Det karakteristiske mavesaft proteom i mavekræft afslører en multi-biomarkør diagnostisk profile

Den karakteristiske mavesaft proteom i mavekræft afslører en multi-biomarkør diagnostisk profil
Abstract
Baggrund
Samlet gastrisk overlevelse kræft forbliver fattige hovedsagelig fordi der er ingen pålidelige metoder til at identificere meget helbredes tidligt stadie sygdommen. Multi-protein profilering af gastrisk væsker, opnået fra den anatomisk sted, patologi, kunne afsløre diagnostiske proteomiske fingeraftryk.
Metoder
Protein profiler blev genereret fra gastriske væskeprøver af 19 mavekræft og 36 godartede gastritides patienter, der gennemgår elektiv, klinisk -indicated gastroskopi hjælp overflade-forstærket laser desorption /ionisering time-of-flight massespektrometri på flere ProteinChip arrays. Proteomisk funktioner blev sammenlignet ved signifikans analyse af microarray algoritme og to-vejs hierarkisk klyngedannelse. En anden blindet prøve sæt (24 gastrisk kræft og 29 klinisk godartede gastritides) blev anvendt til validering.
Resultater
Ved betydning analysyis af microarray, 60 proteomiske funktioner var opreguleret og 46 blev nedreguleret i mavekræft prøver (p
< 0,01). Multimarkør klyngedannelse viste to markante proteomiske profiler uafhængig af alder og etnicitet. Atten af ​​19 cancerpatienter prøver grupperet sammen (sensitivitet 95%), mens 27/36 af ikke-cancer prøver grupperet i en anden gruppe. Ni non-cancer prøver, grupperet med prøver kræft inkluderet 5 præmaligne læsioner (1 adenomatøs polyp og 4 tarm metaplasi). Validering med et andet prøvesæt viste følsomheden og specificiteten til 88% og 93%, hhv. Positiv prædiktiv værdi af de kombinerede data var 0,80. Valgt peptid sekventering identificeret pepsinogen C og pepsin A aktivering peptid signifikant nedreguleret og alpha-defensin så markant opreguleret.
Konklusion
Denne enkle og reproducerbar multimarkør proteomisk assay kunne supplere den kliniske gastroskopisk evaluering af symptomatiske patienter til at forbedre diagnostisk nøjagtighed for mavekræft og præmaligne læsioner.
Baggrund
modsætning til andre almindelige kræftformer, er prognosen for de fleste mavecancerpatienter er fattige og har forbedret lidt over de sidste mange årtier. Femårige overlevelsesrater for mavekræft er betydeligt lavere end alle større kræftformer undtagen kræft i lever, bugspytkirtel og spiserør [1]. I betragtning af, at tidlig stadie mavekræft har en langt bedre prognose (5-års overlevelsen ca. 90%) end fremskreden mavekræft (5-års overlevelsen 3-10%) [2, 3], global dødelighed fra mavekræft burde falde betydeligt ved foranstaltninger, der resulterer i downstaging af tumorer på tidspunktet for første diagnose.
