Vrednotenje prehoda Lactobacillus gasseri K7 in bifidobakterij iz želodca na črevesju uporabo modela enotnega reaktorja

Vrednotenje prehoda Lactobacillus gasseri
K7 in bifidobakterij iz želodca v črevesje z uporabo enega samega reaktorja modela
Abstract
Ozadje
probiotičnih bakterij, so mislili, da igrajo pomembno vlogo v prebavnem sistemu in imajo zato da preživi prehod iz želodca v črevesje. V zadnjem času so razvili nov pristop za simulacijo prehod iz želodca v črevesje v enem bioreaktorju. Prednost tega avtomatiziranega enega reaktorskega sistema je bila sposobnost preizkusiti vpliv kisline, soli žolčnih kislin in pankreatin.
Lactobacillus gasseri
K7 je sev izoliran iz začetnih fekalij z lastnostmi izdelavo seva zanimivo pri proizvodnji sira. V tej študiji je bila enotna reaktor sistem, ki se uporabljajo za ocenjevanje preživetje L. gasseri
K7 in izbranih bifidobakterij iz naše kolekcije skozi želodec, črevo prehodom.
Rezultati
Začetno presejanje za odpornost na kisline v kislo kulturi mediji pokazala nizko toleranco Bifidobacterium dentium
za to stanje, ki kaže nizko stopnjo preživetja v prehodu. Podobni rezultati so bili doseženi z B. longum
subsp. infantis
ker B. animalis
subsp. lactis
imel visoko preživetje.
Ti prvi rezultati so bili potrjeni v modelu bioreaktorja v trebuhu, črevesa prehodom. B. animalis
subsp. lactis
imela najvišjo stopnjo preživetja (10%) doseže približno 5 × 10 6 cfu ml -1 primerjavi z drugimi testiranih sevov bifidobakterij, ki so se zmanjšale s faktorjem do 10 6 . Lactobacillus gasseri
K7 je manj odporna kot B. animalis
subsp. lactis
vendar preživela pri koncentracijah celic približno 1000-krat višja od drugih bifidobakterij.
Zaključek
V tej študiji, so bili sposobni pokazati, da je imel L. gasseri
K7 visoko stopnjo preživetja v stomach- smo črevo prehod. S primerjavo rezultatov s prejšnje študije pri pujskih, da bi lahko potrdili zanesljivost naše simulacije. Testiranih sevov bifidobakterij, le B. animalis
subsp. lactis
pokazala sprejemljivo preživetje za uspešen prehod v sistem simulacije.
Ozadje
probiotike, bakterije predvsem mlečnokislinske imajo koristne učinke na zdravje potrošnikov, kot je predlagano v 1907 [1]. Bilo je verjel, da bakterije večinoma pod nadzorom okužb, ki jih črevesnih povzročiteljev bolezni in urejenem toxoaemia povzroča, s čimer se izboljša zdravje in vplivanja na smrtnost. Medtem je bilo znano, da so nekatere pozitivne učinke na zdravje potrošnikov izboljšanje ravnovesja mikroflore v črevesju, stimulacija imunskega sistema ter pomoč organizem za boj proti patogene mikroorganizme [2]. Velik del interesa je osredotočena na uporabo sevov iz rodov Lactobacillus
in Bifidobacterium
, čeprav obstajajo tudi druge bakterije z probiotičnih učinkov, npr nekaj propionibacteria.
Omenjene lastnosti so tudi osnova, da mikroorganizem, je treba označiti probiotik. Obstajajo različne definicije po vsem svetu, vendar so podobno vsebino. Eno od meril za probiotični sev je njegova odpornost na kisline in želodčnih rešitev v traktu človeškem prebavnem [3]. Zato je pomembno, da se oceni odpornosti potencialnega probiotični sev v kislem in želodca okolje v črevesju.
