Evaluatie van de passage van Lactobacillus gasseri K7 en bifidobacteriën van de maag naar de darmen met één reactor model

evaluatie van de passage van Lactobacillus gasseri
K7 en bifidobacteriën van de maag naar de darmen met één reactormodel
De abstracte achtergrond
Probiotische bacteriën worden gedacht een belangrijke rol in het spijsverteringsstelsel spelen en dus de overgang van de maag naar de darmen overleven. Onlangs is een nieuwe benadering voor de overgang van de maag naar de darmen te simuleren in een bioreactor ontwikkeld. Het voordeel van deze geautomatiseerde een reactorsysteem was de mogelijkheid om de invloed van zure, galzouten en pancreatine testen.
Lactobacillus gasseri
K7 is een stam geïsoleerd uit faeces van baby eigenschappen maken de stam interessant voor de kaasproductie. In deze studie werd een enkele reactor systeem dat wordt gebruikt voor het overleven van L. gasseri
K7 evalueren en gekozen bifidobacteriën uit onze collectie door de maag-darm passage.
Resultaten
eerste screening voor zure weerstand in aangezuurd cultuur media toonden een lage tolerantie van Bifidobacterium dentium
voor deze aandoening aangeven lage overleving in de passage. Vergelijkbare resultaten werden bereikt met B. longum
subsp. infantis
terwijl B. Animalis
subsp. lactis
had een hoge overlevingskans.
Deze eerste resultaten werden bevestigd in de bioreactor model van de maag-darm passage. B. animalis
subsp. lactis
had het hoogste overlevingspercentage (10%) bereiken van ongeveer 5 x 10 6 kve ml -1 vergelijking met de andere geteste stammen bifidobacteriën die zijn gereduceerd met een factor van maximaal 10 6 . Lactobacillus gasseri
K7 was minder weerstand dan B. Animalis
subsp. lactis
maar overleefde naar mobiele concentraties die ongeveer 1000 maal hoger dan andere bifidobacteriën.
Conclusie
In deze studie, waren we in staat om te laten zien dat L. gasseri
K7 had een hoge overlevingskans in de maag- darm passage. Door vergelijking van de resultaten met een eerdere studie bij biggen konden we de betrouwbaarheid van onze simulatie bevestigen. Van de geteste stammen bifidobacteriën, alleen B. animalis
subsp. lactis
toonde aanvaardbare overleving voor een succesvolle passage in de simulatie systeem. achtergrond
Probiotica, vooral melkzuurbacteriën een gunstig effect hebben op de gezondheid van de consument, zoals voorgesteld in 1907 [1]. Men geloofde dat bacteriën hoofdzakelijk gecontroleerd infecties veroorzaakt door enterale pathogenen en gereguleerde toxoaemia, waardoor het verbeteren van de gezondheid en het beïnvloeden van de sterfte. Inmiddels is bekend dat sommige van de heilzame werking consumenten de verbetering van het evenwicht microflora in de darm, het stimuleren van het immuunsysteem en helpen het organisme pathogene micro-organismen te bestrijden [2]. Een groot deel plaats is gericht op het gebruik van stammen van de geslachten Lactobacillus en Bifidobacterium

, ook al zijn er ook andere bacteriën probiotische effecten, b.v. sommige propionibacteriën. Ondernemingen De bovengenoemde eigenschappen zijn ook de basis voor een micro-organisme probiotische te worden geëtiketteerd. Er zijn verschillende definities wereldwijd maar hebben ze dezelfde inhoud. Eén van de criteria voor een probiotische stam zijn weerstand tegen zuurgraad en maag oplossingen in het humane maagdarmkanaal [3]. Het is daarom van belang om de weerstand van een potentiële probiotische stam evalueren en de zure maagomgeving in de darm.