Selvom gastroskopi er den gyldne standard for mavekræft diagnose, dens nøjagtighed er ikke så høj, som den er for benigne gastriske sygdomme som mavesår, især i geografiske regioner af lav til mellemliggende forekomst mavekræft. Procentdelen af ​​ubesvarede diagnose cancer, rapporteret som 4,6%, 14% og endda 33% [4-6], er ikke ubetydelig. Selv i Japan, blev det falske negative sats rapporteret at være 19% [7]. Disse data er i overensstemmelse med den positive prædiktive værdi på kun 0,4 til 0,7 for endoskopisk diagnose af mavekræft i forskellige centre [8-10]. Selvom andelen af ​​ubesvarede diagnoser synes lille, det absolutte antal patienter nægtet fordelen ved diagnosen på en helbredelig fase er ikke ubetydelig. Selv ved en moderat lav falsk positiv diagnose sats på 5%, ville mere end 47.000 gastrisk kræft have været savnet i en lav prævalens land alene (USA) på et enkelt år, 2000 [11]. Endoskopisk vurdering inkluderer ofte slimhinder biopsier, men der er ingen kliniske standarder for enten det optimale antal biopsier eller de anatomiske regioner, som skal stikprøven. Et almindeligt citeret anbefaling er at tage mindst syv biopsier til at diagnosticere korrekt mavekræft [12]. I denne undersøgelse blev imidlertid fuldt 17% af alle læsioner efterfølgende vist sig at være malign anses benign på endoskopi. Således endoskopisk slimhinde undersøgelse lider inter-observatør variation, suboptimal korrelation med histopatologi, svært at opdage submukøse kræft og uhindret visualisering af alle anatomiske underområder f.eks . Efter tidligere gastrisk kirurgi [13, 14]
Gastrisk væske består af en blanding af udskilte opløselige og afstødes cellulære proteiner fra hele maveslimhinden - herunder regioner, kan ikke i tilstrækkelig grad vurderes ved optiske gastroskopi. Vi begrundede derfor, at proteomprofilen af ​​gastrisk væske, som regel betragtet som et affaldsprodukt biprodukt under gastroskopisk undersøgelse, kunne med fordel supplere konventionel klinisk evaluering ved at give en "molekylær biopsi ', der effektivt prøver hele maveslimhinden, især som protein detektionsteknikker sådanne som massespektrometri kan være meget følsomme. Hvis udført i løbet af klinisk indiceret gastroskopi, opnåelse gastrisk væske øger ikke invasiv af proceduren. I modsætning til plasma proteom, mavesaften proteom er sandsynligvis være mindre kompliceret, men beriget med sygdomsspecifikke biomarkører, der genereres direkte på sygdomsstedet. De samme biomarkører, selvom stede i plasma, kan fortyndes ud over grænserne for detektion og blandet med andre mere rigelige systemiske proteiner, der afspejler samtidige patofysiologiske forhold (f.eks komorbide sygdomme), snarere end anatomisk site-specifik sygdom.
vi har undersøgt en hidtil ukendt tilgang til udviklingen af ​​biomarkører for mavecancer ved profilering opløselige udskilte peptider til stede i endoskopisk aspireret mavesaft og proteiner ekstraheret fra eksfolierede epitelceller, også genvundet under endoskopi ved overfladen-forstærket laser desorption-ionisering time-of-flight (SELDI TOF) massespektrometri. Vores resultater tyder på, at flere protein biomarkører fra et organ-specifikke kilde dvs gastrisk væske, generere en karakteristisk mavekræft signatur, fortjener yderligere udvikling som et redskab til at forbedre den diagnostiske nøjagtighed gastroskopi og har potentiale til påvisning tidligt mavekræft og præ-maligne læsioner (tarm metaplasi og dysplasi).
Metoder
Kliniske prøver
gastriske væsker blev opnået under gastroskopi af natten fastet patienterne ses på Singapore General Hospital. Undersøgelsen protokol Den blev godkendt af den etiske komité i Singapores centralsygehus. og var i overensstemmelse med bestemmelserne i Helsinki-deklarationen 1995. Indikationer for gastroskopi var udelukkende klinisk og var uafhængig af undersøgelsen. Indledende analyse blev udført på et træningssæt af 19 prøver fra histologisk påvist gastriske adenokarcinomer (13 intestinal typen, 4 diffus typen, 1 blandet type, 1 ubestemt) [15] og 36 prøver fra patienter med klinisk benigne gastriske betingelser. Gennemsnitsalderen for 19 patienter mavekræft (13 mænd, 6 kvinder, 17 kinesiske, 2 indiske) var 68 år. Fordeling af amerikanske Blandede Udvalg om kræft (AJCC) klinisk iscenesættelse var fase 0 (1 patient), fase I (4 patienter), trin II (2 patienter), fase III (2 patienter) og trin IV (10 patienter). Gennemsnitsalderen for 36 patienter med benigne gastriske betingelser (19 mænd, 17 kvinder, 33 kinesiske, 2 malaysisk, en indisk) var 57 år. Kliniske diagnoser efter endoskopi af patienter uden cancer var normale (9), antral gastritis (9), gastritis (6), ulcus (4), hiatal hernia (3), hyperplastiske polypper (2), Barretts øsofagus (1), fundiske ar (1) og adenomatøs polyp (1).