Zaradi visokih stroškov in etične kot tudi varnostnih predpisov za kliničnih študijah, pregledovanje preživetje je lažje za simulacijo in vitro
. Preprost test inkubiramo bakterijske celice v kislih ali žolčnih raztopinah soli za določeno obdobje in štetje števila preživelih celic. V naslednjem koraku je simulacija izvedena v mešalnih stekleničkah, ki združuje kislost in želodčnih rešitve sledi z oceno preživetja celic skozi celotno simulacijo. To je bolj realistična imitacija pogojev v črevesu [4]. Drug sistem, simulator za humano črevesnih mikrobno ekosistem (Šimej), sestavljena iz 5 do 6 zaporedno priključenih pH pod nadzorom bioreaktorjih [5-7]. Za namestitev je precej zapletena in zahteva absolutno anaerobnih pogojih. Poleg tega je absorpcija presnovkov in vode ne simulirajo. To smo premagali s pomočjo membran, kot ga Marteau sod
opisano. [8]
V zadnjem času so razvili nov sistem z enim samim bioreaktor za študij v želodcu-črevesja prehod v. [9]. Sistem dovoljeno pH naj se spremeni znotraj samega reaktorja in je bil prilagojen zadrževalni časi v različnih regijah želodec, črevo prehodom.
Lactobacillus gasseri
K7 je bil pred kratkim izolirali iz začetnih blatu [10]. Daje bakteriocin, ki je aktivno proti Clostridium
sp. in njihove spore. L. gasseri
spada v tako imenovane "acidophilus"-skupino in številne neodvisne študije identificirati teh sevov kot prebivalci kože in črevesja [11-13]. V prejšnjih poskusih, ki jih je že bilo dokazano in vitro
da L. gasseri
K7 preživela v kislem okolju in z 0,3% žolčnih soli [10]. Te ugotovitve, da sev zanimivo kot možni probiotik.
V tej študiji je enoten bioreaktor sistem, ki temelji na delu Sumeri et al
. [9] je bila uporabljena za oceno preživetja Lactobacillus gasseri
K7 in osem Bifidobacterium
sevov iz naše kolekcije. Smo lahko primerjali rezultate za L. gasseri
K7 z študiji pri pujskih [14], kar je omogočilo oceno korelacije med študijo in vitro
z rezultati iz in-vivo
eksperimentov .
so časi hrambe in pH, ki se uporabljajo v tej študiji, ki temelji na podatkih iz literature. obstaja več metod za merjenje pH v črevesju [15]. Tabela 1 prikazuje vrednosti pH v različnih delih črevesja, kot merjeno s kapsulo Heidelberg [16, 17]. Retencijski časi se lahko izračuna z uporabo označevalne snovi (kemijske) ali preko radijskih telemetrijo kapsul, kot so Heidelberg
kapsule [18]. Vendar kapsule imajo običajno daljši čas zadrževanja od kemičnih markerjev. Tabela 2 navaja nekaj časa hrambe najdemo v literaturi [4, 5, 19-24] .table 1 pH vrednosti v človeškem prebavnem traktu, merjena s Heidelberg
kapsulo.

trebuhu
Dvanajstnik
jejunum
ileuma
bližnji
medial
Distalno
pH
1,4 **
6,22 *
6.4 **
7,1 **
7.4 **
* Fallingborg et al
. 1994 [16]
** Fallingborg et al
. 1998 [17]
Tabela 2 Retencijski časi v tankem črevesu, navedenem v literaturi. Čas
Hramba
vir
Opombe

1-4 h
Huang in Adams 2004 [21]
4.25 h
Van Den Driessche et al
. 2000 [24]
želodec in tanko črevo
4 h
Mojaverian 1996 [22]
6 ur
Picot in Lacroix 2004 [4]
Izbrano maksimalni čas simulacije
7,5 h
Fallingborg et al
. 1990 [20]
Otroške
8 h
Fallingborg et al
. 1989 [19]
8 h
Alander et al
. 1998 [5]
Simulacija v Šimej reaktor
6-10 h
Thews et al
. 1991 [23] primerjavo na podlagi podatkov, ki jih najdemo v literaturi in dela, ki ga Sumeri et al
. [9] proces fermentacije je bila ustanovljena kot je opisano v Materiali in metode, ki je prikazan na sliki 1. Slika 1: Parametri za prehod simulacije želodcu, črevesne več kot 7 ur.
