Vyhodnotenie priechodu Lactobacillus Gasser K7 a bifidobaktérií zo žalúdka do čreva za použitia jediného reaktora model

Vyhodnotenie priechodu Lactobacillus Gasser
K7 a bifidobaktérií zo žalúdka do čriev pomocou jediného modelu reaktora
Abstract
pozadia
Probiotické baktérie sa predpokladá, že hrajú dôležitú úlohu v tráviacom trakte, a preto majú prežiť prechod od žalúdka do čriev. V poslednej dobe bol vyvinutý nový prístup k simulácii prechod od žalúdka do čriev v jednom bioreaktora. Výhodou tohto automatizovaného jedného reaktora bola schopnosť testovať vplyv kyseliny, žlčové soli a pankreatín.
Lactobacillus Gasser
K7 je kmeň izolovaný z dojčenskej stolice s vlastnosti, pre ktoré kmeňa zaujímavý pre výrobu syrov. V tejto štúdii, jediný systém reaktora bolo použité pre hodnotenie prežitie L. Gasser
K7 a vybrané bifidobaktérie z našej zbierke cez žalúdok-črevo priechodu.
Výsledky
Počiatočný skríning pre odolnosť voči kyselinám v okyslenom kultúre media vykazujú nízku toleranciu Bifidobacterium dentium
pre tento stav indikuje malú šancu na prežitie priechodu. Podobné výsledky boli dosiahnuté s B. longum
subsp. infantis
keďže, B. animalis
subsp. lactis
mali vysokú prežitie.
Tieto počiatočné výsledky boli potvrdené v bioreaktora modeli žalúdka, čreva priechodu. B. animalis
subsp. lactis
bola najvyššia miera prežitia (10%) dosiahnuť približne 5 x 10 6 KTJ ml -1 v porovnaní s ostatnými testovanými bifidobaktérií kmeňov, ktoré boli znížené o faktor až 10 6 , Lactobacillus Gasser
K7 bolo menej odolné než B. animalis
subsp. lactis
ale prežil v koncentráciách bunkových asi 1000 krát vyššia než u iných bifidobaktérií.
Záver
V tejto štúdii sme boli schopní ukázať, že L. Gasser
K7 mali vysokú mieru prežitia v stomach- črevo pasáž. Porovnaním výsledkov s predchádzajúcej štúdii u prasiatok by sme mohli potvrdiť spoľahlivosť našej simulácie. Z testovaných kmeňov bifidobaktérií, iba B. animalis
subsp. lactis
ukázali prijateľnú prežitie pre úspešné priechod v simulačnom systéme.
Pozadie
Probiotiká, baktérie mliečneho kvasenia najmä majú blahodarné účinky na zdravie spotrebiteľov, ako je navrhnuté v roku 1907 [1]. Verilo sa, že baktérie riadený najmä infekcií spôsobených črevných patogénov a regulovaného toxoaemia, čím sa zlepší zdravotný stav a ovplyvňovanie úmrtnosť. Medzitým je známe, že niektoré pozitívne účinky na zdravie spotrebiteľov sú zlepšenie bilancie mikroflóry v čreve, stimulácia imunitného systému, a pomáhať organizmu v boji proti patogénne mikroorganizmy [2]. Veľká časť záujmu sa sústredila na použitie kmeňov rodu Lactobacillus a Bifidobacterium
, aj keď existujú aj iné baktérie s probiotickými účinkami, napr. niektorí Propionibacterium.
Uvedené vlastnosti sú tiež základom pre mikroorganizmus byť označený probiotiká. Existujú rôzne definície, ale na celom svete, ktoré sú podobné v obsahu. Jedným z kritérií pre probiotický kmeň je jeho odolnosť voči kyslosti a žalúdočných riešenie v ľudskom zažívacom trakte [3]. Je preto dôležité, aby hodnotenie odolnosti potenciálneho probiotického kmeňa do kyslého prostredia žalúdku av čreve.