klassificeringen algoritme udviklet sig fra træningssættet blev testet ved blindet analyse af et validering sæt bestående af en anden 24 histologisk bekræftet gastrisk adenokarcinomer (10 intestinal type, 7 diffus type, en blandet typen, 5 ubestemt, 1 neuroendokrine) og 29 klinisk benigne gastriske prøver. Gennemsnitsalderen for disse 24 patienter mavekræft (18 hanner, 6 hunner, 21 Kinesisk, 3 malaysisk) var 70 år. Fordeling af AJCC klinisk iscenesættelse var trin I (5 patienter), fase II (4 patienter), fase III (2 patienter) og trin IV (12 patienter). En patient i valideringen sæt faldt yderligere undersøgelser og kunne ikke blive afholdt. Gennemsnitsalderen for 29 patienter ikke-cancer (11 mænd, 18 kvinder, 26 kinesiske, 2 indiske, en malaysisk) var 47 år. Kliniske diagnoser efter gastroskopi af patienter uden cancer var gastritis (14), fundiske kirtel polypper (2), akut mavesår (2), duodenitis (2), hiatal hernia (1) og normal (8).
Ingen af mavens kræftpatienter havde modtaget nogen form for kræft behandling på tidspunktet for gastroskopi.
tage uddannelse og validering sager sammen, 19% (8/43) og 29% (19/65) af patienterne med mavekræft og godartede gastriske betingelser, henholdsvis var positive for H. pylori
, en forskel, der ikke var signifikant ved Fishers eksakte test (2-sidet p Drømmeholdet værdi = 0,4508).
Sample indsamling og behandling
Gastrisk væske blev aspireret i en steril beholder ved påbegyndelsen af ​​endoskopi, overdraget anonymiseret kode og øjeblikkeligt anbragt på is. Blod- eller galde-farvede prøver blev afvist. Kun klinisk mistænkelige slimhindelæsioner blev biopsi ved skøn endoscopist. Mavevæsker blev centrifugeret ved 180 g i 6 minutter ved 4 ° C, hvorfra supernatanten igen blev centrifugeret ved 16 100 g i 30 minutter ved 4 ° C. Pellets fra begge centrifugeringer blev kombineret. Højhastighedslinjerne supernatanter blev opbevaret adskilt fra pelletene ved -80 ° C.
Protein profilering
Efter optøning blev 10 pi af hver mavesaft prøve påført på forskellige kemiske overflader af ProteinChip arrays (Ciphergen Biosystems Inc, Californien , USA): (a) kobber (II) immobiliseret Metal Affinity Capture (IMAC3) i nærvær af 100 pi 1 mol /l urea, 1 g /l 3 - [(3-cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propansulfonat ( CHAPS), 0,3 mol /l KCl, proteaseinhibitorcocktail (Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland), 50 mol /L Tris-HCI, pH 7,5; (B) Svag kationbytter (WCX2 og CM10) i nærvær af 100 pi 50 mmol /l natriumacetat, 1 g /l octyl glucopyranosid, proteaseinhibitorcocktail, pH 5; (C) Strong Anion Exchange (SAX2) i nærvær af 100 pi 50 mmol /l Tris-HCI, 1 g /L CHAPS, protease inhibitor cocktail, pH 8; og (d) Hydrophobic Interaction (H50) i nærvær af 100 pi 5 mL /L trifluoreddikesyre. Efter vask med 100 pi af de samme respektive buffere, blev sinapininsyre tilsættes for at lette desorption og ionisering. Spånerne blev analyseret ved SELDI-TOF-MS (PBSII, Ciphergen Biosystems Inc.). Cancere og kontroller blev sammenblandet og gennemføres sideløbende på den samme chip og på flere chips at minimere chip-til-chip variation.
Mavesaften pellets blev resuspenderet i 25 pi 6 mol /l guanidinthiocyanat, 5 g /l octyl glucopyranosid, 0,1 mol /l Hepes pH 7, og 100-200 ml 9 mol /l urinstof, 2 g /l CHAPS, 50 mmol /L Tris-HCI, pH 7,5 ved hvirvelbehandling i 45 minutter ved 4 ° C. Efter centrifugering ved 20 000 g i 5 minutter blev 10 pi af ekstrakten påføres ProteinChip arrays som beskrevet ovenfor.
