс-спектр высокого разрешения фракционированного желудочном соке белков на LWCX30 белковых массива, полученных на QTOF, оснащенного интерфейсом PCI1000. Коробочные пики были подвергнуты анализу фрагментации при столкновении индуцированной диссоциации MS /MS.
Рисунок 7 масс-спектр высокого разрешения желудочной жидкости белков на H50 белковых массива, полученных на QTOF, оснащенного интерфейсом PCI1000. На этом рисунке показаны выше регулируемых маркеров триплетных при раке желудка. Пожалуйста, смотрите Дополнительный файл 4 для полного изображения.
Рисунок 8 графиков разброса значений интенсивности дефенсина и фрагмента пепсина, присутствующих в желудочном жидких образцах доброкачественной контроля и больных раком желудка из обучающего набора.
Обсуждение
Наши данные свидетельствуют о том, что спектральный профиль нефракционированного желудочной жидкости может быть полезным дополнением для диагностики и выявления ранней стадии заболевания раком, в сочетании с клинической гастроскопии. Новые попытки идентификации белковых биомаркеров рака желудка исследовали сыворотку [21-29] и ткани [24, 30-37], и все чаще используется масс-спектрометрии. Более поздние отчеты серологических анализов отдельных известных опухолевых маркеров например CEA, CA 19-9, CA 72-4, CA242 и TAG-72, как правило, имеют низкую чувствительность (&50 Лт;%) [38-41]. Кроме того, существуют значительные кросс-позитивности этих опухолевых маркеров в не рака желудка, например, Уровни поднял CEA и MG7-Ag распространены в колоректального рака, холангиокарциномой, рак поджелудочной железы, и даже у здоровых людей [40, 23]. Не удивительно, что такие опухолевые маркеры сыворотки не имеют признанную роль в желудочном диагностики рака и скрининга, хотя они могут служить в качестве прогностических показателей и ранние маркеры рецидива заболевания следующие гастрэктомии [39, 41, 42].
Мы решили исследовать протеомические профили желудочной жидкости для биомаркеров болезни, потому что это казалось вероятным, что возмущенные секрецию белка желудка при злокачественных и предраковых состояниях, в сочетании с возможным наличием эксфолиативных раковых клеток, может генерировать отличительные протеомические профили. Как и в поиске биомаркеров в сыворотке крови, несколько групп исследовали диагностическую полезность известных опухолевых маркеров в желудочном соке. Ни CEA, ни СА 19-9 позитивности в желудочном соке продемонстрировала точность диагностики [43-46]. Альфа-1-антитрипсина в желудочном соке недавно сообщалось в качестве биомаркеров рака желудка [47, 48].
Наш подход к разработке чувствительного метода для диагностики рака желудка отличается от предыдущих исследований по трем направлениям. Во-первых, мы выбрали биологический образец, который был органоспецифический (т.е. эндоскопически с придыханием желудочного сока), а не системный характер (т.е. в сыворотке крови), полагая, что молекулярные функции будут более вероятно, будут конкретные заболевания. Во-вторых, масс-спектрометрия позволила нам принять объективный подход обнаружения на основе. В-третьих, наши данные генерируются профили нескольких протеомическим маркеров, которые все чаще рассматриваются как имеющие более высокую чувствительность и специфичность, чем одиночных опухолевых маркеров [49, 50]. Для рака желудка, сочетая даже 2 или 3 опухолевые маркеры, достигнутые лучше точность диагностики по сравнению с одной только одного маркера [38, 40].
Белковые отпечатки желудочной жидкости из больных раком желудка показал в общей сложности 106 протеомическим функций, которые значительно выросли - или вниз регулируется (Дополнительные файлы 1 и 3). Два известных маркеров были выбраны для идентификации MS /MS. Пепсиноген А и пептиды активации пепсиногена C были вниз регулируется в желудочном соке, удаленных из желудков с гистологически подтвержденным аденокарциномы. Изучение криостата участков рака желудка также сообщили о значительном понижающую регуляцию пепсиногена С, идентифицированной MS /MS, в опухолевой ткани [51].

• Генетические происхождений желудочных карцином недифференцированные типа проанализированных неконтролиру…
• MIR-146a rs2910164 G /C полиморфизм и желудка, предрасположенность к раку: мета-анализ