Vanwege de hoge kosten en ethische en veiligheidsvoorschriften voor klinische studies, screening overleven gemakkelijker te simuleren in vitro
. Een eenvoudige test is om de bacteriële cellen in zure of gal zoutoplossingen incubeer gedurende een bepaalde periode en tel het aantal overlevende cellen. In een volgende stap wordt de simulatie uitgevoerd in geroerde flessen uitgevoerd, combineren zuurgraad en maag oplossingen gevolgd door een schatting van overlevende cellen over het gehele simulatie. Dit is een meer realistische replicatie van de omstandigheden in de darmen [4]. Een ander systeem, de simulator van de humane intestinale microbiële ecosysteem (SHIME) bestaat uit 5-6 serie geschakelde bioreactoren gecontroleerde pH [5-7]. De setup is vrij complex en eist absolute anaerobe omstandigheden. Verder is de absorptie van metabolieten en water niet gesimuleerd. Dit werd overwonnen door dialysemembranen zoals beschreven door Marteau et al
. [8].
Onlangs is een nieuw systeem met één bioreactor werd ontwikkeld om het maag-darm passage onderzoek [9]. Het systeem liet de pH worden aangepast in een enkele reactor en is aangepast aan de retentietijden in de verschillende gebieden van het maag-darm passage.
Lactobacillus gasseri
K7 is onlangs geïsoleerd uit faeces baby [10]. Het produceert een bacteriocineproductie die actief is tegen Clostridium
sp is. en hun sporen. L. gasseri
behoort tot de zogenaamde "acidophilus" -groep en een aantal onafhankelijke studies die deze stammen als bewoners van de huid en de darmen [11-13]. In eerdere experimenten is reeds aangetoond in vitro
dat L. gasseri
K7 overleven in een zure omgeving en met 0,3% galzouten [10]. Deze bevindingen maken de stam interessant als een mogelijke probiotische.
In deze studie, één bioreactor systeem dat gebaseerd is op het werk van Sumeri et al
. [9] werd gebruikt om het voortbestaan ​​van Lactobacillus gasseri
K7 en acht Bifidobacterium
stammen uit onze collectie te evalueren. We waren in staat om de resultaten voor L. gasseri
K7 vergelijken met een studie die werd uitgevoerd bij biggen [14], waarin de beoordeling van een correlatie tussen de in-vitro
studie met de resultaten van in-vivo-experimenten
toegestaan .
retentietijden en pH die in deze studie waren gebaseerd op gegevens uit de literatuur. Er bestaan ​​verscheidene werkwijzen voor het meten van pH in de darm [15]. Tabel 1 toont de pH-waarden in de verschillende delen van de darm zoals gemeten door de Heidelberg capsule [16, 17]. Retentie tijden kan worden berekend met behulp van marker stoffen (chemisch) of radio telemetrie capsules, zoals de Heidelbergse
capsule [18]. Echter, capsules hebben meestal langere retentietijd dan chemische markers. Tabel 2 geeft enkele van de retentietijden in de literatuur [4, 5, 19-24] .table 1 pH-waarden in het menselijk darmkanaal, gemeten met de Heidelberg
capsule.

Maag
Duodenum
Jejunum
Ileum
proximale
mediale
distale
pH
1.4 **
6,22 *
6.4 **
7,1 **
7.4 **
* Fallingborg et al
. 1994 [16]
** Fallingborg et al
. 1998 [17]
Tabel 2 Retention keer in de dunne darm aangehaald in de literatuur.
Retentietijd
Source
Opmerkingen

1-4 h
Huang en Adams 2004 [21]
4.25 uur
Van Den Driessche et al
. 2000 [24]
maag en dunne darm verhuur 4 h
Mojaverian 1996 [22]
6 uur
Picot en Lacroix 2004 [4]
Geselecteerde maximale tijd van de simulatie
7.5 h
Fallingborg et al
. 1990 [20]
Kinderen
8 uur
Fallingborg et al
. 1989 [19]
8 uur
Alander et al
. 1998 [5]
Simulatie in de SHIME Reactor
6-10 h
thews et al
. 1991 [23]
basis van de gegevens in de literatuur en het werk van Sumeri et al
. [9] het fermentatieproces werd opgezet zoals beschreven in Materiaal en Methoden en is weergegeven in figuur 1. Figuur 1 Parameters van de maag-darm passage simulatie meer dan 7 uur.
