Avaliação da passagem de Lactobacillus gasseri K7 e bifidobactérias do estômago para os intestinos, utilizando um modelo de reactor único

Avaliação da passagem de Lactobacillus gasseri
K7 e bifidobactérias do estômago para os intestinos que utilizam um modelo único reactor
Resumo
fundo
As bactérias probióticas são pensados ​​para desempenhar um papel importante no sistema digestivo e, por conseguinte, têm para sobreviver à passagem do estômago para os intestinos. Recentemente, foi desenvolvida uma nova abordagem para simular a passagem do estômago para o intestino num biorreactor. A vantagem deste um sistema de reactor automatizado foi a capacidade de testar a influência do ácido, sais biliares e pancreatina.
Lactobacillus gasseri
K7 é uma cepa isolada de fezes infantis com propriedades tornando a estirpe interessante para produção de queijo. Neste estudo, um sistema único reactor foi utilizado para avaliar a sobrevivência de L. gasseri
K7 e selecionados bifidobactérias de nossa coleção através da passagem de estômago-intestino.

Resultados da triagem inicial para resistência a ácidos na cultura acidificado media mostrou uma baixa tolerância de Bifidobacterium dentium
para esta condição indicando baixa sobrevivência na passagem. Resultados semelhantes foram obtidos com B. longum
subsp. infantis
enquanto B. animalis
subsp. lactis
tiveram uma sobrevida elevada.
Estes resultados iniciais foram confirmados no modelo de biorreator da passagem estômago-intestino. B. animalis
subsp. lactis
teve a taxa de sobrevivência mais elevada (10%) atingindo aproximadamente 5 × 10 6 ufc ml -1 em comparação com as outras cepas de bifidobactérias testadas que foram reduzidos por um fator de até 10 6 . Lactobacillus gasseri
K7 foi menos resistente do que B. animalis
subsp. lactis
mas sobreviveu em concentrações celulares aproximadamente 1000 vezes mais elevados do que outros bifidobactérias.
Conclusão
Neste estudo, nós fomos capazes de mostrar que L. gasseri
K7 tinha uma alta taxa de sobrevivência no Estômago passagem intestino. Ao comparar os resultados com um estudo anterior em leitões pudemos confirmar a confiabilidade de nossa simulação. Das cepas de bifidobactérias testadas, apenas B. animalis
subsp. lactis
mostrou sobrevivência aceitável para uma passagem bem sucedida no sistema de simulação.
Fundo
probióticos, bactérias do ácido láctico especialmente ter efeitos benéficos sobre a saúde dos consumidores, tal como sugerido em 1907 [1]. Acredita-se que as bactérias infecções causadas por agentes patogénicos entéricos e toxoaemia regulamentado, melhorando assim a saúde e influenciando a mortalidade controlada principalmente. Enquanto isso, tem sido conhecido que alguns dos efeitos positivos sobre a saúde dos consumidores são a melhoria no equilíbrio da microflora no intestino, a estimulação do sistema imunológico, e auxiliar o organismo a combater microrganismos patogénicos [2]. Uma grande parte do interesse se concentrou sobre o uso de estirpes do
gêneros Lactobacillus e Bifidobacterium
, mesmo se existem também outras bactérias com efeitos probióticos, por exemplo, alguns Propionibacteria.
As propriedades acima mencionadas são também a base para um microorganismo a ser rotulado probiótico. Existem diferentes definições em todo o mundo, mas eles são similares em conteúdo. Um dos critérios para uma estirpe probiótica é a sua resistência a acidez gástrica e soluções no tracto gastrointestinal dos seres humanos [3]. Por conseguinte, é importante, para avaliar a resistência de uma potencial estirpe probiótica para o ambiente ácido gástrico e no intestino.