Rezultati
odpornosti Acid presejalni
Namen začetnega serije testov je bil, da dobimo pregled odpornosti kisline osmih sevov bifidobakterije. Sliki 2, 3 in 4 prikazujeta preživetje teh sevov uporabo konturna parcel, narejene s Sigmaplot. Bifidobacterium dentium
(slika 3) je pokazala najmanj odpornost kisline. Med pH 4,0 in pH 2,0 ni bilo razlike v preživetju in koncentracija celic zmanjšalo za več kot 7 dnevnika v 40 minutah. Bifidobacterium animalis
subsp. lactis
je bolj odporna do 40 minut pri pH 2,0, nato pa zmanjšala za približno 3 log ko inkubirali 120 minut (Slika 4). Pri pH med 2,5 in 3,0 padec je bil manjši od 1 log po 120 minutah. Slika 2 kislina odpornost trem sevom Bifidobacterium longum. X-os: čas (min); Y-os: pH; log cfu so prikazane v barvi (lestvica na desni strani grafov). Številke v bakterijskih imena so sev številke v FAM-podatkovno bazo ALP.
Slika 3 Acid odpornost Bifidobacterium dentium, B. longum subsp. infantis in B. adolescentis. X-os: čas (min); Y-os: pH; log cfu so prikazane v barvi (lestvica na desni strani grafov). Številke v bakterijskih imena so sev številke v FAM-podatkovno bazo ALP.
Slika 4 Acid odpornost Bifidobacterium breve in B. animalis subsp. lactis. X-os: čas (min); Y-os: pH; log cfu so prikazane v barvi (lestvica na desni strani grafov). Številke v bakterijskih imena so sev številke v FAM-podatkovno bazo ALP.
Vsi ostali testirani Bifidobacterium
sevi (B. longum, B. breve, B. longum
subsp. Infantis in B. adolescentis
) je podobno, vendar drugačen vzorec od B. animalis
subsp. lactis
(slike 2, 3 in 4). Imeli kratek čas preživetja pod pH 2,5 in preživela v večjem številu in pH nad 3,5.
Z namenom razviti metodo za simulacijo GI v bioreaktorju, je še test opravi z enim pritiskom. Opazovati vpliv matrike hrane, koncentrirana B. longum
subsp. infantis
smo resuspendirali v posnetega mleka pred inokulacijo v kislih raztopin. Kot je prikazano na desnem stolpcu sliki 5, so imeli mleko neposreden učinek na preživetje seva. Med pH 3,0 in 3,5 bakterije so preživeli 120 min z zmanjšanjem dnevnik 2. Pod pH 3,0 stopnja preživetja znižal na okoli dnevnik 5. zmanjšanje preživetja pod pH 3,0 je bil hiter, vendar redno v daljšem časovnem obdobju. Pri pH 3,5 in zgoraj, je sev odporen najmanj 120 minut. Slika 5 Primerjava odpornosti kisline Bifidobacterium longum subsp. infantis 14.390 suspendiran v NaCl ali posnetega mleka. Levo: Bifidobacteria resuspendirali v NaCl, desno: Bifidobacteria resuspendirali v mleku. X-os: čas (min); Y-os: pH; log cfu so prikazane v barvi (lestvica na desni strani grafov). Številke v bakterijskih imena so sev številke v FAM-podatkovno bazo ALP.
Levi stolpec na sliki 5 prikazuje isti sev brez dodanega posnetega mleka. Pri pH nad 3,5, ni bilo vpliva na preživetje bakterij. Vendar pod pH 3,5 preživetje zmanjšala glede na trajanje inkubacije. PH med 3,0 in 3,5 je sev že zmanjšali za približno log 5. Po 30 minutah inkubacije, je bil skoraj linearno znižanje preživetje z zmanjšanjem pH od 3,0 do 2,5.
