Evaluering av passering av Lactobacillus gasseri K7 og bifidobakterier fra magen til tarmen ved hjelp av en enkelt reaktor modell

Evaluering av passasjen av Lactobacillus gasseri
K7 og bifidobakterier fra magen til tarmen ved hjelp av en enkel reaktor modell
Abstract
Bakgrunn
Probiotiske bakterier er tenkt å spille en viktig rolle i fordøyelsessystemet, og derfor har for å overleve passasje fra magesekken til tarmen. Nylig ble en ny tilnærming for å simulere passering fra magen til tarmene i en enkelt bioreaktor utviklet. Fordelen med denne automatiske en reaktorsystem var evnen til å teste innvirkningen av syre, gallesalter og pankreatin.
Lactobacillus gasseri
K7 er en stamme isolert fra spedbarn feces med egenskaper som gjør stammen interessant for osteproduksjon. I denne studien ble et enkelt reaktorsystem som brukes til å evaluere overlevelse av L. gasseri
K7 og utvalgte bifidobakterier fra vår samling gjennom mage-tarm passasje.
Resultater
innledende screening for syre motstand i forsurede kultur media viste en lav toleranse av Bifidobacterium dentium
for denne tilstanden som indikerer lav overlevelse i passasjen. Lignende resultater ble oppnådd med B. Longum
subsp. infantis
mens B. animalis
subsp. lactis
hadde en høy overlevelse.
Disse første resultater ble bekreftet i bioreaktoren modell av mage-tarm kanal. B. animalis
subsp. lactis
hadde høyest overlevelsesrate (10%) oppnå tilnærmet 5 x 10 6 cfu ml -1 i forhold til de andre testede stammer bifidobakterier som ble redusert med en faktor på opp til 10 6 . Lactobacillus gasseri
K7 var mindre motstandsdyktig enn B. animalis
subsp. lactis
men overlevde på cellekonsentrasjoner ca 1000 ganger høyere enn andre bifidobakterier.
Konklusjon
I denne studien, var vi i stand til å vise at L. gasseri
K7 hadde en høy overlevelse i mage- tarmen passasje. Ved å sammenligne resultatene med en tidligere studie i grisunger kan vi bekrefte påliteligheten av vår simulering. Av de testede bifidobakterier stammer, bare B. animalis
subsp. lactis
viste akseptabel overlevelse for en vellykket passasje i simuleringen systemet.
Bakgrunn
Probiotika, særlig melkesyrebakterier ha gunstige effekter på forbrukere helse som foreslått i 1907 [1]. Det ble antatt at bakterier i hovedsak styrt infeksjoner forårsaket av enteriske patogener og regulert toxoaemia, og dermed bedre helse og påvirke dødelighet. I mellomtiden har det vært kjent at noen av de positive effekter på forbrukere helse er forbedringen av mikrofloralikevekt i tarmen, stimulering av immunsystemet, og hjelpe organismen til å bekjempe patogene mikroorganismer [2]. En stor del av interesse ble konsentrert på anvendelsen av stammer av slektene Lactobacillus
og Bifidobacterium
, selv om det finnes også andre bakterier med probiotiske effekter, f.eks noen propionsyrebakteriene.
De ovennevnte egenskaper er også grunnlaget for en mikroorganisme som skal merkes probiotiske. Det finnes ulike definisjoner på verdensbasis, men de er like i innhold. Ett av kriteriene for en probiotisk stamme er dens motstand mot syre og mage løsninger i fordøyelsessystem [3]. Det er derfor viktig å vurdere motstanden av en potensiell probiotisk stamme til det sure og gastrisk miljø i tarmen.