Resultaten
Zuurbestendigheid screening
teneinde een eerste reeks proeven werd een overzicht van de zuurbestendigheid van acht bifidobacteriën stammen te verkrijgen. Figuren 2, 3 en 4 tonen de overleving van deze stammen gebruikt contourdiagrammen gemaakt Sigmaplot. Bifidobacterium dentium
(figuur 3) toonde de minst zuurbestendigheid. Tussen pH 4,0 en pH 2,0 was er geen verschil in overleving en de concentratie van cellen daalde met meer dan 7 log binnen 40 minuten. Bifidobacterium animalis
subsp. lactis
was bestendig tot 40 min bij pH 2,0, maar daalde met ongeveer 3 geregistreerd wanneer gedurende 120 minuten (Figuur 4). Bij een pH tussen 2,5 en 3,0 was de daling minder dan 1 log na 120 minuten. Figuur 2 Zuurbestendigheid drie Bifidobacterium longum stammen. X-as: tijd (min); Y-as: pH; log cfu in kleur weergegeven (schaal rechts van de grafieken). Getallen in de bacteriële namen zijn de stam nummers in de FAM-databank van ALP.
Figuur 3 Acid weerstand van Bifidobacterium dentium, B. longum subsp. infantis en B. adolescentis. X-as: tijd (min); Y-as: pH; log cfu in kleur weergegeven (schaal rechts van de grafieken). Getallen in de bacteriële namen zijn de stam nummers in de FAM-databank van ALP.
Figuur 4 Acid weerstand van Bifidobacterium breve en B. animalis subsp. lactis. X-as: tijd (min); Y-as: pH; log cfu in kleur weergegeven (schaal rechts van de grafieken). Getallen in de bacteriële namen zijn de stam nummers in de FAM-databank van ALP.
Alle andere geteste Bifidobacterium
stammen (B. longum, B. breve, B. longum
subsp. Infantis en B. adolescentis
) toonde een vergelijkbaar, maar ander patroon van B. Animalis
subsp. lactis
(figuren 2, 3 en 4). Ze hadden een korte overlevingstijd onder pH 2,5 en in grotere aantallen overleefden boven pH 3,5.
Met als doel het ontwikkelen van een methode om de GI simuleren in de bioreactor werd een nieuwe test uitgevoerd met één stam. Om de invloed van een voedselmatrix observeren, geconcentreerd B. longum
subsp. infantis
werd opnieuw in afgeroomde melk voor het enten in zure oplossingen. Zoals weergegeven in de rechterkolom van figuur 5, melk hadden een direct effect op de overleving van de stam. Tussen pH 3,0 en 3,5 de bacteriën overleefde 120 min met een verlaging van de log 2. Onder pH 3,0 de overleving daalde tot ongeveer log 5. De afname in overleving onder pH 3,0 was snel maar regelmatig in de tijd. Bij pH 3,5 en hoger, de stam was resistent voor ten minste 120 minuten. Figuur 5 Vergelijking van zuurbestendigheid van Bifidobacterium longum subsp. infantis 14390 gesuspendeerd in NaCl of magere melk. Links: Bifidobacteria gesuspendeerd in NaCl, rechts: bifidobacteriën gesuspendeerd in melk. X-as: tijd (min); Y-as: pH; log cfu in kleur weergegeven (schaal rechts van de grafieken). Getallen in de bacteriële stam namen de aantallen in de FAM-databank van ALP. Ondernemingen De linkerkolom van figuur 5 toont eenzelfde stam zonder toegevoegde magere melk. Bij een pH boven 3,5, was er geen invloed op de overleving van de bacteriën. Echter beneden pH 3,5 overleven verlaagd afhankelijk van de duur van incubatie. Tussen pH 3,0 en 3,5 was de spanning al daalde met ongeveer loggen 5. Na 30 min incubatie, was er bijna een lineaire afname in overleving met afnemende pH 3,0-2,5.