Simulacija v bioreaktorju
Večina sistemov je opisano v literatura sestavljena iz več reakcijskih posod, npr Šimej [6]. Druge študije se uporablja imobilizirane celice treh reaktorjih [25] ali dializnega sistema [8]. Na podlagi dela Sumeri et al
. [9] in zbrani podatki o razmerah v črevesni prehod nam je uspelo omejiti simulacijo na eno plovilo. Skupaj s podatki iz presejanja kislinske odpornosti, se lahko izbere izbor morebitnega začetnega pH in brozge sestavka v simulatorju. Dobljene parametri simulacij so prikazani na sliki 1 in opisana v materialu in metodah odseku. V poskusni fazi te študije, Sumeri et al
. [9] razvila podoben sistem za vrednotenje Lactobacillus
sp. simulacije v želodec, črevesje prehod.
programski paket "Lucullus" je bil odlično orodje za nadzor pH in postopka po razvitem simulacijo. Izbiro medija v bioreaktorju je bila poenostavljena z izbiro ustreznega medija za rast sevov, dopolnjen z posnetega mleka, ki deluje kot simulirano hrano matrici. Nato se je nakisamo na začetni pH in dopolni z encimsko rešitvami, kot je opisano v materialih in metodah. Simulacije so bile izvedene serijsko, eno na dan. Rezultati so prikazani na sliki 6. sevi uporabljeni za simulacijo so navedene v tabeli 3 (zgolj Bifidobacterium dentium
bil izključen) in so bile standardizirane na OD 650 1,5 pred inokulacijo. Slika 6 Razvoj 7 Bifidobacterium sevov med želodčno-črevesnih prehod simulacije za 7 ur. Črtkana črta prikazuje čas dodajanja soli žolčnih kislin in sokov trebušne slinavke. Številke v bakterijskih imena so sev številke v FAM-podatkovno bazo ALP.
Tabela 3 preizkušene v simulaciji Sevi.
Name
Identifikacijska številka ALP zbiranja seva
Bifidobacterium adolescentis
FAM-14377
Bifidobacterium breve
FAM-14398
Bifidobacterium longum
subsp. infantis
FAM-14390
Bifidobacterium animalis
subsp. Lactis
FAM-14403
Bifidobacterium dentium
FAM-14396
Bifidobacterium longum
FAM-14382, -14.383, -14.406
Lactobacillus gasseri
K7
FAM-14459
Bifidobacterium adolescentis
smo nacepili, kot je opisano zgoraj pri začetni koncentraciji od 10 7 cfu ml -1 in zmanjšala skoraj linearno pod 10 4 cfu ml -1 po 5 urah. B. breve
in B. longum
sevi so imeli začetno koncentracijo med 10 7 in 10 8 cfu ml -1 in zmanjšana na manj kot 10 2 cfu ml -1 v prvih 30 minutah. B. animalis
subsp. lactis
14403 preživela približno 15% začetne povprečne cfu 5 × 10 8 cfu ml -1. Opaziti je bilo hitro znižanje preživetje B. longum
subsp. infantis
v prvih 30 minutah. Nato preživetje zmanjšala le počasi od 10 5 do 10 4 cfu ml -1.
V kasnejši fazi, Lactobacillus gasseri
K7 bila vključena v raziskavo, saj je več projektov je bilo tekmovanje v teku v tem času na našem inštitutu s tem sevom. Lactobacillus gasseri
K7 smo nacepili na 2,2 x 10 7 cfu ml -1 in po 7 h simulacijo koncentracijo 10 5 cfu ml -1 živih celic je bil še vedno prisoten v gojišče (slika 7, krivulja 250 ml predhodno kulture). Najvišje znižanje preživetje je v prvih 2 urah in začeli takoj po dodajanju želodčnih sokov in žolčne soli. V tem času je bilo zmanjšanje živih celic po dnevniku 2. V preostalem času simulacije, je bil samo zmanjšanje log 1 živih celic. Slika 7 Primerjava vplivom 100 ml predhodno kulture Lactobacillus gasseri K7 z 250 ml pred-kulturi. Predhodno Kulturo smo požanjemo s centrifugiranjem in ponovno suspendirali v fiziološki raztopini natrijevega klorida, da se doseže OD600 1,5. Prehod simulacija želodec trakta je bila inkubirana z uporabo prilagojene rešitve in inkubirali 7 ur. Prekinjena črta prikazuje dodajanje soli žolčnih kislin in sokov trebušne slinavke. Krivulje so srednja podvojenih eksperimentov.