Vzhľadom k vysokým nákladom a etické, ako aj bezpečnostné pravidlá pre klinické štúdie, screening prežitie je jednoduchšie simulovať in vitro
. Jednoduchý test je inkubovať bakteriálnych buniek v kyslých alebo žlčových soľných roztokov počas stanoveného času a určenie počtu prežívajúcich buniek. V ďalšom kroku, simulácia sa vykonáva v miešaných fľašiach, kombinujúci kyslosť a žalúdočných riešení nasleduje odhad preživších buniek po celej simulácie. To je realistickejší replikácie podmienok v čreve [4]. Ďalšia systém je Simulátor ľudskej črevnej mikrobiálnej ekosystém (Shima), sa skladá z 5 až 6 sériovo pripojených pH kontrolovanej bioreaktoroch [5-7]. Nastavenie je pomerne zložitý a vyžaduje absolútnu anaeróbnych podmienkach. Okrem toho absorpcia metabolitov a vody nie je simulované. Toto bolo prekonať použitím dialyzačnej membrány, ako je popísané Marteau et al
. [8].
V poslednej dobe sa nový systém s použitím jediného bioreaktor bol vyvinutý pre štúdium žalúdka, čriev priechod [9]. Systém nechá hodnota pH má byť zmenený v jednom reaktore a bol upravený na retenčných časov v rôznych oblastiach žalúdok-črevo priechodu.
Lactobacillus Gasser
K7 bol nedávno izolovaný z dojčenskej stolice [10]. Produkuje bakteriocín, ktorý je aktívny proti Clostridium
sp. a ich spory. L. Gasser
patrí k takzvaným "acidophilus"-skupina a niekoľko nezávislých štúdií možno identifikovať tieto kmene ako obyvatelia kože a črevo [11-13]. V predchádzajúcich experimentoch, už bolo preukázané in vitro, že
L. Gasser
K7 prežili v kyslom prostredí, a s 0,3% žlčové soli [10]. Tieto poznatky aby sa kmeň zaujímavé ako možné probiotiká.
V tejto štúdii, jednotný systém bioreaktora založený na práci Sumerov et al
. [9], bola použitá pre hodnotenie prežitie Lactobacillus Gasser
K7 a osem Bifidobacterium
kmene z našej kolekcie. Boli sme schopní porovnať výsledky pre L. Gasser
K7 s štúdii uskutočnenej u prasiatok [14], čo umožnilo posúdenie korelácia medzi štúdie in vitro
s výsledkami in vivo experimentov
.
retenčné časy a pH použité v tejto štúdii boli na základe údajov z literatúry. Existuje niekoľko metód pre meranie pH v čreve [15]. V tabuľke 1 sú uvedené hodnoty pH v rôznych častiach čreva, merané kapsule Heidelberg [16, 17]. retenčné časy možno vypočítať buď pomocou značiek látky (chemické) alebo rádiové telemetrie kapsúl, ako je Heidelberg
kapsule [18]. Avšak, kapsule zvyčajne majú dlhšiu retenčné časy než chemickými značkami. Tabuľka 2 uvádza niektoré z retenčných časov nájsť v literatúre [4, 5, 19-24] .Table 1 hodnoty pH v ľudskom zažívacom trakte, merané pri Heidelbergu
kapsule.

žalúdka
duodenum
jejunum
Ileum
bližšie
mediálne
distálnej
pH 1,4
**
6,22 *
6,4 **
7,1 **
7,4 ** *
Fallingborg et al
. 1994 [16]
** Fallingborg et al
. 1998 [17]
Tabuľka 2 Retenčné časy v tenkom čreve citovanej v literatúre.
Retenčný čas
zdrojový kód
Poznámky

1-4 h
Huang a Adams 2004 [21]
4,25 h
Van Den Driessche et al
. 2000 [24]
žalúdka a tenkého čreva
4 h
Mojaverian 1996, [22]
6 hodín
Picot a Lacroix 2004 [4]
Vybrané maximálna doba simulácie
7,5 h
Fallingborg et al
. 1990 [20]
Detské
8 h
Fallingborg et al
. 1989 [19]
8 h
Alander et al
. 1998 [5]
Simulácie v Shima Reactor
6-10 h
Svalstvo et al
. 1991 [23]
na základe zistených v literatúre a diela Sumerov et al
základe údajov. [9] proces fermentácie sa stanovila ako je popísané v sekcii Materiál a metódy, a je znázornený na obrázku 1. Obrázok 1 Parametre žalúdočné a črevné priechod cez simuláciu 7 h. Výsledky
odporu kyseliny skríningové
cieľom prvej série skúšok bolo získať prehľad o odolnosť voči kyselinám ôsmich kmeňov bifidobaktérií. Obrázky 2, 3 a 4 ukazujú prežitie týchto kmeňov vrstevnicami grafy vykonané s SigmaPlot. Bifidobacterium dentium
(obrázok 3) ukázala, že najmenší odpor kyseliny. Medzi pH 4,0 a pH 2,0 nebol žiadny rozdiel v prežitie a koncentrácia buniek sa znížil o viac ako 7 log počas 40 minút. Bifidobacterium animalis
subsp. lactis
bol odolnejší až 40 minút pri pH 2,0, ale potom sa znížila približne o 3 log pri inkubácii po dobu 120 minút (obrázok 4). Pri pH medzi 2,5 a 3,0 pokles bol menší ako 1 log po 120 minútach. Obrázok 2 Kyselina odolnosť troch kmeňov Bifidobacterium longum. X-os: Čas (min); Y-os: pH; log cfu sú uvedené vo farbe (stupnica vpravo grafov). Čísla v bakteriálnych mená sú čísla napätia v FAM-databázy ALP.