Simulatie in de bioreactor
meeste systemen beschreven in de literatuur bestaan ​​uit meerdere reactievaten, bijvoorbeeld de SHIME [6]. Andere studies gebruikten geïmmobiliseerde cellen met drie reactoren [25] of een dialysesysteem [8]. Op basis van het werk van Sumeri et al
. [9] en de verzamelde gegevens van de omstandigheden in de darmpassage konden we de simulatie te beperken tot één vat. Tezamen met de gegevens van de zuurbestendigheid screening, kan de selectie van een mogelijke start pH en bouillon samenstelling in de simulator worden gekozen. De verkregen simulatie parameters zijn weergegeven in figuur 1 en in de Materialen en Werkwijzen sectie beschreven. Tijdens de experimentele fase van deze studie, Sumeri et al
. [9] een soortgelijk systeem met Lactobacillus sp
evalueren ontwikkeld. in een maag-darm passage simulatie. Ondernemingen De softwarepakket "Lucullus" was een uitstekend hulpmiddel om de pH en de werkwijze volgens de ontwikkelde simulatie controleren. Selecteren van het medium in de bioreactor werd vereenvoudigd door keuze van de overeenkomstige groeimedium voor de stammen, aangevuld met magere melk, functioneren als een gesimuleerde voedselmatrix. Daarna werd aangezuurd tot de start pH en aangevuld met enzymoplossingen zoals beschreven in Materialen en Werkwijzen. De simulaties werden serieel uitgevoerd, één per dag. De resultaten worden getoond in Figuur 6. De stammen gebruikt voor de simulatie zijn in tabel 3 (alleen Bifidobacterium dentium
uitgesloten) opgenomen en werden gestandaardiseerd tot een OD 650 van 1,5 vóór de inoculatie. Figuur 6 Ontwikkeling van 7 Bifidobacterium stammen in maag-darmpassage simulatie voor 7 uur. Binnen de stippellijn geeft de tijd van de toevoeging van galzouten en pancreas sap. Getallen in de bacteriële namen zijn de stam nummers in de FAM-databank van ALP.
Tabel 3 stammen getest in de simulatie.
Name
Identificatie nummer van ALP stammencollectie
Bifidobacterium adolescentis
FAM-14377
Bifidobacterium breve
FAM-14398
Bifidobacterium longum
subsp. infantis
FAM-14390
Bifidobacterium animalis
subsp. Lactis
FAM-14403
Bifidobacterium dentium
FAM-14396
Bifidobacterium longum
FAM-14.382, -14.383, -14.406
Lactobacillus gasseri
K7
FAM-14459
Bifidobacterium adolescentis
werd geïnoculeerd zoals hierboven beschreven bij een initiële concentratie van 10 7 cfu ml -1 en bijna lineair verlaagd tot beneden 10 4 kve ml -1 na 5 uur. B. breve Kopen en B. longum
stammen hadden een aanvankelijke concentratie tussen 10 7 en 10 8 kve ml -1 en verminderd tot onder 10 2 kve ml -1 binnen de eerste 30 minuten. B. animalis
subsp. lactis
14.403 overleefd tot ongeveer 15% van de initiële gemiddelde kve van 5 x 10 8 kve ml -1. Er was een snelle afname in overleving van B. longum
subsp. infantis
over de eerste 30 min. Daarna het voortbestaan ​​slechts langzaam gedaald van 10 5-10 4 kve ml -1.
In een latere fase, Lactobacillus gasseri
K7 werd opgenomen in de studie, omdat een aantal projecten liepen op dit moment bij ons instituut met deze stam. Lactobacillus gasseri
K7 werd geïnoculeerd in 2,2 x 10 7 cfu ml -1 en na 7 uur simulatie een concentratie van 10 5 cfu ml -1 levende cellen nog aanwezig in de cultuur media (figuur 7, curve voor 250 ml pre-cultuur). De grootste vermindering in overleving was binnen de eerste 2 uur en begon onmiddellijk na de toevoeging van maagzuur en galzouten. Gedurende deze tijd was er een vermindering van de levende cellen door log 2. De rest van de simulatie tijd was er slechts een 1 log reductie van levende cellen. Figuur 7 Vergelijking van de invloed van 100 ml voorkweek van Lactobacillus gasseri K7 met 250 ml voorkweek. De pre-kweek werd geoogst door centrifugatie en gehersuspendeerd in fysiologische zoutoplossing tot een OD600 van 1,5 te bereiken. De maag-darmpassage simulatie werd geïncubeerd met de aangepaste oplossing en gedurende 7 uur. De stippellijn toont de toevoeging van galzouten en pancreas sap. Curves zijn het gemiddelde van duplo experimenten. Ondernemingen De bereiding van de entstof van L. gasseri
K7 in een cultuur volume van 100 ml werd ook geëvalueerd. De resultaten van de experimenten worden getoond in figuur 7. 250 ml kweek de afname van levende cellen was ongeveer log 2 terwijl de afname met 100 ml kweek werd slechts 1 log over de gehele incubatietijd. Echter, 2 uur na toevoeging van galzouten en pancreas sap, de daling van celtellingen was gelijk voor beide volumes.