Pripravo inokuluma L. gasseri
K7 obsega gojitvenem 100 ml je bila ocenjena tudi. Rezultati poskusov so prikazani na sliki 7. Z 250 ml kulture zmanjšanje živih celic je bil približno log 2 ker se je zmanjšalo s 100 ml kulture samo log 1 po celotni inkubacijskega časa. Vendar, 2 h po dodatku soli žolčnih kislin in sokov trebušne slinavke, je bila podobna za obe obsega zmanjšanje števila celic.
Razprava
Pri žetvi kulture po določenem času inkubacije, lahko fazo rasti vsakega bakterijskega seva drugačna, saj vsi imajo različne dinamike rasti. Da dobimo celice na približno isti fazi rasti, smo izvedli predhodne poskuse (podatki niso prikazani). Čas na inkubacija 15 h za pred-kulturi, je primerna za vse testirane seve razen Bifidobacterium longum
subsp. infantis
ki je bilo potrebno inkubirana samo za 12 ur.
kisline toleranco presejalni (sliki 2, 3 in 4) je bila izvedena za ovrednotenje učinka pH neodvisno od drugih pogojev. Bifidobacterium dentium
je zelo občutljiv na kisline in zato morda ne bi preživeli prehod skozi želodec. Sev zato ni bila vključena v simulacijskih poskusov. B. longum
sevov (Slika 2) ni prineslo veliko boljše rezultate kot B. dentium
(slika 3). Vendar pa blizu pH 4 so bili bolj odporni kot B. dentium
.
B. longum
subsp. infantis
je ena izmed prvih vrst, da zapolnijo človeško črevo kmalu po rojstvu [26]. Temeljijo na poskusih v tej raziskavi pa je testirana B. longum
subsp. infantis
sev bi mogli prenesti želodec dojenčkov v velikem številu le, če je bil čas prehoda v kislem želodcu zelo kratek. Preživetje izbranega seva v testirane okolju je bila prenizka za uspešen prehod v velikem številu. Ko je sev resuspendiramo v posnetega mleka, preživetje večja (slika 5). To bi lahko bil znak, da človeško mleko pomaga, B. longum
subsp. infantis
sevi, da prenese želodec, črevesje prehod na z na višjo stopnjo preživetja.
zaščitne učinke mlečnih beljakovin v prebavnem sistemu so že bili opisani v literaturi [27]. Zaščita z mlečnimi proteini Pokazalo se je tudi v tej študiji (slika 5). Ob ustreznem matriksu ali celo prevoznika, lahko probiotične bakterije varno potuje skozi želodec v črevesje, da dosežejo svoje mesto delovanja.
B. adolescentis
sevi, ki zapolnijo človeško črevo v kasnejši starosti, je imela nekoliko večjo odpornost kot B. longum
subsp. infantis
ki lahko pojasni zmanjšanje slednjih med potekom človeškega dojenčka v odraslost [26].
Najbolj zanimivo sev je bil B. animalis
subsp. lactis
, ki je bil najmanj občutljiv sev v naši raziskavi. Ta pH-odporen sev ima velik potencial za uporabo v živilih, kot probiotični dodatek od večjega števila bakterijskih celic bi preživeli prehod. Vendar pa je za uporabo tega seva kot probiotik, več študij je treba opraviti, da bi dosegli probiotični stanje v skladu z opredelitvijo Klaenhammer [3].
V naši raziskavi, je zaužitje matrike hrane simulira v začetni okolje fermentiranih mlečnih izdelkov in gojišču. Dodana Simulirana želodčna raztopino in kisik v fazi želodcu poveča stres. Med simulirano prehodom v tankem črevesu je kisik nadomestimo z dušikom in medij smo nevtralizirali na pH 6,3. Dodajanje trebušne slinavke raztopine in žolčne soli zaključen prehod v tankem črevesu. Ta in-vitro
sistem ni upošteval, da v in vivo
prebavo, so encimi, ki aktivirajo in inaktivirano in druge snovi, na primer žolčnih soli reabsorbira. Sumeri et al
. [9] našel delno rešitev bypass ta problem. So razredčili vsebino reaktorja s posebej izdelano medij za redčenje. Druga možnost bi bila, da se obori žolčne soli na koncu simulacije tankega črevesa posnemati enterohepatično vezje. To se lahko izvede s kalcijevimi ioni [28-30]. Odstranjevanje žolčnih soli bi bolje simulirajo okolje debelega črevesa in morda celo omogočajo bifido razmnožujejo.