Obrázok 3 Acid odpor Bifidobacterium dentium, B. longum subsp. infantis a B. adolescentis. X-os: Čas (min); Y-os: pH; log cfu sú uvedené vo farbe (stupnica vpravo grafov). Čísla v bakteriálnych mená sú čísla napätia v FAM-databázy ALP.
Obrázok 4 Rezistencia voči kyselinám Bifidobacterium breve a B. animalis subsp. lactis. X-os: Čas (min); Y-os: pH; log cfu sú uvedené vo farbe (stupnica vpravo grafov). Čísla v bakteriálnych mená sú čísla napätia v FAM-databázy ALP.
Všetky ostatné testované Bifidobacterium
kmene (B. longum, B. breve, B. longum
subsp. Infantis a B. adolescentis
) vykazovala podobný, ale odlišný od B. animalis
subsp. lactis
(obrázky 2, 3 a 4). Mali krátku dobu prežitia pri pH nižšom ako 2,5 a prežil vo väčšom počte pri pH vyššom ako 3,5.
S cieľom vyvinúť metódu pre simuláciu GI v bioreaktora, ďalšia skúška bola vykonaná s jedným kmeňom. Pozorovať vplyv na potravinové matrice, koncentruje sa B. longum
subsp. infantis
sa resuspendujú v odstredeného mlieka pred naočkovaním do kyslých roztokov. Ako je uvedené v pravom stĺpci na obrázku 5, mlieko mala priamy vplyv na prežitie kmeňa. Medzi pH 3,0 a 3,5 baktérie prežili počas 120 min sa znížením protokolu 2. Pod pH 3,0 miera prežitia bola znížená asi na logu 5. Pokles prežitie pod pH 3,0 bola rýchla, ale pravidelná v priebehu času. Pri pH 3,5 a vyššie, kmeň bol rezistentný k aspoň 120 minút. Obrázok 5 Porovnanie kyseliny odolnosti Bifidobacterium longum subsp. infantis 14390 suspenduje v roztoku chloridu sodného alebo odstredeného mlieka. Vľavo: bifidobaktérie resuspendované v NaCl, vpravo: Bifidobacterium resuspendované v mlieku. X-os: Čas (min); Y-os: pH; log cfu sú uvedené vo farbe (stupnica vpravo grafov). Čísla v bakteriálnych mená sú čísla napätia v FAM-databáze ALP.
Ľavý stĺpec z obrázku 5 ukazuje rovnaký kmeň bez pridaného odstredeného mlieka. Pri hodnote pH nad 3,5, nebolo vplyv na prežitie baktérií. Avšak, pri pH nižšom ako 3,5 je prežitie sa znížila v závislosti na dĺžke inkubácie. Medzi pH 3,0 a 3,5 kmeň už klesla o o prihlásenie 5. Po 30 minútach inkubácie, bola takmer lineárny pokles prežitie s klesajúcou hodnotou pH od 3,0 do 2,5.