Discussie
Bij het oogsten van een cultuur na een bepaalde incubatietijd, de groeifase van elke bacteriestam kan worden anders omdat hebben allemaal verschillende groeidynamiek. Om cellen op ongeveer dezelfde groeifase verkrijgen, werden voorlopige experimenten uitgevoerd (gegevens niet getoond). Een incubatietijd van 15 uur voor de voorkweek was geschikt voor alle geteste stammen behalve Bifidobacterium longum
subsp. infantis
die moesten worden geïncubeerd slechts 12 uur. Ondernemingen De zuur tolerantie screening (figuren 2, 3 en 4) werd uitgevoerd om het effect van pH onafhankelijk van andere te evalueren. Bifidobacterium dentium
was zeer gevoelig voor zuur en daarom zouden misschien niet de doorgang door de maag te overleven. De stam is daarom niet opgenomen in de simulatie-experimenten. De B. longum
stammen (figuur 2) niet veel betere resultaten dan B. dentium
(figuur 3) werd verkregen. Echter, in de buurt van pH 4 waren ze beter bestand dan B. dentium
.
B. longum
subsp. infantis
is een van de eerste soort aan de menselijke darm te bevolken kort na de geboorte [26]. Gebaseerd op de experimenten in deze studie is echter de geteste B. longum
subsp.
infantis stam zou alleen kunnen de maag baby in hoge aantallen passeren wanneer de overgangstijd van de zure maag was zeer kort. De overleving van de geselecteerde stam in het geteste omgeving is te laag voor een succesvolle passage in grote aantallen. Wanneer de stam werd geresuspendeerd in afgeroomde melk, overleving verhoogd (Figuur 5). Dit kan een indicatie zijn dat de moedermelk helpt B. longum
subsp zijn. infantis stammen
het maag-darm passage passen met een hogere overlevingskans. Ondernemingen De beschermende effecten van melkeiwitten in het spijsverteringssysteem zijn reeds beschreven in de literatuur [27]. Beschermende melkproteïnen is ook aangetoond in deze studie (figuur 5). Met de juiste matrix of zelfs een drager, kon probiotische bacteriën veilig door de maag naar de darmen doorgeven aan hun plaats van werking te bereiken.
B. adolescentis
stammen die de menselijke darm op latere leeftijd bevolken, hadden iets hogere weerstand dan B. longum
subsp. infantis
eventueel tijdens de voortgang van de menselijke zuigeling de vermindering daarvan uitleggen volwassenheid [26]. Ondernemingen De interessantste stam B. animalis
subsp. lactis
, waarbij de minst gevoelige stam in onze studie was. Deze pH-resistente stam heeft een groot potentieel voor toepassing in voedingsmiddelen probiotisch supplement omdat een groter aantal bacteriecellen zou de doorgang overleven. Echter, deze stam als probiotica, meer studies moeten worden uitgevoerd om de probiotische toestand volgens de definitie van Klaenhammer [3].
In ons onderzoek bereiken, de inname van een levensmiddel matrix werd gesimuleerd in een eerste omgeving van aangezuurde melk en groeimedium. De toegevoegde gesimuleerde gastrische oplossing en zuurstof in de maag fase verhoogde stress. Tijdens de gesimuleerde passage naar de dunne darm werd zuurstof door stikstof vervangen en het medium werd geneutraliseerd tot pH 6,3. De toevoeging van de pancreas oplossing en galzouten voltooide de passage naar de dunne darm. Deze in-vitro
systeem geen rekening mee gehouden dat in in vivo
spijsvertering, enzymen worden geactiveerd en geïnactiveerd en andere stoffen, bijv. galzouten worden geabsorbeerd. Sumeri et al
. [9] vond een gedeeltelijke oplossing voor dit probleem te omzeilen. Het verdunde inhoud van de reactor met een speciaal verdunningsmiddel. Een andere mogelijkheid is de galzouten precipiteren eind simulatie van de dunne darm aan de enterohepatische kringloop imiteren. Dit kan worden uitgevoerd met calciumionen [28-30]. Verwijderen van galzouten beter simuleren van de omgeving van de dikke darm en misschien zelfs mogelijk bifidobacteriën te prolifereren.