En retentat kort blev genereret på hvilke individuelle proteiner blev vist som separate toppe på grundlag af deres masse-til-ladningsforhold . Data for proteomik spektre blev analyseret af Ciphergen Express Data Manager Software med Mønster Track og to-vejs hierarkisk klyngedannelse algoritme. Aligned toppe med signal-støj-forhold over 3 blev normaliseret ved total ionstrøm. Proteom funktioner blev yderligere analyseret ved anvendelse af betydning analyse af microarrays (SAM) software fra Stanford University. Pakken er designet til at løse specifikke for microarray data analyse (signal støjforhold varians forskellig fra gen til gen, stort antal datapunkter fra et lille antal prøver) problemer, men vi fandt det at være gældende for proteomisk dataanalyse så godt. Algoritmen af ​​softwaren blev beskrevet af Tusher et al
. [16]. Kort fortalt er det defineret en parameter kaldet den relative forskel for at måle forskellen mellem to eller flere grupper af data i stedet for den p Drømmeholdet værdi. Det anvendte en variation af bootstrapping metode og gentagne gange delte et givet datasæt (spektre indeholdende proteomik-funktioner i denne undersøgelse) tilfældigt i to grupper for at beregne den relative forskel for hver af permutationer. Antallet af permutationer blev sat til at være 1000 i dette studie og softwaren beregnede 1000 relativ difference-værdier for hver proteomisk funktion. Den relative forskel i særlig gruppering af interesse (observeret relative forskel) blev sammenlignet med den gennemsnitlige relative forskel fra alle permutationer (forventet relative forskel) for hver funktion og funktion blev bedømt til at være op- eller nedreguleres efter, om dens observerede relative forskel var større eller mindre end den forventede relative forskel ved nogle tærskel. Softwaren anslået en falsk opdagelse sats (også defineret i reference [16]) for hver tærskelværdi, der er fastsat et indirekte middel til at indstille cutoff. Markørerne identificeret ved denne metode var statistisk signifikante. Den falske opdagelse sats blev sat til at være mindre end 0,05 i denne undersøgelse.
At validere markørerne identificeret af SAM, blev et andet parti af 53 blindede prøver føjet til datasættet for hierarkisk klyngedannelse ved hjælp af Ciphergen Express Data Manager software. Mens de kendte prøver, der anvendes af SAM at vælge markørerne forventedes at klare sig godt i den gruppering, blev blindet prøver medtaget for at teste, hvor godt markørerne generalisere til ukendte prøver. Resultaterne af klyngedannelse var simpelthen sammenlignet med den sande identitet af prøverne og ingen avanceret klassifikation metode eller enhver anden software blev brugt i valideringen.
Biomarker identifikation
gastrisk væske proteiner blev fraktioneret ved anionbytningskromatografi (Q HyperD , Ciphergen Biosystems Inc.) under anvendelse af trinvise ændringer i pH til eluering. Proteiner i 50 mmol /L Tris-HCI, 1 g /l octyl glucopyranosid, blev pH 8 elueringsmidler yderligere oprenset på en kationbytter array (LWCX30) under anvendelse af 50 mmol /l natriumacetat, 1 g /l octyl glucopyranosid, pH 5 som bindende og vaskebuffer. Efter tilsætning af a-cyano-4-hydroxykanelsyre energiabsorberende molekyler (Ciphergen Biosystems Inc.), blev de tilbageholdte proteiner analyseres ved PBSII og Q-TOF (Waters /Micromass) udstyret med en ProteinChip Interface (PCI 1000, Ciphergen Biosystems Inc) . Proteiner blev præget af MS /MS fragmentering og identifikation blev gjort ved databasesøgning med Mascot (Matrix Science Ltd., London, UK).