Simulácia v bioreaktora
Väčšina systémov je popísané v literatúra sa skladajú z niekoľkých reaktorov, napr Shim [6]. Iné štúdie používajú imobilizované bunky s tromi reaktory [25] alebo dialyzačného systému [8]. Na základe práce Sumerov et al
na báze. [9] a zhromaždené údaje z podmienok uvedených v črevnej pasáže sme boli schopní obmedziť simulácie na jedno plavidlo. Spolu s dátami z skríningu odporu kyseliny, výber možného počiatočného pH a zloženie bujónu v simulátore by mohla byť vybraná. Výsledné parametre simulácie sú znázornené na obrázku 1 a popísané v materiáli a metód časti. Počas skúšobnej fázy tejto štúdie, Sumerov et al
. [9] vytvoril podobný systém pre hodnotenie Lactobacillus
sp. v žalúdku, čreva pasáž simulácia.
softvérový balík "Lucullus" Bol vynikajúcim nástrojom na kontrolu pH a spôsobu podľa rozvinutom simulácie. Voľba média v bioreaktora boli zjednodušené zvolením zodpovedajúce rastové prostredie pre kmene, doplnenú odstredeného mlieka, ktorý funguje ako simulované potravinovej matrice. Potom sa okyslí na predvolenú hodnotu pH a doplnený enzýmových roztokov, ako je popísané v časti Materiály a metódy. Simulácia boli vykonané sériovo, jeden za deň. Výsledky sú uvedené na obrázku 6. Kmene použité pre simuláciu sú uvedené v tabuľke 3 (iba Bifidobacterium dentium
bola vylúčená) a boli štandardizované na OD 650 1,5 pred očkovaním. Obrázok 6 Vývoj 7 kmeňov Bifidobacterium v ​​žalúdočné a črevné priechod simulácie počas 7 hodín. Prerušovaná čiara zobrazuje čas pridaním solí kyseliny žlčovej a pankreatickej šťavy. Čísla v bakteriálnych mená sú čísla napätia v FAM-databázy ALP.
Tabuľka 3 kmene testované v simulácii.
Name
Identifikačné číslo ALP kolekcie kmeňa
Bifidobacterium adolescentis
FAM-14377
Bifidobacterium breve
FAM-14398
Bifidobacterium longum
subsp. infantis
FAM-14390
Bifidobacterium animalis
subsp. Lactis
FAM-14403
Bifidobacterium dentium
FAM-14396
Bifidobacterium longum
FAM-14382, -14383, -14406
Lactobacillus Gasser
K7
FAM-14459
Bifidobacterium adolescentis
sa naočkuje, ako je popísané vyššie v počiatočnej koncentrácii 10 7 cfu ml -1 a znížil takmer lineárne na menej ako 10 4 cfu ml -1 po 5 hodinách. B. breve stroje a B. longum
kmeňov mal počiatočnej koncentrácie medzi 10 7 a 10 8 cfu ml -1 a znížil na menej ako 10 2 KTJ ml -1 počas prvých 30 minút. B. animalis
subsp. lactis
14403 prežil na približne 15% pôvodnej priemernej cfu 5 × 10 8 cfu ml -1. Došlo k rýchlemu poklesu prežitie B. longum
subsp. infantis
počas prvých 30 min. Potom prežitie sa znížila len pomaly od 10 5-10 4 KTJ ml -1.
V neskoršej fáze, Lactobacillus Gasser
K7 bol zaradený do štúdie od bežali niekoľko projektov v tomto okamihu v našom ústave s týmto kmeňom. Lactobacillus Gasser
K7 bol naočkovaný na 2,2 x 10 7 cfu ml -1 a po 7 h simulácie koncentrácii 10 5 cfu ml -1 živých buniek bol stále prítomný v kultivačné médium (Obrázok 7, krivka pre 250 ml pre-kultúry). Najvyšší pokles počtu prežitie počas prvých 2 hodín a okamžite začal po pridaní žalúdočných štiav a žlčových solí. Počas tejto doby došlo k zníženiu živých buniek protokolu 2. Počas zvyšku času simulácie, došlo iba k log 1 zníženiu živých buniek. Obrázok 7 Porovnanie vplyvu 100 ml predbežnej kultúry Lactobacillus Gasser K7 sa 250 ml Prípravná kultúra. Pre-kultúry sa zožne centrifugáciou a resuspendované vo fyziologickom roztoku chloridu sodného, ​​aby sa dosiahlo OD600 1,5. Žalúdok a črevné pasáž simulácie sa inkubuje za použitia upraveného roztoku a inkubované po dobu 7 hodín. Prerušovaná čiara znázorňuje pridávanie soli žlčových kyselín a pankreatickej šťavy. Krivky sú priemer duplicitných pokusov.