In onze studie, de resterende galzouten en pancreas sap in de simulatie leiden tot een additionele spanning op bacteriën die waarschijnlijk de ware kenmerken veranderd van de stammen in vivo
. Ondernemingen de start kve in de simulatie gevarieerd binnen een log kve hoewel de aanpassing van de OD 650 van de entstof werd eerder getest met de Bifidobacterium animalis
subsp. lactis Kopen en Bifidobacterium longum
subsp. infantis
stammen. De bifidobacteriën die in deze studie een neiging tot clusters die kunnen leiden tot verminderde cfu (visuele waarneming, gegevens niet getoond) te vormen. In een andere studie kon clustervorming verband houden met afnemende pH tijdens de groei [31]. Deze clusters worden gewoonlijk als één kolonie op een plaat.
Figuur 6 toont de resultaten van het maag-darm passage simulatie dan 7 uur zeven geteste stammen Bifidobacterium
. De concentratie van levende cellen bifidobacteriën daalde onmiddellijk na incubatie vanwege de lage pH (pH 3,0). Echter, B. animalis
subsp. lactis
bleef stabiel. Dit bevestigde de resultaten van eerdere experimenten hierboven (figuur 4) besproken. Deze weerstand kan worden uitgebreid tot zouten en pancreas sap, hoewel de cel tellingen van B. animalis
subsp gal. lactis
daalde met ongeveer 85% van de oorspronkelijke waarde (figuur 6). Vergeleken met de andere stammen die in deze studie, maar deze afname is bijna te verwaarlozen.
Al B. longum Kopen en B. breve
stammen stierven snel aan het begin van de simulatie en waren onder de detectielimiet beperking van de bekledingsmethode binnen enkele uren (Figuur 6) die zou worden verwacht van de resultaten van de screening experiment hierboven (figuren 2 en 4).
anderzijds, B. longum
subsp. infantis
14.390 nam snel begin simulatie, maar na toevoeging van pancreas sap en galzouten en een verandering in een anaërobe omgeving, de verlaging daalde. Onze studie suggereert dat deze stam goed aangepast aan de omstandigheden in de darmen maar moet worden ingenomen in hoge aantallen de omstandigheden in de maag (zuurstof, lage pH) overleven. Zoals hierboven vermeld, B. longum
subsp.
infantis stammen behoren tot de eerste groep van bacteriën vullen van de darm van zuigelingen [26].
Anders dan B. longum
subsp. infantis
, B. adolescentis
daalde bijna lineair tijdens de 7 h simulatie. Er was geen detecteerbare onderbreking wanneer de omstandigheden in de fermentor veranderd. Gebaseerd op de experimenten van het zuur tolerantie screening, dit resultaat was onverwacht.
Echter kan worden gerelateerd aan de testomstandigheden waarbij het galzout en maagsap concentraties bleef op het beginniveau en niet verdund zoals ze zouden zijn vivo
. In een volgende experiment moet worden nagegaan of de verdunningsmethode ontwikkeld door Sumeri et al
. [9] zou de celtellingen stabiliseren van B. adolescentis
tijdens de 6 uur simulatieperiode in de darm.
In ons onderzoek evalueerden we ook maag-darm passage van Lactobacillus gasseri
K7. De stam is reeds geëvalueerd op overleving in vivo
biggen [14]. Derhalve was het mogelijk om onze in vitro
resultaten te vergelijken met gegevens uit in vivo experimenten
.