Grunn av høye kostnader og etiske så vel som sikkerhetsbestemmelser for kliniske studier, screening overlevelse er lettere å simulere in vitro
. En enkel test er å inkubere de bakterielle cellene i sure eller gallesaltoppløsninger i en definert periode og telle antallet overlevende celler. I et ytterligere trinn blir simuleringen utført i omrørte kolber, som kombinerer surhet og gastriske løsninger, etterfulgt av en estimering av overlevende celler over hele simuleringen. Dette er en mer realistisk replikasjon av forholdene i tarmen [4]. Et annet system, simulator av den menneskelige tarm mikrobiell økosystem (Shime), består av 5 til 6 seriekoblede pH-kontrollert bioreaktorer [5-7]. Oppsettet er ganske komplisert, og krever absolutt anaerobe forhold. Videre er absorpsjonen av metabolitter og vann ikke simulert. Dette ble overvunnet ved hjelp av dialysemembraner som beskrevet av Mareau et al
. [8].
Nylig har et nytt system med en enkelt bioreaktor ble utviklet for å studere mage-tarmgjennomgang [9]. Systemet tillot pH endres i én reaktor og ble tilpasset oppholdstidene i de forskjellige regionene i mage-tarmpassasjen.
Lactobacillus gasseri
K7 ble nylig isolert fra baby avføring [10]. Det gir en bakteriosin som er aktive mot Clostridium
sp. og sine sporer. L. gasseri
tilhører den såkalte "acidophilus" -gruppe og flere uavhengige studier identifisert disse stammene som innbyggerne i huden og tarmen [11-13]. I tidligere forsøk, har det allerede blitt vist in vitro at
L. gasseri
K7 overlevde i et surt miljø og med 0,3% gallesalter [10]. Disse funnene gjøre belastningen interessant som et probiotisk mulig.
I denne studien ble et enkelt bioreaktor system basert på arbeidet til Sumeri et al
. [9] ble brukt til å evaluere overlevelse av Lactobacillus gasseri
K7 og åtte Bifidobacterium
stammer fra samlingen vår. Vi var i stand til å sammenligne resultatene for L. gasseri
K7 med en studie utført i grisunger [14] som tillot vurderingen av en korrelasjon mellom in vitro
studie med resultater fra in-vivo
eksperimenter . Bedrifter den retensjonstider og pH brukt i denne studien var basert på data fra litteraturen. Det finnes flere metoder for måling av pH i tarmen [15]. Tabell 1 viser pH-verdiene i de forskjellige deler av tarmen, målt ved den Heidelberg kapsel [16, 17]. Tilbakeholdelsestider kan beregnes enten ved å bruke markør stoffer (kjemiske) eller ved radiotelemetri kapsler som Heidel
kapsel [18]. Imidlertid, kapslene vanligvis har lengre oppholdstider enn kjemiske markører. Tabell 2 lister noen av oppholdstider som finnes i litteraturen [4, 5, 19-24] .table 1 pH-verdier i mennesketarmkanalen, målt med Heidel
kapselen.

magen
tolvfingertarmen
jejunum
ileum
proksimale
medial
Distal
pH
1,4 **
6,22 *
6,4 **
7,1 **
7,4 ** product: * Fallingborg et al
. 1994 [16]
** Fallingborg et al
. 1998 [17] Hotell Tabell 2 Retensjonstider i tynntarmen sitert i litteraturen.
Oppholdstid
Kilde
Merknader

1-4 h
Huang og Adams 2004 [21]
4,25 h
Van Den Driessche et al
. 2000 [24]
magesekken og tynntarmen
4 h
Mojaverian 1996 [22]
6 timer
Picot og Lacroix 2004 [4]
Valgte maksimal tid på simulering
7,5 h
Fallingborg et al
. 1990 [20]
Barn
8 h
Fallingborg et al
. 1989 [19]
8 h
Alander et al
. 1998 [5]
Simulering i Shime Reactor
6-10 h
Thews et al
. 1991 [23] Hotell Basert på data som finnes i litteraturen, og arbeidet ved Sumeri et al
. [9] gjæringsprosessen ble satt opp som beskrevet i Materiale og metode og er vist i figur 1. Figur 1 Parametere i magen og tarmpassasjen simulering over 7 timer.