Prípravu inokula L. Gasser
K7 objemu kultivačným objemom 100 ml bola tiež hodnotená. Výsledky experimentov sú uvedené na obrázku 7. 250 ml kultúry pokles v živých bunkách bola asi log 2 na to, že pokles sa 100 ml kultúry v log bola iba 1 po celú dobu inkubácie. Avšak, 2 h po pridaní žlčových solí a pankreatickej šťavy, pokles počtu buniek bola u oboch objemov.
Diskusia
Pri zbere kultúry po určitej inkubačnej dobe sa rastová fáza každého bakteriálneho kmeňa môže byť odlišný, pretože všetci majú rôzne rastové dynamiky. Za účelom získania buniek pri približne rovnakej fáze rastu, boli vykonané predbežné pokusy (dáta nie sú uvedené). Inkubačnej dobe 15 hodín za Prípravná kultúra bol vhodný pre všetky testované kmene Bifidobacterium longum okrem
subsp. infantis
ktorá musela byť inkubované po dobu len 12 hodín.
kyseliny tolerancie skríning (obrázky 2, 3 a 4) bola vykonaná za účelom vyhodnotenia vplyvu pH nezávisle na ďalších podmienkach. Bifidobacterium dentium
bola veľmi citlivá na kyselinu, a preto by sa možno neprežije priechodu žalúdkom. Kmeň bol preto nie sú zahrnuté v simulačných experimentov. B. longum
kmeňov (obrázok 2) nepriniesla oveľa lepšie výsledky, než B. dentium
(obrázok 3). Avšak, v blízkom okolí je pH 4 boli odolnejšie než B. dentium
.
B. longum
subsp. infantis
je jedným z prvého druhu k naplneniu ľudského čreva krátko po narodení [26]. na základe experimentov v tejto štúdie však testované B. longum
subsp. infantis
kmeň by mal byť schopný prejsť detskou žalúdka a vo vysokom počte iba v prípade, že doba prechodu v kyslom žalúdku bola veľmi krátka. Prežitie vybraného kmeňa v testovanom prostredí bola príliš nízka pre úspešné priechod vo vysokom počte. Kedy bol kmeň resuspendujú v odstredeného mlieka, prežitie zvýšená (obrázok 5). To by mohlo byť známkou toho, že materské mlieko pomáha B. longum
subsp. infantis
kmene prejsť žalúdkom-črevnej priechod sa pri vyššej miera prežitia.
ochranné účinky mliečnych proteínov v tráviacom systéme, ktoré už boli popísané v literatúre [27]. Ochrana s mliečnymi proteínmi bolo tiež preukázané v tejto štúdii (obrázok 5). S príslušnou matricou alebo dokonca nosič, probiotické baktérie môžu bezpečne prejsť žalúdka do čriev dosiahnuť ich miesto účinku.
B. adolescentis
kmeňov, ktoré obývajú ľudské črevo v neskoršom veku, mal mierne vyššiu odolnosť než B. longum
subsp. infantis
čo môže vysvetľovať zníženie vaku pri vývoji ľudského novorodenca do dospelosti [26].
najzaujímavejšie kmeň bol B. animalis
subsp. lactis
, ktorý bol najmenej citlivý kmeň v našej štúdii. Tento kmeň pH-rezistentný má veľký potenciál pre použitie v potravinách ako probiotický doplnok od vyššieho počtu bakteriálnych buniek prežije priechod. Avšak, použitie tohto kmeňa ako probiotiká ďalšie štúdie musia byť vykonané tak, aby sa dosiahlo probiotický stave podľa definície Klaenhammer [3].
V našej štúdii, požití potraviny matrice bol simulovaný v počiatočnej prostredie acidofilné mlieko a rastovým médiom. Pridaná simulované žalúdočné roztoku a kyslíka v žalúdku fázy dochádzalo k zvýšeniu napätia. Pri simulovanej priechodom do tenkého čreva sa kyslík nahradený dusíkom a médium sa neutralizuje na hodnotu pH 6,3. Prídavok pankreatických riešenia a žlčové soli dokončenie priechodu do tenkého čreva. Tento in vitro
systém nevzal do úvahy, že pri trávení in vivo
, enzýmy sú aktivované a deaktivované a iné látky, napr. soli žlčových kyselín sa vstrebáva. Sumer et al
. [9] zistili, čiastočné riešenie, ako obísť tento problém. Sa zriedi na obsah reaktora so špeciálne navrhnutým zrieďovacom médiu. Ďalšou možnosťou by bolo, aby sa vyzrážal soľou žlčových kyselín na konci simulácie tenkého čreva napodobniť enterohepatálnou obvodu. To by mohlo byť vykonané s vápenatými iónmi [28-30]. Odstránenie žlčových solí by lepšie simulovať prostredie hrubého čreva a mohlo by dokonca umožňujú bifidobaktérie sa množiť.