Bogovic et al
. [14] gevoerd biggen gedurende een periode van 14 dagen met 5 * 10 10 kve dag -1 van L. gasseri
K7. Dit resulteerde in circa. 7 * 10 4 kve g -1 in de faeces tijdens het voederen periode. Heeft het feit dat de concentratie bacteriën werd verdund voordat het eindelijk tot het maag-darm passage te nemen. In een ruwe benadering, we geschat dat ongeveer 1% aangekomen bij de passage. Dit liet ons toe om de resultaten van deze studie biggetje vergelijken met het eind van de simulatie.
Zoals getoond in figuur 5, L. gasseri
K7 had een celconcentratie van ongeveer 5 * 10 4 kve ml -1 na 7 h simulatieperiode (met een voorkweek van 250 ml) die overeenkomt met de concentratie in de faeces van de biggen. Dit suggereert dat het simulatiemodel gebruikt in deze studie een nuttig hulpmiddel om de effecten van de passage te schatten in een in-vitro model
vóór gebruik van dure
in vivo modellen kunnen zijn. Het model kan verder worden geoptimaliseerd door het verdunnen van de galzouten en pancreas sap, zoals beschreven door Sumeri et al
. [9]. Om de activering en deactivering van enzymen een geschikte methode nog worden gevonden simuleren.
Wanneer alleen 100 ml medium werd gebruikt voor het inoculum van L. gasseri
K7, de kweek overleefde de simulatie beter (Figuur 7). Beide volumes had een soortgelijke initiële celgetal. Beide volumes werden geënt door 1 ml. Daarom is de kweek met 250 ml volume was in een eerder stadium van groei dan de 100 ml kweek. Deze resultaten zijn een indicatie van de groeifase afhankelijkheid van de cultuur tijdens stress.
Conclusie
In deze studie, waren we in staat om aan te tonen dat het systeem naar de maag-darm passage ontwikkeld door Sumeri et al
. [9] geschikt was voor de beoordeling van de overleving van 8 Bifidobacterium
stammen en Lactobacillus gasseri
K7 hoewel we niet de verwijdering van maagsap en galzouten simuleren. Voor L. gasseri
K7 konden we de resultaten te vergelijken met een in vivo studie van
biggen en verkregen vergelijkbare resultaten. Ondernemingen De enkelvoudige reactorsysteem gepresenteerde maakt een meer rechtstreekse identificatie van het ideale groeifase voor eventuele probiotische stam die is vereist om het maag-darm doorgang passeren dan indien zij worden uitgevoerd met andere systemen met een moeilijke opstart. Ondernemingen de studie toonde ook aan dat alle geteste stammen Bifidobacterium
, behalve B. animalis
subsp. lactis
zou beschermende middelen nodig om de doorgang door de maag-darm in hoge aantallen overleven. Dit kan worden gedaan met behulp van een geschikte voedsel matrix of inkapseling van de cellen.
Methods
Bacteriële stammen
Al bifidobacteriën stammen werden geselecteerd uit de stam collectie van Agroscope Liebefeld-Posieux ALP Research Station Zwitserland, geïsoleerd door ALP uit menselijke bronnen. Lactobacillus gasseri
K7 is ontstaan ​​vanuit de ZIM Collection of Industrial Micro-organismen van de Universiteit van Ljubljana, Biotechnische Faculteit (ZIM 105) [10] en werd ook gedeponeerd in de ALP stam collectie. De geteste stammen en hun identificatienummers van de ALP stammencollectie staan ​​vermeld in tabel 3. Alle bifidobacteriën stammen zijn het eigendom van ALP.
Media en de groeiomstandigheden
Voor pre-culturen, 1 ml bevroren conserven van de stammen waren geënt in 250 ml Wilkins-Chalgren bouillon (WC CM0643, Oxoid, Hampshire, UK), aangevuld met 9 gl -1 extra lactose-monohydraat (Bifidobacteria) of De Man-Rogosa-Sharpe (MRS; Biolife, Milaan, Italië) medium (Lactobacillus gasseri
K7) [32]. Voor L
. gasseri K7, een proef met een 100 ml pre-culture werd ook uitgevoerd. Alle stammen, met uitzondering van Bifidobacterium longum
subsp. infantis
werden geïncubeerd bij 37 ° C gedurende 15 uur onder anaërobe omstandigheden. Bifidobacterium longum
subsp. infantis
werd gedurende 12 h aangezien het zeer gevoelig voor verlengde incubatietijd. De pre-kweken werden gedurende 15 minuten bij 3500 rpm en de pellets opnieuw gesuspendeerd in 10 ml met fosfaat gebufferde fysiologische zoutoplossing (PBS).