Biomarker validering
Denne blev udført i et tredje sæt af gastriske væskeprøver taget fra godartet gastriske og gastriske kræftpatienter. Hver nylig opsamlet prøve blev behandlet for at fjerne fast affald og at koncentrere proteinindholdet som følger. Efter tilsætning phenylmethansulfonylfluorid til en slutkoncentration på 0,2 mM, blev prøven centrifugeret i 15 minutter ved 500 g og 4 ° C. Proteaseinhibitorer (Complete Mini ™, Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA) blev tilsat til supernatanten efterfulgt af centrifugal membranfiltrering ved 2 900 g og 15 ° C (Amicon Ultra-4 centrifugal filteranordning, 5 000 nominel molekylvægt grænse; Millipore, Billerica, MA, USA), indtil prøven blev reduceret til 10 - 20% af dens oprindelige volumen. Total proteinkoncentration blev bestemt ved 2-D Quant Kit (Amersham Biosciences, Pisctaway, NJ, USA). Pepsinogen C og alfa-defensin 1-3 blev bestemt ved enzymkoblet immunassay (ELISA) under anvendelse af kits fra Alpco Diagnostics (Salem, NH, USA) og Hycult bioteknologi B.V. (Uden, Holland), hhv. Hver behandlet prøve blev analyseret dobbelt for pepsinogen C og defensin niveauer ved hjælp leverandørens protokoller. Prøver til pepsinogen C assay blev præ-fortyndet 120 gange. Koncentrationer af pepsinogen C og alpha-defensin 1-3 blev afledt ved henvisning til deres respektive standardkurver og udtrykt som ng (pepsinogen C) eller pg (defensin) pr mikrogram total gastrisk væske protein.
Helicobacter pylori
tilstedeværelsen af ​​H. pylori
i mave væv blev identificeret ved visualisering af spiralformede mikroorganismer i histologiske sektion og /eller ved immunhistokemi. Fire-mikron vævssnit blev afvokset i xylen og faldende kvaliteter af ethanol. Antigen-genvinding var ved opvarmning i citratbuffer, pH 6,0. Det primære antistof mod H. pylori
(1:50 fortynding; DAKO A /S, Glostrup, Danmark) blev efterfulgt af det sekundære antistof polymer link (Envision Chem Mate, DAKO) og fremkaldes med diaminobenzidin som chromogen
. Resultater
Flere op- eller nedreguleret protein biomarkører i gastrisk kræft blev opdaget i gastrisk væske. Et repræsentativt proteom kort over mavesaft er vist i figur 1. Det er en gel afbildning af et massespektrum viser mavesaft proteiner selektivt bundet til immobiliseret kobber (II) metalion i molekylvægtsområdet på 1500 Da til 6000 Da. Væsentlige proteinmarkører fundet at være nedreguleret i cancer mavesaft (p
< 0,01) er angivet med pile. Figur 1 Ekspression forskel kort over mavesaft på kobber (II) immobiliseret metal affinitetsindfangning ProteinChip array (IMAC3). Pile angiver protein biomarkører markant forskellige i ekspressionsniveauet mellem de to grupper af prøver.
En repræsentativ proteom kort over mavesaft pellet ekstrakt er vist i figur 2. Proteiner blev selektivt bundet til en kationbytter-array overflade. Væsentlige proteinmarkører fundet at være op- eller nedreguleret i gastrisk cancer fluid pellet (p
< 0,01) er angivet med pile. Figur 2 Ekspression forskel kort over mavesaft pellet ekstrakt på kationbytning ProteinChip array (WCX2). Pile angiver protein biomarkører markant forskellige i udtryk niveau mellem de to grupper af prøver
Gennemsnitlig CV. (Variationskoefficient, kumulative i 10-15 store mavesaft toppe pr spektrum, n = 8) for immobiliseret kobber (II) ProteinChip vifte (IMAC3) var 12,8%, for kationbytning array (WCX2) blev 15%, for anionbytter array (SAX2) var 17,3%, og for hydrofob interaktion chip (H50) blev 13,6%. Disse CV værdier er i overensstemmelse med reproducerbarhed vurdering i SELDI litteraturen [17, 18].