V našej štúdii, zostávajúce žlčové soli a pankreatické šťavy v simulácii viedlo k ďalšiemu napätiu na baktérií, ktoré pravdepodobne zmenený skutočné vlastnosti kmeňov in vivo
.
východiskové CFU v simulácii pohybovala v rámci jednej log KTJ hoci úprava oD 650 inokula bola vopred vyskúšaného s Bifidobacterium animalis
subsp. lactis stroje a Bifidobacterium longum
subsp. infantis
kmene. Sú bifidobaktérie použité v tejto štúdii vykazovali tendenciu vytvárať zhluky, ktoré môžu viesť k zníženiu CFU (vizuálne pozorovanie, dáta nie sú uvedené). V inej štúdii, tvorba zhlukov môže súvisieť s klesajúcou hodnotou pH počas rastu [31]. Tieto zhluky sa obvykle počíta ako jeden kolónie na tanieri.
Obrázok 6 ukazuje výsledky žalúdok-črevo priechodného simulácia cez 7 hodín siedmich testovaných kmeňov Bifidobacterium
. Koncentrácia živých buniek bifidobaktérií sa znížil bezprostredne po inkubácii vzhľadom k nízkej hodnote pH (pH 3,0). Avšak, B. animalis
subsp. lactis
zostali stabilné. To potvrdilo výsledky predchádzajúcich experimentoch diskutovaných vyššie (Obrázok 4). Tento odpor by mohol byť rozšírený na žlčové soli a pankreatické šťavy, aj keď počty buniek B. animalis
subsp. lactis
znížila približne o 85% z počiatočnej hodnoty (Obrázok 6). V porovnaní s inými kmeňmi použité v tejto štúdii, však, tento pokles bol takmer zanedbateľný.
Všetky B. longum stroje a B. breve
kmene zomrel veľmi rýchlo na začiatku simulácie a boli pod detekciou medza spôsobu pokovovanie priebehu niekoľkých hodín (obrázok 6), ktoré sa dalo očakávať z výsledkov experimentu skríningu vyššie (obrázky 2 a 4).
na druhej strane, B. longum
subsp. infantis
14390 rýchlo klesla na začiatku simulácie, ale po pridaní pankreatickej šťavy a žlčové soli a zmenu anaeróbnom prostredí, miera zníženia znížená. Naša štúdia naznačuje, že tento kmeň je dobre prispôsobený podmienkam v čreve, ale musí byť prijaté vo vysokom počte prežiť podmienky v žalúdku (kyslík, nízke pH). Ako bolo uvedené vyššie, B. longum
subsp. infantis
kmene patrí do prvej skupiny baktérií vyplnenie čreva dojčiat [26]. Na rozdiel od
B. longum
subsp. infantis
, B. adolescentis
počas 7 h simulácie takmer lineárne klesala. Neexistuje žiadny zistiteľný prerušenia, ak podmienky, na fermentora zmenila. Na základe experimentov pre skríning kyseliny tolerancie založené na tento výsledok bol neočakávaný.
To však môže súvisieť s podmienkami testovania, kde soľ žlčové kyseliny a koncentrácie žalúdočné šťavy zostali na pôvodnej úrovni a neboli zriedených ako by to bolo v vivo
. V budúcej experimentu, je potrebné vyhodnotiť, či tento spôsob riedenia vyvinutá Sumerov et al
. [9] by stabilizovať počet buniek z B. adolescentis
počas simulácie dobu 6 h v čreve.
V našej štúdii sme vyhodnotili žalúdka, čriev priechod Lactobacillus Gasser
K7. Kmeň už bol hodnotený z hľadiska prežitia in vivo
u prasiatok [14]. Z tohto dôvodu bolo možné porovnať naše výsledky in-vitro
s dátami z in vivo
experimenty v.