Devido aos elevados custos e, bem como os regulamentos de segurança éticas para estudos clínicos, o rastreio de sobrevivência é mais fácil para simular in vitro
. Um teste simples consiste em incubar as células bacterianas em soluções de sais de ácidos biliares ou por um período definido e contar o número de células sobreviventes. Num outro passo, a simulação é levada a cabo em frascos agitados, combinando acidez e soluções gástricas, seguido por uma estimativa de células sobreviventes ao longo de toda a simulação. Esta é uma reprodução mais realista das condições no intestino [4]. Um outro sistema, o simulador do intestinal humano microbiano do ecossistema (SHIME), consiste de 5 a 6 biorreactores de pH controlado, ligadas em série [5-7]. A configuração é bastante complexa e exige condições anaeróbicas absolutos. Além disso, a absorção dos metabolitos e água não é simulada. Isto foi superado usando membranas de diálise como descrito por Marteau et al
. [8].
Recentemente, um novo sistema que utiliza um único biorreactor foi desenvolvido para estudar a passagem do estômago-intestino [9]. O sistema permitiu que o pH a ser alterada dentro de um único reactor e foi adaptado para os tempos de retenção nas diferentes regiões da passagem do estômago-intestino.
Lactobacillus gasseri
K7 foi recentemente isolado a partir de fezes infantis [10]. Ela produz uma bacteriocina que é activa contra Clostridium
sp. e os seus esporos. L. gasseri
pertence ao chamado -group "acidophilus" e vários estudos independentes que identificaram estas estirpes como habitantes da pele e do intestino [11-13]. Em experiências anteriores, que já foi demonstrado in vitro que
L. gasseri
K7 sobreviveu em um meio ácido e com 0,3% de sais biliares [10]. Estes resultados fazem a tensão interessante como uma possível probiótico.
Neste estudo, um único sistema de biorreator com base no trabalho de Sumeri et al
. [9] foi utilizado para avaliar a sobrevivência de Lactobacillus gasseri
K7 e oito Bifidobacterium
cepas de nossa coleção. Fomos capazes de comparar os resultados para L. K7 gasseri
com um estudo realizado em leitões [14] que permitiu a avaliação de uma correlação entre o estudo in-vitro
com resultados de in-vivo
experimentos .
os tempos de retenção e de pH utilizados neste estudo foram baseados em dados da literatura. Existem vários métodos para medir o pH no intestino [15]. A Tabela 1 mostra os valores de pH nas diferentes partes do intestino tal como medido pela cápsula Heidelberg [16, 17]. Os tempos de retenção pode ser calculada usando substâncias marcadoras (químicos) ou cápsulas de telemetria de rádio, como a Heidelberg
cápsula [18]. No entanto, as cápsulas normalmente têm tempos de retenção mais longos do que os marcadores químicos. A Tabela 2 apresenta alguns dos tempos de retenção encontrados na literatura [4, 5, 19-24] .table 1 valores de pH no tracto intestinal humano, medida com a Heidelberg
cápsula.

estômago
Duodenum
Jejuno
íleo
proximal

distal medial
pH
1,4 **
6,22 *
6,4 **
7.1 **
7,4 **
* Fallingborg et al
. De 1994 [16]
** Fallingborg et al
. 1998 [17]
Tabela 2 tempos de retenção no intestino delgado citados na literatura. Tempo
Retenção
Fonte
Observações

1-4 h
Huang e Adams 2004 [21]
4.25 h
Van Den Driessche et al
. De 2000 [24]
estômago e intestino delgado página 4 h
Mojaverian de 1996 [22]
6 h
Picot e Lacroix 2004 [4]
Selecionado tempo máximo da simulação
7,5 h
Fallingborg et al
. 1990 [20]
Crianças
8 h
Fallingborg et al
. 1989 [19]
8 h
Alander et al
. 1998 [5]
Simulação na SHIME Reactor
6-10 h
thews et al
. 1991 [23]
Com base nos dados encontrados na literatura e no trabalho por Sumeri et al
. [9], o processo de fermentação foi criado como descrito em Materiais e Métodos e é mostrado na Figura 1. Figura 1 Os parâmetros da simulação passagem estômago-intestinal mais de 7 h.