Af Sam analyse af alle proteom funktioner (samlet antal funktioner 41 800, gennemsnitlige antal pr retentat map 314) i gastrisk væske og pellet ekstrakt blev 46 proteomiske funktioner fundet at være signifikant nedreguleret i mavekræft og 60 proteom funktioner var markant opreguleret i mavekræft. (Data fra forskellige forhold, fx væske og pellet samt forskellige overflader, blev simpelthen aggregeret sammen som adskilte funktioner til SAM. Markers rapporteret af SAM i både pellet og supernatant fraktioner blev manuelt identificeret og udgjorde kun en gang i listen, efter at de var anses biologisk signifikant). Markant nedreguleret markører omfattede 1884, 2428, 2594, 2840, 4050, 11720, 13700 Da; betydeligt opreguleret markører omfattede 1761, 1831, 3372, 3443, 3605, 5160, 6780 Da. (De fleste af de væsentlige markører blev opdaget på WCX2 og IMAC-kobber (II), efterfulgt af SAX2). Baseret på de 106 væsentligt forskellige proteom funktioner (Ekstra fil 1), blev to-vejs hierarkisk klyngedannelse analyse (todimensional komplet binding) udføres. De fleste af de gastriske kræfttilfælde blev grupperet sammen til dannelse af en karakteristisk gruppe (figur 3 og yderligere fil 2). Principalkomponentanalyse af de samme data viste også, at cancer og godartede prøver kunne godt adskilt i to grupper, med 2 falske negative (der repræsenterer to analyser af samme sag) og 9 falske positiver, henholdsvis (figur 4). En mavekræft fluidprøve (fra et tilfælde af trin I dårligt differentieret gastrisk adenocarcinom) grupperet blandt prøver, der ikke kræft; alle de andre fire tidlige fase (trin 0 og I) patienter korrekt grupperet med prøver fra 14 patienter med stadie II - IV mavekræft, hvilket giver en samlet diagnostisk sensitivitet på 95% (18/19 gastric cancerpatienter) på træningssættet. Figur 3 Expression forskel kort over gastrisk væske og pellet ekstrakt proteiner af træningssæt prøver på fire ProteinChip arrays, der vises i to-vejs hierarkisk klyngedannelse. Væsentlige proteom funktioner vises lodret. Intensiteten af ​​gråtoner angiver graden af ​​relativ proteinniveau, højere eller lavere end medianværdien. Patient tilfælde præsenteres vandret; fleste gastriske kræftpatienter er tæt klynge. Denne figur viser den øverste kvartil af det fulde billede (se Ekstra fil 2 for det fulde billede).
Figur 4 Principal komponent analyse plot af proteomiske funktioner i træning sæt prøver. En enkelt plan (angivet med den sorte linje) opdeler prøverne i to grupper med en falsk negativ (vist i duplikerede pletter) og 9 falske positiver.
Ni af 36 ikke-kræft prøver i træningssættet grupperet med kræft prøver (specificitet 75%). Af disse, 1 havde en dysplastiske adenomatøs polyp - en præcancerøse læsion [19]. Blandt de øvrige 8 patienter, havde 6 klinisk rettet biopsier, der afslørede intestinal metaplasi hos 4 patienter (67%). Otte ikke-cancer patienter, hvis mavesaft proteinprofiler grupperet i den normale gruppe havde også klinisk rettet mucosale biopsier, der viste intestinal metaplasi i kun 2 patienter (25%). En gennemgang af 1000 på hinanden følgende gastriske biopsier udføres for alle indikationer viste en generel forekomst af intestinal metaplasi i Singapore General Hospital i undersøgelsesperioden på 30%. Dette står i kontrast med forekomsten af ​​mindst 67% af intestinal metaplasi blandt klinisk godartede tilfælde hvis proteomiske profiler klynger tættere sammen med gastrisk kræfttilfælde end med andre raske, i overensstemmelse med tarm metaplasi er en mellemtilstand i overgangen normal gastrisk epitel til gastrisk adenocarcinom . Nøjagtig identifikation af intestinal metaplasi ved endoskopi er kendt for at være unøjagtige [20]. Således er en gastrisk cancer-typen proteomisk fingeraftryk er muligvis en følsom indikator for tilstedeværelsen af ​​denne præmaligne læsioner blandt patienter klinisk diagnosticeret som havende benigne gastriske lidelser.