Bogović et al
. [14] kŕmených prasiatka počas obdobia 14 dní s 5 * 10 10 KTJ deň -1 L. Gasser
K7. To malo za následok cca. 7 * 10 4 KTJ g -1 v stolici počas obdobia kŕmenia. Je potrebné vziať do úvahy, že koncentrácia baktérií sa zriedi pred tým, než konečne dorazil do žalúdka, čreva priechodu. V hrubom priblížení, sme sa odhaduje, že približne 1% dorazil do priechodu. To nám umožnilo porovnať výsledky tejto štúdie prasiatka s koncom nášho simulácie.
Ako je znázornené na obrázku 5, L. Gasser
K7 mal koncentráciu buniek približne 5 * 10 4 cfu ml -1 počas 7 h simulácie (s pre-kultúry 250 ml), čo je podobné ako koncentrácie v truse prasiatok. To naznačuje, že simulačný model použitý v tejto štúdii by mohlo byť užitočným nástrojom pre odhad účinkov priechodu v modeli in vitro
pred použitím drahé na in vivo modeloch
. Tento model môže byť ďalej optimalizovaná zriedením žlčové soli a pankreatické šťavy, ako je popísané Sumerov et al
. [9]. Simulovať aktiváciu a deaktiváciu enzýmov ešte nájsť vhodnou metódou.
Keď bol iba 100 ml médium používané pre inokulum L. Gasser
K7, kultúra prežila simuláciu lepší (obrázok 7). Oba zväzky mal podobnú východiskovú počet buniek. Oba objemy boli Inokulované 1 ml. Z tohto dôvodu, kultúra sa 250 ml objemu bol v skoršej fáze rastu ako 100 ml kultúry. Tieto výsledky boli údaj o závislosti rastovej fáze kultúre pri strese.
Záver
V tejto štúdii sme boli schopní ukázať, že systém pre simuláciu priechodu žalúdka, čriev vyvinutý Sumerov et al
. [9] bol vhodný pre hodnotenie prežitie 8 kmeňov Bifidobacterium stroje a Lactobacillus Gasser
K7, aj keď sme nemali simulovať odstránenie žalúdočných štiav a žlčových solí. Pre L. Gasser
K7 sme boli schopní porovnať výsledky sa štúdie in vivo
na prasiatka a získať podobné výsledky.
Jednotný systém reaktora tu prezentované umožňuje priamejší identifikáciu ideálne rastovej fázy za prípadnú probiotických kmeňov, ktoré je potrebné zložiť žalúdočné-črevné pasáž, než keby musela byť vykonaná s inými systémami s obtiažnym nastavenia.
štúdia tiež ukázala, že všetky testované Bifidobacterium
kmeňov, s výnimkou B. animalis
subsp. lactis
, by vyžadovalo prostriedky na ochranu prežiť priechodu žalúdkom-čreve vo vysokých číslach. To možno dosiahnuť použitím vhodného potravinovej matrice alebo zapuzdrenie buniek.
Metódy
Bakteriálne kmene
Všetky kmene Bifidobacterium boli vybrané zo zbierky deformačné Agroscope Liebefeld-Posieux ALP Research Station Švajčiarsku, izolovaný od ALP ľudských zdrojov. Lactobacillus Gasser
K7 pochádzal z ZIM zbierky priemyselných mikroorganizmov Univerzity v Ľubľane, Biotechnické fakulty (ZIM 105) [10] a bol tiež uložený v zbierke ALP kmeňa. Testované kmene a ich identifikačné čísla kolekcie ALP kmeňa sú uvedené v tabuľke 3. Všetky kmene Bifidobacterium sú majetkom ALP.
Médiá a rastové podmienky
pre pre-kultúry, 1 ml mrazené zaváraniny kmeňov boli naočkuje do 250 ml Wilkins-Chalgren vývaru (WC CM0643, Oxoid, Hampshire, UK) doplnenom 9 gl -1 Ďalší monohydrátu laktózy (bifidobaktérie), alebo De Man-Rogosa-Sharpe (MRS; Biolife, Milano, Taliansko) stredná (Lactobacillus Gasser
K7) [32]. Pre L
. Gasser K7, súdne konanie sa 100 ml Prípravná kultúra bol tiež vykonaný. Všetky kmene Bifidobacterium longum, s výnimkou
subsp. infantis
, boli inkubované pri teplote 37 ° C počas 15 hodín pri anaeróbnych podmienkach. Bifidobacterium longum
subsp. infantis
bola inkubovaná po dobu 12 hodín, pretože to bolo veľmi citlivý na predĺženej inkubačnej doby. Pre-kultúry boli stočené počas 15 minút pri 3500 otáčkach za minútu a pelety boli resuspendované v 10 ml fosfátom pufrovaného fyziologického roztoku chloridu sodného (PBS).