Resultados
resistência Ácido triagem
A objetivo de uma primeira série de testes foi obter uma visão geral da resistência a ácidos de oito cepas de bifidobactérias. As Figuras 2, 3 e 4 mostram a sobrevivência destas estirpes utilizando gráficos de contorno feitas com SigmaPlot. Bifidobacterium dentium
(Figura 3) mostrou a resistência menos ácido. Entre pH 4,0 e pH 2,0, não houve diferença na sobrevivência e a concentração de células diminuiu em mais de 7 log em 40 minutos. Bifidobacterium animalis
subsp. lactis
era mais resistente a 40 min a pH 2,0, mas depois diminuíram cerca de 3 log, quando incubada durante 120 minutos (Figura 4). A um pH entre 2,5 e 3,0 a redução foi menos do que 1 log, após 120 minutos. Figura 2 Resistência ácida de três estirpes de Bifidobacterium longum. Eixo X: tempo (min); Eixo Y: pH; log ufc são mostrados em cores (escala à direita dos gráficos). Números nos nomes bacterianas são os números de tensão no FAM-banco de dados de ALP.
Figura 3 Resistência ácida de Bifidobacterium dentium, B. longum subsp. infantis e B. adolescentis. Eixo X: tempo (min); Eixo Y: pH; log ufc são mostrados em cores (escala à direita dos gráficos). Números nos nomes bacterianas são os números de tensão no FAM-banco de dados de ALP.
Figura 4 Resistência ácida de Bifidobacterium breve e B. animalis subsp. lactis. Eixo X: tempo (min); Eixo Y: pH; log ufc são mostrados em cores (escala à direita dos gráficos). Números nos nomes bacterianas são os números de tensão no FAM-banco de dados de ALP.
Todas as outras Bifidobacterium
cepas testadas (B. longum, B. breve, B. longum
subsp. Infantis e B. adolescentis
) mostrou um padrão semelhante, mas diferente de B. animalis
subsp. lactis
(Figuras 2, 3 e 4). Eles tinham um curto período de tempo de sobrevida abaixo de pH 2,5 e sobreviveram em maior número com pH acima de 3,5.
Com o objetivo de desenvolver um método para simular o GI no biorreator, um novo teste foi feito com uma cepa. Para observar a influência de uma matriz de comida, concentrada B. longum
subsp. infantis
foi ressuspenso em leite desnatado antes da inoculação em soluções ácidas. Como se mostra na coluna da direita da Figura 5, o leite tinha um efeito directo sobre a sobrevivência da estirpe. Entre pH 3,0 e 3,5 as bactérias sobreviveram durante 120 minutos, com uma redução de log 2. Abaixo de pH 3.0 a taxa de sobrevivência diminuiu para cerca de 5. O registo de diminuição na sobrevivência abaixo de pH 3,0 foi rápida, mas regular ao longo do tempo. A pH 3,5 e acima, a estirpe era resistente durante pelo menos 120 minutos. Figura 5 Comparação da resistência a ácidos de Bifidobacterium longum subsp. infantis 14390 suspensos em NaCl ou leite desnatado. Esquerda: Bifidobacteria ressuspenso em NaCl, à direita: Bifidobacteria novamente suspensas no leite. Eixo X: tempo (min); Eixo Y: pH; log ufc são mostrados em cores (escala à direita dos gráficos). Números nos nomes bacterianos são os números de deformação na base de dados de FAM-ALP.
A coluna do lado esquerdo da Figura 5 mostra a mesma estirpe sem leite desnatado adicionado. A um pH acima de 3,5, houve nenhuma influência sobre a sobrevivência das bactérias. No entanto, abaixo de pH 3,5 diminuiu a sobrevivência em função da duração da incubação. Entre pH 3.0 e 3.5 a tensão já diminuiu cerca de log 5. Após 30 minutos de incubação, não havia quase uma redução linear da sobrevida com a diminuição do pH 3,0-2,5.
Simulação no biorreator
A maioria dos sistemas descritos em a literatura consistir em vários recipientes de reacção, por exemplo, o SHIME [6]. Outros estudos utilizaram células imobilizadas com três reactores [25] ou de um sistema de diálise [8]. Com base no trabalho de Sumeri et al
. [9] e os dados recolhidos sobre as condições do trânsito intestinal, fomos capazes de limitar a simulação para um único navio. Juntamente com os dados do rastreio resistência a ácidos, a selecção de uma composição de pH e possível caldo de partida no simulador pode ser escolhido. Os parâmetros de simulação resultantes são mostradas na Figura 1 e descrito na secção Materiais e Métodos. Durante a fase experimental deste estudo, Sumeri et al
. [9] desenvolvido um sistema semelhante para avaliar
Lactobacillus sp. numa simulação estômago-intestino passagem.