Resultater
Acid motstand screening
Målet for en første serie av tester var å få en oversikt over syreresistensen til åtte bifidobakterier stammer. Figurene 2, 3 og 4 viser overlevelse av disse stammer ved hjelp av konturplott laget med Sigmaplot. Bifidobacterium dentium
(figur 3) viste at minst syreresistensen. Mellom pH 4,0 og pH 2,0 var det ingen forskjell i overlevelse og konsentrasjonen av celler falt med mer enn 7 log i løpet av 40 minutter. Bifidobacterium animalis
subsp. lactis
var mer motstandsdyktig opp til 40 minutter ved pH 2,0, men deretter redusert med ca 3 log når inkubert i 120 minutter (figur 4). Ved en pH-verdi mellom 2,5 og 3,0 nedgangen var mindre enn en log etter 120 minutter. Figur 2 Acid motstand av tre Bifidobacterium longum stammer. X-aksen: (min); Y-akse: pH; log cfu er vist i farger (skala på høyre side av grafene). Tall i de bakterielle navnene er strekk tallene i FAM-database med ALP.
Figur 3 Acid motstand av Bifidobacterium dentium, B. Longum subsp. infantis og B. adolescentis. X-aksen: (min); Y-akse: pH; log cfu er vist i farger (skala på høyre side av grafene). Tall i de bakterielle navnene er strekk tallene i FAM-database med ALP.
Figur 4 Acid motstand av Bifidobacterium breve og B. animalis subsp. lactis. X-aksen: (min); Y-akse: pH; log cfu er vist i farger (skala på høyre side av grafene). Tall i de bakterielle navnene er strekk tallene i FAM-database med ALP.
Alle de andre testede Bifidobacterium
stammer (B. Longum, B. breve, B. Longum
subsp. Infantis og B. adolescentis
) viste en lignende, men annet mønster fra B. animalis
subsp. lactis
(figur 2, 3 og 4). De hadde en kort overlevelsestid under pH 2,5 og overlevde i høyere tall over pH 3,5.
Med det mål å utvikle en metode for å simulere GI i bioreaktoren, ble en ytterligere test utført med en belastning. Å observere påvirkning av en mat matrise, konsentrert B. Longum
subsp. infantis
ble resuspendert i skummet melk før inoculating i sure løsninger. Som vist i den høyre kolonne av fig 5, melk hadde en direkte effekt på overlevelse av stammen. Mellom pH 3,0 og 3,5 bakterien overlevde i 120 minutter med en reduksjon av log 2. Under pH 3,0 overlevelsesraten reduseres til omtrent log 5. Nedgangen i overlevelse under pH 3,0 var rask, men regelmessig over tid. Ved pH 3,5 og over, belastningen var bestandig i minst 120 minutter. Figur 5 Sammenligning av syreresistensen til Bifidobacterium longum subsp. infantis 14390 suspendert i NaCl eller skummet melk. Venstre: Bifidobacteria resuspendert i NaCl, høyre: Bifidobacteria resuspendert i melk. X-aksen: (min); Y-akse: pH; log cfu er vist i farger (skala på høyre side av grafene). Tall i de bakterielle navnene er strekk tallene i FAM-database med ALP.
Venstre kolonne i figur 5 viser den samme belastningen uten tilsatt skummet melk. Ved en pH over 3,5, var det ingen effekt på overlevelsen av bakteriene. Imidlertid, under pH 3,5 ble redusert overlevelse avhengig av varigheten av inkubasjonen. Mellom pH 3,0 og 3,5 belastningen hadde allerede redusert med ca logge 5. Etter 30 min inkubasjon, var det nesten en lineær reduksjon i overlevelse med synkende pH 3,0 til 2,5.