Stanovenie bunky počet EU Počet buniek sa stanoví pomocou 10-násobne sériové riedenie kultúry vo fyziologickom roztoku chloridu sodného. Tieto dva najvyššie riedenie boli potom nanesené na MRS agare (Biolife, Milano, Taliansko) za použitia špirálovej Plater (IUL Instruments, Barcelona, ​​Španielsko) a vyhodnotené pomocou automatického kolónií pult so zodpovedajúcim softvérom (IUL Instruments, Barcelona, ​​Španielsko).
Screening na odolnosť voči kyselinám
pre kyselinu odporu skríningu suspenzie koncentrovanej bunkovej z pre-kultúry bolo pipetovanie do 20 ml PBS, kým oD 650 1,0. 4 ml tejto bunkovej suspenzie sa potom naočkuje do 16 ml pufru citrátu-HCl (tri-Na-Citratex2 H 2O 7,35 g a 250 ml destilovanej H 2O, prispôsobené na zodpovedajúcu hodnotu pH pomocou 1 M HCl) pri pH 2,0, 2,5, 3,0, 3,5 a 4,0. Inkubácia bola vykonaná pri teplote 37 ° C a vzorky boli odoberané každých 30 minút v priebehu 120 minút. 1 ml vzoriek sa zmieša s 9 ml 0,25 fosforečnanmi tlmeného pri pH 7,0 v prvom kroku sérii riedenia. Pre skúšku odolnosti kyseliny v potravinárskej matrice, rovnaké množstvo pre-kultúry, ako je použitý vyššie (upraví na OD 650 1,0) bolo Pipetovanie do 20 ml UHT odtučneného mlieka. 4 ml tejto bunkovej suspenzie v mlieku boli vrúbľovať do 16 ml pufru citrátu-HCl. Všetky chemikálie boli získané od firmy Merck (Darmstadt, Nemecko). Údaje pre skríning experimentoch bol vizualizovaný v obrysových plochách s použitím softvéru SigmaPlot 11,0 (System Software Inc., Chicago IL, USA).
Simulácia v bioreaktora
Všetky roztoky boli čerstvo pripravené pre každý experiment. Simulovaná žalúdočná roztok sa 50 mg pepsínu prasacej žalúdočnej sliznice (Sigma-Aldrich P7012, Buchs, Švajčiarsko) v 20 ml 0,1 M kyseliny chlorovodíkovej. Pre simulované pankreatické šťavy 2 g pankreatínu (Sigma-Aldrich P7545) sa rozpustí v 50 ml 0,02 fosforečnanmi tlmeného pri pH 7,5. Simulované roztok soli žlčové kyseliny bol vyrobený z 7,5 g býčej žlče (Sigma-Aldrich B3883) tvorený destilovanou H 2O 50 ml. Vývar pre simuláciu bol buď 1 l WC alebo MRS vývar s 29,41 g citratex2 tri-sodné H 2O. bolo pridané pri testovaní prežitie v potravinovej matrici, 500 ml UHT odstredené mlieko a pH sa upraví na 3,0 pomocou 5 M HCl krátko pred simulácie. 1 l médium sa pridalo do bioreaktora (NewMBR Mini, NewMBR, Švajčiarsko), vopred sterilizované vody (121 ° C, 20 min), a zmes sa zahrieva na 37 ° C. Počas simulácie žalúdka, bol realizovaný prevzdušňovanie. Fermentácia bola riadená a zaznamenaná pomocou integrovaného softvéru pre správu procesov Lucullus (Biospectra, Schlieren, Švajčiarsko). Koncentrovaná suspenzia buniek z pre-kultúry bolo Pipetovanie do 40 ml PBS, aby OD 650 1,5. Krátko pred očkovaním suspenzie 40 ml buniek bolo pridané 20 ml simulovanej žalúdočnej riešenie k médiu (1 l) v bioreaktora.

• Posúdenie riziko vzniku rakoviny žalúdka spojené s azbestózou: kazuistika
• Baktericídne aktivity katiónových steroid CSA-13 a cathelicidin peptid LL-37 proti Helicobacter pylori v simulovanej žalúdočnej činnosti juice