O pacote de software "Lucullus" era uma excelente ferramenta para controlar o pH e o processo de acordo com a simulação desenvolvido. Seleccionar o meio no biorreactor foi simplificada pela escolha do meio de crescimento correspondente para as estirpes, suplementado com leite desnatado, funcionando como uma matriz alimentar simulado. Em seguida, acidificou-se para o pH de partida e suplementado com soluções enzimáticas, tal como descrito em Materiais e Métodos. As simulações foram realizadas em série, uma por dia. Os resultados são mostrados na Figura 6. As estirpes utilizadas para a simulação são listados na tabela 3 (apenas Bifidobacterium dentium
foi excluído) e foram normalizadas para uma DO 650 de 1,5 antes da inoculação. Figura 6 Desenvolvimento de 7 estirpes de Bifidobacterium durante a simulação passagem estômago-intestinal durante 7 horas. A linha a tracejado mostra o momento da adição de sais biliares e suco pancreático. Números nos nomes bacterianas são os números de tensão no FAM-banco de dados de ALP.
Tabela 3 cepas testadas na simulação.
Nome
Número de identificação da colecção de estirpes ALP
Bifidobacterium adolescentis
FAM-14377
Bifidobacterium breve
FAM-14398
Bifidobacterium longum
subsp. infantis
FAM-14390
Bifidobacterium animalis
subsp. Lactis
FAM-14403
Bifidobacterium dentium
FAM-14396
Bifidobacterium longum
FAM-14382, -14.383, -14.406
Lactobacillus gasseri
K7
FAM-14459
Bifidobacterium adolescentis
foi inoculado como descrito acima a uma concentração inicial de 10 7 ufc ml -1 e diminuiu quase linearmente para menos de 10 4 ufc ml -1 após 5 horas. B. breve Comprar e B. longum
estirpes tinha uma concentração inicial entre 10 7 e 10 8 ufc ml -1 e diminuiu para menos de 10 2 ufc ml -1 dentro dos primeiros 30 minutos. B. animalis
subsp. lactis
14403 sobreviveu a aproximadamente 15% do ufc médio inicial de 5 × 10 8 ufc ml -1. Houve uma rápida diminuição na sobrevivência de B. longum
subsp. infantis
sobre o primeiro 30 min. Posteriormente a sobrevivência diminuiu apenas lentamente a partir de 10 5 a 10 4 ufc ml -1.
Numa fase posterior, Lactobacillus gasseri
K7 foi incluído no estudo uma vez que vários projectos estavam correndo neste momento no nosso instituto com esta estirpe. gasseri Lactobacillus
K7 foi inoculada em 2,2 × 10 7 ufc ml -1 e após 7 h simulação de uma concentração de 10 5 ufc ml -1 células vivas ainda estava presente na meios de cultura (Figura 7, curva para 250 ml de pré-cultura). A maior redução na sobrevivência estava dentro das primeiras 2 horas e começou imediatamente após a adição de sais biliares e suco gástrico. Dentro desse tempo, houve uma redução de células de log 2. vivendo Durante o resto do tempo de simulação, houve apenas uma redução log 1 de células vivas. Figura 7 Comparação da influência de 100 ml de pré-cultura de Lactobacillus gasseri K7 com 250 ml de pré-cultura. A pré-cultura foi colhida por centrifugação e ressuspensas em solução fisiológica de cloreto de sódio para atingir uma DO600 de 1,5. A simulação passagem estomacal e intestinal foi incubada com a solução ajustada e incubadas durante 7 h. A linha tracejada mostra a adição de sais biliares e suco pancreático. As curvas são a média de experiências em duplicado.
A preparação do inoculo de L. gasseri
K7 em um volume de cultura de 100 ml foi também avaliada. Os resultados das experiências estão apresentados na Figura 7. Com 250 ml de cultura a diminuição em células vivas foi de cerca de 2 log enquanto que a diminuição de uma cultura de 100 ml, apenas foi um log ao longo de todo o tempo de incubação. Discussão No entanto, 2 h após a adição de sais biliares e suco pancreático, a diminuição na contagem de células foi semelhante para ambos os volumes.