V naši raziskavi, preostale žolčne soli in trebušne slinavke sok v simulaciji privedla do dodatnega stresa na bakterije, ki je verjetno spremenila prave lastnosti sevov in vivo
.
začetni cfu v simulaciji spreminjala v enem log cfu čeprav prilagoditev oD 650 inokuluma je že preizkušena pri Bifidobacterium animalis
subsp. lactis
in Bifidobacterium longum
subsp. infantis
sevov. So bifidobakterije uporabljeni v tej študiji, so pokazale tendenco k tvorbi skupin, ki lahko povzročijo zmanjšano cfu (vizualne stališča, podatki niso prikazani). V drugi študiji, bi se oblikovanje grozdov so povezani z zmanjšanjem pH med rastjo [31]. Te skupine so običajno šteje kot eno kolonijo na krožniku.
Slika 6 prikazuje rezultate prehod simulacijo želodec, črevo več kot 7 ur sedmih testiranih Bifidobacterium
sevov. Koncentracija živih celic bifidobakterij takoj zmanjšal po inkubaciji ob nizkem pH (pH 3,0). Vendar B. animalis
subsp. lactis
ostala stabilna. To je potrdil rezultate prejšnjih poskusov zgoraj (slika 4) razpravljali. Ta odpor se lahko razširi na žolčnih soli in trebušne slinavke sok Čeprav se je število celic B. animalis
subsp. lactis PODJETJA
zmanjšala za okoli 85% od začetne vrednosti (slika 6). V primerjavi z drugimi vrstami, ki se uporabljajo v tej študiji, pa je bilo to zmanjšanje skoraj zanemarljiv.
Vse B. longum
in B. breve
sevi zelo hitro umrl na začetku simulacije in so pod odkrivanje meja metode galvanski v nekaj urah (slika 6), kar je bilo mogoče pričakovati od rezultatov presejalnega poskusa zgoraj (sliki 2 in 4).
na drugi strani, B. longum
subsp. infantis
14.390 hitro zmanjša na začetku simulacije, vendar po dodajanju pankreatičnih sok in žolčne soli in spremembo v anaerobnem okolju, stopnja znižanja zmanjšala. Naša študija kaže, da je ta sev dobro prilagojena razmeram v črevesju, vendar jo je treba zaužiti v velikem številu, da preživi razmere v želodcu (kisika, nizek pH). Kot je navedeno zgoraj, B. longum
subsp. infantis
sevi spadajo v prvo skupino bakterij naseljevanja črevesa dojenčkov [26].
V nasprotju z B. longum
subsp. infantis
, B. adolescentis
zmanjšala skoraj linearno med simulacijo 7 h. Ni bilo mogoče zaznati prekinitev če so izpolnjeni pogoji iz fermentorja spremenile. Temeljijo na poskusih za kisline presejanja tolerančnega je bil ta rezultat nepričakovan.
Pa to lahko povezano s pogoji preskušanja, kjer žolčno sol in koncentracije želodčni sok ostali v začetni stopnji in niso bili popravljeni, kot bi bili pri vivo
. V prihodnjem poskusu, je treba oceniti, ali metoda redčenja s Sumeri et al
razvita. [9] bi stabilizirali število celic iz B. adolescentis
v simulacijskem obdobju 6 h v črevesju.
V naši raziskavi smo ovrednotili tudi želodec, črevesje prehod z dne Lactobacillus gasseri
K7. Sev je že ocenili za preživetje in vivo
in pujski [14]. Zato je bilo mogoče primerjati naše in-vitro
rezultate s podatki in vivo
poskusov.