Simulering i bioreaktor
De fleste systemer som er beskrevet i litteraturen bestå av flere reaksjonsbeholdere, f.eks den Shime [6]. Andre studier anvendes immobiliserte celler med tre reaktorer [25], eller et dialysesystemet [8]. Basert på arbeidet til Sumeri et al
. [9] og de innsamlede data for tilstander i tarmpassasjen var vi i stand til å begrense simuleringen til en fartøy. Sammen med dataene fra syreresistensen screening, kan valg av en mulig start pH og kokes blandingen i simulatoren velges. De resulterende simuleringsparametrene er vist i figur 1 og beskrevet i Materiell og Metoder seksjon. Under den eksperimentelle fasen av denne studien, Sumeri et al
. [9] utviklet et tilsvarende system for å evaluere Lactobacillus
sp. i en mage-tarm kanal simulering.
programvarepakken "Lucullus" var et utmerket verktøy for å regulere pH, og fremgangsmåten i henhold til den utviklede simuleringen. Valg av mediet i bioreaktoren ble forenklet ved å velge den tilsvarende vekstmedium for stammene, supplert med skummet melk, fungerer som en simulert mat matrise. Deretter ble det surgjort til utgangs-pH-verdien og suppleres med enzymløsninger, som beskrevet i Materialer og Metoder. Simuleringene ble utført serielt, én per dag. Resultatene er vist i Figur 6. De stammer som ble anvendt for simuleringen er oppført i tabell 3 (bare Bifidobacterium dentium
ble utelatt), og ble standardisert til en OD 650 1,5 før inokulering. Figur 6 Utvikling av 7 Bifidobacterium stammer i løpet av mage-tarmpassasjen simulering i 7 timer. Stiplet linje viser tidspunktet for tilsetning av gallesalter og bukspyttkjertelen juice. Tall i de bakterielle navnene er strekk tallene i FAM-database med ALP.
Tabell 3 Stammer testet i simuleringen.
Navn
Organisasjonsnummer av ALP belastning samling
Bifidobacterium adolescentis
FAM-14377
Bifidobacterium breve
FAM-14398
Bifidobacterium longum
subsp. infantis
FAM-14390
Bifidobacterium animalis
subsp. Lactis
FAM-14403
Bifidobacterium dentium
FAM-14396
Bifidobacterium longum
FAM-14382, -14383, -14406
Lactobacillus gasseri
K7
FAM-14459
Bifidobacterium adolescentis
ble inokulert som beskrevet ovenfor med en initial konsentrasjon på 10 7 cfu ml -1 og redusert nesten lineært til under 10 4 cfu ml -1 etter 5 timer. B. breve Hotell og B. Longum
stammer hadde en innledende konsentrasjon mellom 10 7 og 10 8 cfu ml -1 og redusert til under 10 2 cfu ml -1 i løpet av de første 30 minutter. B. animalis
subsp. lactis
14403 levde til ca 15% av den opprinnelige gjennomsnittlig cfu av 5 × 10 8 cfu ml 1. Det var en rask reduksjon i overlevelsen av B. Longum
subsp. infantis
over første 30 min. Etterpå overlevelse redusert bare langsomt fra 10 5-10 4 cfu ml 1.
I en senere fase, Lactobacillus gasseri
K7 ble inkludert i studien, siden flere prosjekter ble publisert på denne tiden ved vårt institutt med denne belastningen. Lactobacillus gasseri
K7 ble inokulert ved 2,2 x 10 7 cfu ml -1 og etter 7 timer simulering en konsentrasjon på 10 5 cfu ml -1 levende celler var fortsatt til stede i kulturmedia (figur 7, kurve for 250 ml pre-kultur). Den høyeste reduksjon i overlevelse var i løpet av de første 2 timene, og startet umiddelbart etter tilsetningen av mavesaft og gallesalter. I løpet av denne tiden var det en reduksjon av levende celler ved hjelp av log 2. Under resten av simuleringen tid, var det bare en log en reduksjon av levende celler. Figur 7 Sammenlikning av innflytelsen av 100 ml forkultur av Lactobacillus gasseri K7 med 250 ml forkultur. Den pre-kulturen ble høstet ved sentrifugering og resuspendert i fysiologisk saltoppløsning for å oppnå en OD600 på 1,5. Den mage-tarmpassasjen simuleringen ble inkubert ved hjelp av innstilte oppløsning og inkubert i 7 timer. Den stiplede linjen viser tilsetning av gallesalter og bukspytt. Kurvene er gjennomsnittet av duplikate eksperimenter.