Bepaling van cellen
celgetal werd bepaald door 10-voudig seriële verdunning van de kweek in fysiologische zoutoplossing. De twee hoogste verdunningen werden vervolgens uitgeplaat op MRS-agar (Biolife, Milaan, Italië) met behulp van een spiraal Plater (IUL Instruments, Barcelona, ​​Spanje) en geëvalueerd door een geautomatiseerde kolonie teller met de bijbehorende software (IUL Instruments, Barcelona, ​​Spanje).
screening op zuurbestendigheid
voor de zuurbestendigheid screening van de geconcentreerde celsuspensie van de voorkweek werd gepipetteerd in 20 ml PBS totdat een OD 650 van 1,0 werd bereikt. 4 ml van deze celsuspensie werden vervolgens geïnoculeerd in 16 ml citraat-HCl-buffer (tri-Na-Citratex2 H 2O 7,35 g en 250 ml gedestilleerd H 2O, aangepast aan de corresponderende pH met 1 M HCl) bij pH's van 2,0, 2,5, 3,0, 3,5 en 4,0. De incubatie werd uitgevoerd bij 37 ° C en monsters werden elke 30 min op 120 min. 1 ml monsters werden gemengd met 9 ml 0,25 M fosfaatbuffer bij pH 7,0 in de eerste stap van de verdunningsreeks. Voor de resistentietest zuur in een voedingsmatrix, evenveel voorkweek zoals hierboven gebruikt (aangepast tot een OD 650 van 1,0) werd gepipetteerd in 20 ml UHT magere melk. 4 ml van deze celsuspensie in melk werd geïnoculeerd in 16 ml citraat-HCl-buffer. Alle chemicaliën werden gekocht bij Merck (Darmstadt, Duitsland). De gegevens voor de screening experimenten werd gevisualiseerd in contour plots met de Sigmaplot 11,0 software (Systat Software Inc., Chicago IL, USA).
Simulatie in de bioreactor Leer Alle oplossingen werden vers bereid voor elk experiment. Gesimuleerde maag oplossing bereid van 50 mg pepsine varkens maagslijmvlies (Sigma-Aldrich P7012, Buchs, Zwitserland) in 20 ml 0,1 M HCl. Voor de gesimuleerde Pancreassap 2 g pancreatine (Sigma-Aldrich P7545) werden opgelost in 50 ml 0,02 M fosfaatbuffer bij een pH van 7,5. Gesimuleerde galzout oplossing bereid van 7,5 g runder gal (Sigma-Aldrich B3883) aangevuld tot 50 ml met gedestilleerd H 2O. De bouillon voor de simulatie was ofwel 1 l wc of MRS bouillon met 29,41 g tri-natrium citratex2 H 2O. Tijdens het testen van overleving in een voedingsmatrix, 500 ml UHT taptemelk toegevoegd en de pH werd ingesteld op 3,0 met 5 M HCl kort voor de simulatie. 1 liter medium toegevoegd aan de bioreactor (NewMBR Mini NewMBR, Zwitserland), vooraf gesteriliseerd met water (121 ° C, 20 min) en verhit tot 37 ° C. Tijdens de maag simulatie werd beluchting toegepast. De fermentatie werd gecontroleerd en geregistreerd met behulp van de geïntegreerde process management software Lucullus (Biospectra, Schlieren, Zwitserland). De geconcentreerde celsuspensie van de voorkweek werd gepipetteerd in 40 ml PBS om een ​​OD 650 van 1,5. Kort voor de inoculatie van 40 ml celsuspensie werd 20 ml van de gesimuleerde maag oplossing aan het medium (1 liter) in de bioreactor toegevoegd.

• Risicobeoordeling van maagkanker in verband met asbestose: een case report
• Bactericide activiteiten van de kationische steroid CSA-13 en cathelicidin peptide LL-37 tegen Helicobacter pylori in gesimuleerd maagsap