Bogovič et al
. [14] krmljene pujski v obdobju 14 dni s 5 * 10 10 cfu dan -1 L. gasseri
K7. To je privedlo do pribl. 7 * 10 4 cfu g -1 v blatu v obdobju hranjenja. Treba je upoštevati, da je koncentracija bakterij razredčenih preden je končno prišel na želodcu, črevesa prehodom. V grobem približevanja, smo ocenili, da je približno 1% prispel na prehodu. To nam je omogočilo, da primerjajo rezultate te študije pujskov s koncem našega simulacije.
Kot je prikazano na sliki 5, imela L. gasseri
K7 koncentracijo celic približno 5 * 10 4 cfu ml -1 po simulacijo času 7 h (s pred-kulturi, 250 ml), ki je podobno koncentracijo v blatom iz pujskov. To pomeni, da bi lahko bil simulacijski model uporabljen v tej raziskavi koristno orodje za oceno učinkov prehoda v modelu in vitro
pred uporabo drago in vivo
modelov. Ta model bi bilo mogoče še izboljšati z redčenjem žolčne soli in trebušne slinavke sok, ki ga Sumeri et al
opisano. [9]. Za simulacijo aktivacijo in deaktivacijo encimov je treba še najti primeren način.
Ko je bil samo 100 ml medij uporablja za inokulum L. gasseri
K7, kultura preživela simulacijo boljše (slika 7). Oba obseg imeli podobno začetno število celic. Oba količine smo inokulirali z 1 ml. Zato je bila kultura z 250 ml prostornine v zgodnejši fazi rasti kot 100 ml kulture. Ti rezultati so pokazatelj odvisnosti od faze rasti kulture za med stresom.
Zaključek
V tej študiji, so bili sposobni pokazati, da je sistem za simuliranje prehod v želodec, črevesje, ki jih Sumeri et al
. [9] je bila primerna za oceno preživetja 8 Bifidobacterium
sevov in Lactobacillus gasseri
K7, čeprav nismo simulirajo odstranitev želodčnih sokov in žolčnih soli. Za L. gasseri
K7 smo lahko primerjali rezultate z raziskavo in vivo
na pujske in dobimo podobne rezultate.
Sam reaktor sistem tukaj predstavljene omogoča bolj enostavno identifikacijo idealnega fazi rasti za morebitno probiotični sev, ki je potreben, da prenese želodec, črevesje prehod je, kot če je bilo treba opraviti z drugimi sistemi s težkim nastavitev.
študija je tudi pokazala, da so vsi testirani Bifidobacterium
seve, razen B. animalis
subsp. lactis
, bi bilo treba zaščitnih sredstev preživeti prehod skozi želodec-črevesju v velikem številu. To bi lahko dosegli z uporabo primerne hrane matriko ali enkapsulacijo celic.
Metode
Bakterijski sevi
Vsi sevi bifidobakterije so bili izbrani iz zbirke sevov Agroscope Liebefeld-Posieux ALP Research Station Švici, izolira s ALP od človeških virov. Lactobacillus gasseri
K7 izvira iz ZIM Zbirka industrijskih mikroorganizmov Univerze v Ljubljani, Biotehniške fakultete (ZIM 105) [10] in je bila deponirana tudi v zbirki ALP seva. Testirani sevi in ​​njihove identifikacijske številke zbiranja ALP seva, so navedene v tabeli 3. Vsi sevi bifidobakterije so last ALP.
Mediji in pogoji rasti
Za predhodnih kultur, so bili 1 ml zmrznjene obnavlja iz sevov inokulirali v 250 ml Wilkins-Chalgren juho (WC CM0643, Oxoid, Hampshire, Velika Britanija), dopolnjen z 9 gl -1 dodatno laktoze-monohidrata (bifidobakterij) in De Man-Rogosa-Sharpe (MRS; Biolife, Milano, Italija) medij (Lactobacillus gasseri
K7) [32]. Za L
. gasseri K7, sojenje s 100 ml pred-kulturi, je bila izvedena tudi. Vsi sevi, razen Bifidobacterium longum
subsp. infantis
, inkubiramo pri 37 ° C 15 ur pod anaerobnih pogojih. Bifidobacterium longum
subsp. infantis
smo inkubirali 12 ur, saj je zelo občutljiva na razširjenimi inkubacijske dobe. Pre-Kulture smo centrifugirali 15 minut pri 3500 obratih na minuto in pelete ponovno suspendirali v 10 ml fosfatnega pufra raztopini fiziološko raztopino natrijevega klorida (PBS).