Gastric kræftpatienter i træningssættet var væsentligt ældre (gennemsnitsalder 67,7 år) end patienter med benigne gastriske betingelser (gennemsnitsalder 56,6) (p
= 0,0062). For at løse den mulighed, at protein-profiler var relateret til alder eller etnisk tilhørsforhold, vi re-analyseret data for den delmængde af kinesiske patienter over 55 år. Dette resulterede i 1/17 kræftformer forkert klassificerede (den samme tumor, der blev fejlklassificeres når alle 19 kræftformer blev analyseret, følsomhed 94%) og 4/17 kontroller forkert klassificerede (de samme 4 kontroller, der var blandt de 9 forkert klassificerede godartede tilfælde, specificitet 76,5%) .
Vi næste testede de faktiske resultater af proteomiske profiler i skelne kræft fra godartede prøver i en anden serie af 53 blindede gastrisk væske og pellet ekstrakt prøver (24 gastrisk kræft og 29 benigne gastriske lidelser) (Ekstra fil 3). Enogtyve af 24 gastrisk kræft blev identificeret korrekt (følsomhed 88%) og 2 af 29 godartede prøver blev fejlagtigt klassificeret (specificitet 93%) (figur 5). Figur 5 Expression forskel kort over gastrisk væske og pellet ekstrakt proteiner af validering sæt prøver på fire ProteinChip arrays, der vises i to-vejs hierarkisk klyngedannelse. Væsentlige proteom funktioner vises horisontalt. Intensiteten af ​​de røde eller grønne farver angiver graden af ​​relativ proteinniveau, højere eller lavere end medianværdien. Patient tilfælde præsenteres lodret; fleste gastriske kræftpatienter er tæt klynge.
Selected proteom markører (baseret på signifikans score bestemmes af SAM) blev semi-oprenset på ProteinChip arrays og identificeres direkte på pletter ved kollision-induceret dissociation sekventering (figur 6). Flere af de betydeligt nedreguleret markører hos cancerpatienter er vist i figur 1 og 2, 1881,9 Da, 2041,0 Da, 2188,1 Da og 2387,3 Da, blev identificeret til at være pepsinogen C og pepsin A aktivering peptidfragmenter (tabel 1). De op-reguleret triplet markører i kræftpatienter vist i figur 2, 7 og ekstra fil 4 blev identificeret til at være alfa defensin-1,2,3. Intensitet scatter plots viser meget betydelige forskelle i de gennemsnitlige intensiteter af defensin og pepsin fragment mellem godartede kontrol og gastrisk kræft væskeprøver (p
= 0,003 og 0,00002 hhv) (figur 8). Anvendelse af ELISA specifik for pepsinogen C, bekræftede vi væsentligt lavere koncentrationer i mavekræft væsker (11,9 ± 0,1 ng /ug totalt protein; middelværdi ± sem n = 6.) sammenlignet med benigne prøver (21,5 ± 1,4 ng /ug totalt protein n =. 23) i et tredje prøvesæt (p
= 0,0126; Students uparrede to-halet t
test). ELISA udført på samme prøve sæt til defensin-niveauer viste højere koncentrationer i gastrisk cancer prøver (63,4 ± 9,2 pg /pg totalt protein; middelværdi ± sem n = 6) end i benigne prøver (46,2 pg /pg totalt protein; middelværdi ± sem n = 23) ((p
= 0,0654; Students t
test) .table en Peptidsekvenser identificeret af MS //MS
Peptide m /z
Sequence
Protein match
Mowse † score
Mowse score med signifikant homologi
2386,29
FLKKHNLNPARKYFPQWKA
Pepsin En aktivering peptid
35
> 28
2187,12
FLKKHNLNPARKYFPQW
Pepsin En aktivering peptid
18
> 26
2040,03
LKKHNLNPARKYFPQW
Pepsin En aktivering peptid
28
> 26
1775,95
FLKKHNLNPARKYF
Pepsin En aktivering peptid
47
> 26
1628,84
LKKHNLNPARKYF
Pepsin En aktivering peptid
40
> 28
1880,92
LRTHKYDPAWKYRF
Pepsinogen C-aktivering peptid
31
> 22
† Mowse score = -10Log ( P), hvor P = sandsynligheden for, at kampen er en tilfældig hændelse (P
< 0,05) m /z
, masse /opkræve
Figur 6 Højopløsningsmassespektrum spektrum af fraktionerede mavesaft proteiner på LWCX30 ProteinChip vifte opnået på en QTOF udstyret med en PCI1000 interface. Boxed toppe blev underkastet fragmentering analyse ved kollision-induceret dissociation MS /MS.