Fremstillingen av inokulum av L. gasseri
K7 i en 100 ml kulturvolum ble også evaluert. Resultatene av eksperimentene er vist i figur 7. Med 250 ml kultur nedgangen i levende celler var omtrent log 2, mens reduksjonen med en 100 ml kultur ble bare logge en over hele inkubasjonstiden. Imidlertid, 2 timer etter tilsetning av gallesalter og bukspyttkjertel juice, nedgangen i celler var lik for begge volumer.
Diskusjon
Når høsting av en kultur etter en gitt inkubasjonstid, kan vekstfasen av hver bakteriestamme bli annerledes siden alle har ulike vekstdynamikk. For å oppnå celler ved omtrent den samme vekstfase, ble preliminære eksperimenter utført (data ikke vist). En inkubasjonstid på 15 timer for pre-kulturen var egnet for alle de testede stammer bortsett fra Bifidobacterium longum
subsp. infantis
som trengs for å bli inkubert i bare 12 timer.
syre toleranse screening (figurene 2, 3 og 4) ble utført for å evaluere effekten av pH-verdi uavhengig av andre forhold. Bifidobacterium dentium
var svært følsom for syre, og derfor ville muligens ikke overleve passasje gjennom magen. Stammen ble derfor ikke inkludert i simuleringseksperimenter. Den B. Longum
stammer (figur 2) ikke gi mye bedre resultater enn B. dentium plakater (figur 3). Men nær pH ​​4 de var mer motstandsdyktig enn B. dentium
.
B. Longum
subsp. infantis
er en av de første art for å fylle den humane tarmen kort tid etter fødselen [26]. Basert på eksperimenter i denne studien, men det testet B. Longum
subsp. infantis
belastning ville bare være i stand til å passere barnet magen i høye tall dersom overgangen tid i det sure magen var svært kort. Overlevelsen av den valgte stamme i den testede miljøet var for lavt for vellykket passasje i høye tall. Når stammen ble resuspendert i skummet melk, overlevelse øket (figur 5). Dette kan være en indikasjon på at morsmelk hjelper B. Longum
subsp. infantis-stammer
å passere mage-tarm kanal med en høyere overlevelse.
Den beskyttende effekt av melkeproteiner i fordøyelsessystemet har allerede blitt beskrevet i litteraturen [27]. Beskyttelse med melkeprotein er også vist i denne studien (figur 5). Med riktig matrise eller en operatør, kan probiotiske bakterier trygt passere gjennom magen til tarmene til å nå sitt virknings.
B. adolescentis
stammer som befolker den menneskelige tarmen ved en senere alder, hadde litt høyere motstand enn B. Longum
subsp. infantis
som kan forklare reduksjonen av sistnevnte under utviklingen av den menneskelige spedbarn til voksen alder [26].
mest interessante stammen var B. animalis
subsp. lactis
, som var den minst følsomme belastning i vår studie. Denne pH-resistent stamme har et stort potensial for bruk i matvarer som en probiotiske supplement siden en høyere antall bakterieceller ville overleve passasjen. Imidlertid, for å bruke denne stammen som probiotiske, flere studier må utføres for å oppnå den probiotiske status i henhold til definisjonen av Klaenhammer [3].
I vår undersøkelse ble inntak av en matvare matrise simulert i en innledende miljø av surgjort melk og vekstmedium. Den ekstra simulert mage oppløsning og oksygen under magen fase øket stress. I løpet av det simulerte passasje til tynntarmen oksygen ble erstattet med nitrogen, og mediet ble nøytralisert til pH 6,3. Tilsetningen av de pankreatiske løsning og gallesalter fullført passasjen i tynntarmen. Denne in vitro
systemet ikke tar hensyn til at det i in vivo
fordøyelsen, er enzymer aktiveres og inaktiv og andre stoffer, f.eks gallesalter blir reabsorbert. Sumeri et al
. [9] funnet en delvis løsning for å omgå dette problemet. De fortynnes innholdet i reaktoren med en spesielt utformet fortynning medium. En annen mulighet ville være å utfelle de gallesalter ved slutten av simuleringen av tynntarmen for å etterligne den enterohepatiske krets. Dette kan utføres med kalsiumioner [28-30]. Fjerning av gallesalter ville bedre simulere miljøet i tykktarmen, og kan til og med tillate bifidobakterier å spre seg.