Določitev celice število
števila celic smo določili z 10-kratnim serijska razredčitev kulture v fiziološki raztopini kuhinjske soli. Dva najvišja razredčitve so nato nanese na MRS agarju (Biolife, Milano, Italija) z spiralno PLATER (IUL Instruments, Barcelona, ​​Španija) in ocenila avtomatskega števca kolonijo z ustrezno programsko opremo (IUL Instruments, Barcelona, ​​Španija).
Presejanje za kislinske odpornosti
za odpornosti kisline presejalnega koncentrirano suspenzijo celic iz pred-kulturi, smo odpipetirali v 20 ml PBS, dokler se oD 650 1,0. 4 ml te celične suspenzije smo nato inokulirali v 16 ml citrat-HCl pufru (tri-Na-Citratex2 H 2O 7,35 g in 250 ml destilirane H 2O, prilagojeni ustreznim pH z 1 M HCl) pri pH 2,0, 2,5, 3,0, 3,5 in 4,0. Inkubacijo smo naredili pri 37 ° C in vzorci so bili odvzeti vsakih 30 minut preko 120 min. 1 ml vzorca zmešamo z 9 ml 0,25 M fosfatnem pufru pri pH 7,0 v prvem koraku serije redčenja. Za preskus kisline odpornosti na matrici hrano, enaka količina pred-kulturi, kot se uporablja zgoraj (nastavljanje OD 650 1,0) pipetiramo v 20 ml steriliziranega posnetega mleka. 4 ml te celične suspenzije v mleku smo inokulirali v 16 ml citrat-HCl pufrom. Vse kemikalije so bile kupljene pri Merck (Darmstadt, Nemčija). Podatki za presejalne eksperimentov smo vizualizirali v obris parcele z uporabo programske opreme Sigmaplot 11.0 (Systat Software Inc., Chicago IL, ZDA).
Simulacija v bioreaktorju
so bile vse rešitve sveže pripravljene za vsak poskus. Simulirani raztopino želodec je narejena iz 50 mg pepsinom prašičjim želodčne sluznice (Sigma-Aldrich P7012, Buchs, Švica) v 20 ml 0,1 M HCl. Za simulirano pankreatične sok 2 g pankreatina (Sigma-Aldrich P7545) smo raztopili v 50 ml 0.02 M fosfatnem pufru pri pH 7,5. Simulirani rešitev žolčne soli je bila 7,5 g govejega žolča (Sigma-Aldrich B3883) je do 50 ml z destilirano H 2O. Juha za simulacijo je bodisi 1 l WC ali MRS juha z 29,41 g tri-natrijevega citratex2 H 2O. dodamo med testiranjem preživetja v matrici hrano, 500 ml UVT posneto mleko in pH naravnamo na 3,0 s 5 M HCl tik pred simulacijo. 1 l medij dodamo v bioreaktor (NewMBR Mini, NewMBR, Švica), predhodno sterilizirane z vodo (121 ° C, 20 min) in segrejemo na 37 ° C. Med simulacijo želodcu, je bil izveden prezračevanje. Fermentacija je nadzirano in evidentirano z integrirano programsko opremo za upravljanje procesov LUCULLUS (Biospectra, Schlieren, Švica). Koncentrirana suspenzija celica iz predhodnega kulturi odpipetiramo 40 ml PBS do OD 650 1,5. Tik pred inokulacijo suspenzije 40 ml celic je bilo 20 ml simulirane želodčne raztopine dodamo k mediju (1 l) v bioreaktorju. PH smo naravnali z uporabo 2 M NaOH.
Šestdeset minut po okužbi celic, je kisik nadomestimo z dušikom, da dobimo anaerobno atmosfero.

• Ocena tveganja za raka na želodcu, povezanih z azbestozo: ocena primer report
• Baktericidne dejavnosti kationskih steroid CSA-13 in cathelicidin peptida LL-37 proti Helicobacter pylori v simuliranem želodčnem soku