Figur 7 Højopløsningsmassespektrum spektrum af mavesaft proteiner på H50 ProteinChip matrix opnået på en QTOF udstyret med en PCI1000 interface. Denne figur viser de op-regulerede triplet markører i mavekræft. Se Supplerende fil 4 for det fulde billede.
Figur 8 Scatter plots af intensitetsværdier for defensin og pepsin fragment til stede i mavesaft prøver af godartet kontrol og gastrisk cancer patienter fra træningssættet.
Diskussion
Vores data tyder på, at den spektrale profil ufraktioneret gastrisk væske kunne være et nyttigt supplement til kræft diagnose og påvisning af tidlig stadie sygdommen, når den kombineres med klinisk gastroskopi. Seneste forsøg på at identificere protein biomarkører for mavekræft har undersøgt serum [21-29] og væv [24, 30-37], og har i stigende grad anvendt massespektrometri. Ældre rapporter om serologiske assays af individuelle kendte tumormarkører fx CEA, CA 19-9, CA 72-4, CA242 og TAG-72, har generelt lav følsomhed (< 50%) [38-41]. Desuden er der betydelig cross-positivitet af disse tumormarkører i ikke-gastriske cancere fx hævet CEA og MG7-Ag-niveauer er almindelige i colorektal cancer, cholangiocarcinom, pancreatisk carcinom, og selv i raske kontroller [40, 23]. Ikke overraskende sådanne serum tumormarkører har nogen etableret rolle i gastrisk cancer diagnose og screening, selv om de kan tjene som prognostiske indikatorer og tidlige markører for tilbagevendende sygdom følgende gastrektomi [39, 41, 42].
Vi valgte at undersøge proteom profiler af gastrisk fluid til sygdomstilstande biomarkører fordi det syntes sandsynligt, at perturbed gastrisk proteinsekretion i maligne og præmaligne tilstande, kombineret med den mulige tilstedeværelse af eksfolierede cancerceller, kunne generere karakteristiske proteomiske profiler. Som i søgningen efter serum biomarkører har adskillige grupper undersøgt den diagnostiske anvendelighed af kendte tumormarkører i mavesaft. Hverken CEA eller CA 19-9 positivitet i mavesaft har vist diagnostisk nøjagtighed [43-46]. Alfa-1-antitrypsin i mavesaft er for nylig blevet rapporteret som en gastrisk kræft biomarkør [47, 48].
Vores tilgang til udvikling af en følsom metode til mavekræft diagnose adskilte sig fra tidligere undersøgelser på tre måder. Først valgte vi en biologisk prøve, der var organ-specifikke (dvs. endoskopisk aspireret gastrisk væske) snarere end systemisk (dvs. serum), ræsonnement, at de molekylære funktioner mere sandsynligt ville være sygdomsspecifikke. For det andet, massespektrometri muligt for os at tage en fordomsfri opdagelse tilgang. For det tredje, genereret vores data profiler af flere proteom markører, der i stigende grad anses for at have højere følsomhed og specificitet end enlige tumormarkører [49, 50]. For mavekræft, der kombinerer endda 2 eller 3 tumormarkører opnået bedre diagnostisk nøjagtighed i forhold til en enkelt markør alene [38, 40].
Protein fingeraftryk af gastrisk væske fra mavecancerpatienter viste i alt 106 proteom funktioner, der var markant op - eller dun-reguleret (Ekstra filer 1 og 3). To fremtrædende markører blev udvalgt til identifikation ved MS /MS. Pepsinogen A og pepsinogen C aktivering peptider blev nedreguleret i gastriske væsker fjernet fra maver med histologisk bekræftet adenokarcinomer. En undersøgelse af cryostatsnit af mavekræft har også rapporteret signifikant nedregulering af pepsinogen C, identificeret ved MS /MS, i tumorvæv [51].

• Genetiske slægter af udifferentieret-gastriske carcinomer analyseret af ukontrollerede gruppering af genomisk DNA microarray data
• MIR-146a rs2910164 G /C polymorfi og gastrisk kræft modtagelighed: en meta-analyse