I vår studie, de resterende gallesalter og bukspyttkjertelen juice i simuleringen førte til en ekstra stress på bakterier som sannsynligvis forandret den sanne kjennetegn av stammene i vivo
.
starter cfu i simuleringen varierte innenfor en log cfu selv om justering av OD 650 av pode ble tidligere testet med Bifidobacterium animalis
subsp. lactis Hotell og Bifidobacterium Longum
subsp. infantis
stammer. De bifidobakterier brukt i denne studien viste en tendens til å danne klynger som kan resultere i redusert cfu (visuelle observasjoner, data ikke vist). I en annen studie, kunne dannelsen av klynger ha sammenheng med avtagende pH-verdi under vekst [31]. Disse grupper er vanligvis regnes som en koloni på en plate.
Figur 6 viser resultatene av mage-tarm kanal simulering over 7 timer på syv testede Bifidobacterium
stammer. Konsentrasjonen av levende celler av bifidobakterier ble redusert umiddelbart etter inkubasjon på grunn av den lave pH (pH 3,0). Men B. animalis
subsp. lactis
holdt seg stabil. Dette bekreftet resultatene fra tidligere forsøk som er omtalt ovenfor (figur 4). Denne motstanden kan bli utvidet til galle salter og bukspyttkjertelen juice selv om legemer på B. animalis
subsp. lactis
redusert med ca 85% av den opprinnelige verdien (figur 6). Sammenlignet med de andre stammene brukt i denne studien, men denne nedgangen var nesten ubetydelig.
All B. Longum Hotell og B. breve
stammer døde svært raskt i begynnelsen av simuleringen og var under deteksjons grensen for pletteringsmetoden i løpet av få timer (figur 6) som var å forvente ut fra resultatene av screeningen eksperimentet ovenfor (figurene 2 og 4).
på den annen side, B. longum
subsp. infantis
14390 falt raskt ved begynnelsen av simuleringen, men etter tilsetning av bukspytt og gallesalter og en endring i et anaerobt miljø, redusert reduksjonsforhold. Vår studie tyder på at denne belastningen er godt tilpasset forholdene i tarmen, men må svelges i høye tall for å overleve forholdene i magen (oksygen, lav pH). Som nevnt ovenfor, B. longum
subsp. infantis
stammer tilhører den første gruppe bakterier fyller tarmen hos spedbarn [26].
I motsetning til B. longum
subsp. infantis
, adolescentis B.
redusert nesten lineært i løpet av 7 timer simulering. Det var ingen påvisbar avbrudd når betingelsene i fermentoren er endret. Basert på eksperimenter for syren toleranse screening, dette resultatet var uventet.
Dette kan imidlertid være relatert til testbetingelsene hvor gallesalt og magesaft konsentrasjonene forble på det opprinnelige nivå og ble ikke fortynnet som de ville være i vivo
. I en fremtidig eksperiment bør det vurderes hvorvidt fortynningen metode utviklet av Sumeri et al
. [9] ville stabilisere celletall av B. adolescentis
løpet av 6 timer simuleringsperioden i tarmen.
I vår studie evaluerte vi også mage-tarm passering av Lactobacillus gasseri
K7. Presset har allerede blitt evaluert for å overleve in vivo
i smågris [14]. Derfor var det mulig å sammenligne våre in-vitro
resultater med data fra in vivo
eksperimenter.
Bogovic et al
. [14] matet grisunger i løpet av en periode på 14 dager med 5 * 10 10 cfu dag -1 av L. gasseri
K7. Dette resulterte i ca. 7 * 10 4 cfu g -1 i feces i løpet av fôringsperioden. Det må tas hensyn til at konsentrasjonen av bakterier ble fortynnet før den endelig kommet til mage-tarm kanal. I en grov tilnærming, beregnet vi at ca 1% ankom passasjen. Dette tillot oss å sammenligne resultatene av denne piglet studie med slutten av simuleringen.
Som vist i figur 5, L. gasseri
K7 hadde en cellekonsentrasjon på ca 5 * 10 4 cfu ml -1 etter 7 timer simuleringsperiode (med en pre-kultur på 250 ml), som er lik konsentrasjonen i avføringen til grisungene. Dette tyder på at simuleringsmodellen anvendt i denne studien kan være et nyttig verktøy for å estimere effektene av passasjen i en in vitro modell
tidligere ved bruk av kostbare in vivo-modeller
. Modellen kan bli ytterligere optimalisert ved å fortynne gallesalter og bukspyttkjertelen juice som beskrevet av Sumeri et al
. [9]. For å simulere aktivering og deaktivering av enzymer en egnet metode har fortsatt å bli funnet.
Når ble kun brukt 100 ml medium for pode av L. gasseri
K7, kulturen overlevde simuleringen bedre (figur 7). Begge volumer hadde en lignende innledende legemer. Begge volumer ble inokulert ved 1 ml. Derfor kulturen med 250 ml volum var på et tidligere stadium av vekst enn den 100 ml kultur. Disse resultatene var en indikasjon på vekstfase avhengighet av kulturen for under stress.
Konklusjon
I denne studien, var vi i stand til å vise at systemet for å simulere mage-tarm kanal som er utviklet av Sumeri et al
. [9] var egnet for vurdering av overlevelse av 8 Bifidobacterium
stammer og Lactobacillus gasseri
K7 selv om vi ikke simulere fjerning av magesyren og gallesalter. For L. gasseri
K7 var vi i stand til å sammenligne resultatene med en in-vivo
studie på smågris og fått samme resultat.
Enkelt reaktor systemet presenteres her gir en mer enkel identifisering av den ideelle vekstfasen for eventuelle probiotisk stamme som er nødvendig for å passere mage-tarm passasje enn om det måtte skje med andre systemer med en vanskelig oppsett.
studien viste også at alle testet Bifidobacterium
stammer, med unntak for B. animalis
subsp. lactis
, ville kreve beskyttende midler for å overleve passasjen gjennom mage-tarm i høye tall. Dette kan gjøres ved hjelp av en passende matrise mat eller innkapsling av cellene.
Methods
Bakteriestammer
Alle bifidobakterier stammer ble utvalgt fra stammen samlingen av Agroscope Liebefeld-Posieux ALP Research Station Sveits, isolert ved ALP fra menneskelige kilder. Lactobacillus gasseri
K7 stammer fra ZIM Collection of Industrial Mikroorganismer av University of Ljubljana, biotekniske fakultet (ZIM 105) [10] og ble også avsatt i ALP belastning samlingen. De testede stammer og deres identifikasjonsnummer av ALP belastningen samlingen er oppført i tabell 3. Alle bifidobakterier stammer tilhører ALP.
Media og vekstvilkår
For pre-kulturer, 1 ml frosne bevarer av stammene var inokulert i 250 ml Wilkins-Chalgren buljong (WC CM0643, Oxoid, Hampshire, UK) supplert med 9 gl -1 ekstra laktosemonohydrat (bifidobakterier) eller De Man-Rogosa-Sharpe (MRS; Biolife, Milano, Italia) medium (Lactobacillus gasseri
K7) [32]. For L
. gasseri K7, en prøveordning med en 100 ml ferdig kultur ble også utført. Alle stammer, unntatt Bifidobacterium longum
subsp. infantis
, ble inkubert ved 37 ° C i 15 timer under anaerobe betingelser. Bifidobacterium longum
subsp. infantis
ble inkubert i 12 timer, siden det var svært følsomme for lengre inkuberingsperioder. Pre-Kulturene ble sentrifugert i 15 minutter ved 3500 rpm og pelletene resuspendert i 10 ml fosfatbufret fysiologisk saltoppløsning (PBS).
Bestemmelse av celletallet
celletall ble bestemt ved 10 gangers seriell fortynning av kulturen i fysiologisk saltoppløsning. De to høyeste fortynninger ble deretter belagt på MRS-agar (Biolife, Milano, Italia) med en spiral plater (IUL Instruments, Barcelona, ​​Spania) og evaluert av en automatisert koloniteller med tilsvarende programvare (IUL Instruments, Barcelona, ​​Spania).
screening for syreresistens
for syreresistensen screening den konsentrerte cellesuspensjon fra pre-kultur ble pipettert over i 20 ml PBS inntil en OD 650 på 1,0 ble nådd. 4 ml av denne cellesuspensjon ble deretter inokulert i 16 ml citrat-HCl-buffer (tri-Na-Citratex2 H 2O 7,35 g og 250 ml destillert H 2o, tilpasset til den tilsvarende pH-verdien med 1 M HCl) ved pH-verdier på 2,0, 2,5, 3,0, 3,5 og 4,0. Inkuberingen ble utført ved 37 ° C og prøver ble tatt hver 30 min i løpet av 120 min. 1 ml prøver ble blandet med 9 ml 0,25 M fosfatbuffer ved pH 7,0 på det første trinn av fortynningsrekken. For syremotstandstesten i en matrise mat, den samme mengde av pre-kultur som anvendt ovenfor (justert til en OD 650 på 1,0) ble pipettert over i 20 ml UHT skummet melk. 4 ml av denne cellesuspensjon i melk ble inokulert i 16 ml citrat-HCl-buffer. Alle kjemikalier ble anskaffet fra Merck (Darmstadt, Tyskland). Dataene for screening eksperimenter ble visualisert i kontur tomter ved hjelp av Sigmaplot 11,0 programvare (Systat Software Inc., Chicago IL, USA).
Simulering i bioreaktor
Alle løsninger ble tilberedes for hvert forsøk. Simulert mage oppløsning ble fremstilt av 50 mg pepsin fra svin mageslimhinne (Sigma-Aldrich P7012, Buchs, Sveits) i 20 ml 0,1 M HCI. For det simulerte bukspytt 2 g pankreatin (Sigma-Aldrich P7545) ble oppløst i 50 ml 0,02 M fosfatbuffer ved en pH-verdi på 7,5. Simulert gallesalt-løsning ble fremstilt av 7,5 g bovint galle (Sigma-Aldrich B3883) gjort opp til 50 ml med destillert H 2O. Suppen for simuleringen var enten en l WC eller MRS buljong med 29,41 g tri-natrium citratex2 H 2o. Under testing av overlevelse i en mat matrise, 500 ml UHT skummet melk ble tilsatt og pH justert til 3,0 med 5 M HCl kort tid før simuleringen. 1 liter medium ble tilsatt til bioreaktoren (NewMBR Mini, NewMBR, Sveits), på forhånd sterilisert med vann (121 ° C, 20 min) og oppvarmet til 37 ° C. Under magen simulering, ble lufting implementert. Den gjæring ble kontrollert og registrert ved hjelp av den integrerte prosessen management software Lucullus (Biospectra, Schlieren, Sveits). Den konsentrerte cellesuspensjon fra pre-kultur ble pipettert over i 40 ml PBS til en OD 650 på 1,5. Kort tid før inokulering av 40 ml cellesuspensjon, ble 20 ml av den simulerte mage oppløsningen tilsatt til mediet (1 l) i bioreaktoren. PH ble justert ved anvendelse av 2 M NaOH.
Seksti minutter etter inokulering av cellene, ble oksygen erstattet med nitrogen for å oppnå en anaerob atmosfære.

• Risikovurdering av magekreft assosiert med asbestose: en sak report
• Bakteriedrepende virkninger av kationiske steroid CSA-13 og den cathelicidin peptid LL-37 mot Helicobacter pylori i simulert mage juice