Quando a colheita de uma cultura depois de um determinado tempo de incubação, a fase de crescimento de cada estirpe bacteriana pode ser diferente, pois todos têm diferentes dinâmicas de crescimento. De forma a obter células em, aproximadamente, a mesma fase de crescimento, as experiências preliminares foram realizadas (dados não mostrados). Um tempo de incubação de 15 h para a pré-cultura foi adequado para todas as estirpes testadas, excepto Bifidobacterium longum
subsp. infantis
que precisava de ser incubada durante apenas 12 h. A tolerância
ácido rastreio (Figuras 2, 3 e 4) foi realizada para avaliar o efeito do pH, independentemente de outras condições. Bifidobacterium dentium
foi altamente sensível ao ácido e, portanto, possivelmente não iria sobreviver a passagem pelo estômago. A estirpe, por conseguinte, não foi incluída nas experiências de simulação. O B. longum
estirpes (Figura 2) não deu resultados muito melhores do que B. dentium
(Figura 3). No entanto, perto de pH 4 eram mais resistentes do que B. dentium
.
B. longum
subsp.
infantis é uma das primeiras espécies a povoar o intestino humano logo após o nascimento [26]. Com base nas experiências no presente estudo, no entanto, o B. longum
subsp testado. infantis
estirpe só seria capaz de passar do estômago infantil em número elevado, se o tempo de transição no estômago ácida foi muito curto. A sobrevivência da estirpe seleccionada no ambiente testado era demasiado baixo para a passagem bem sucedida em número elevado. Quando a estirpe que foi ressuspenso em leite desnatado, a sobrevivência aumentada (Figura 5). Esta poderia ser uma indicação de que o leite humano ajuda B. longum
subsp. Infantis
estirpes de passar a passagem do estômago-intestino, com a uma taxa de sobrevivência mais elevada.
Os efeitos protectores de proteínas do leite no sistema digestivo já foram descritos na literatura [27]. Protecção com proteínas do leite também tem sido demonstrado neste estudo (Figura 5). Com a matriz apropriada ou mesmo uma transportadora, bactérias probióticas poderia passar com segurança através do estômago para o intestino para chegar ao seu local de acção.
B. adolescentis
cepas que povoam o intestino humano em uma idade mais tarde, tinha a resistência ligeiramente maior do que B. longum
subsp. infantis
o que pode explicar a redução deste último durante o andamento do bebê humano para a vida adulta [26].
A estirpe mais interessante foi B. animalis
subsp. lactis
, que era a cepa menos sensível em nosso estudo. Esta estirpe resistente ao pH tem um grande potencial para a utilização em produtos alimentares como um suplemento probiótico uma vez que um elevado número de células bacterianas que sobreviver a passagem. No entanto, a utilização desta estirpe como probiótico, mais estudos têm que ser realizadas de modo a atingir o estado probiótico de acordo com a definição de Klaenhammer [3].
No nosso estudo, a ingestão de uma matriz alimentar foi simulada numa inicial ambiente de leite acidificado e meio de crescimento. A solução gástrico simulado adicionado e oxigênio durante a fase de estômago aumentou o stress. Durante a passagem simulada para o intestino delgado do oxigénio foi substituído por azoto e o meio foi neutralizado para pH 6,3. A adição de sais biliares e pancreáticas solução completada a passagem para o intestino delgado. Esta in-vitro
sistema não leva em conta que na digestão in vivo
, as enzimas são ativados e substâncias inativadas e outros, por exemplo, sais biliares são reabsorvidos. Sumeri et al
. [9] encontraram uma solução parcial para contornar este problema. Eles diluída do conteúdo do reactor com um meio de diluição especialmente concebidos. Outra possibilidade seria a de precipitar os sais biliares no final da simulação do intestino delgado para imitar o circuito êntero-hepática. Isto pode ser realizada com iões de cálcio [28-30]. Removendo os sais biliares seria melhor simular o ambiente do cólon e pode até permitir que bifidobactérias a proliferar.
Em nosso estudo, os sais biliares remanescentes e suco pancreático na simulação levou a um estresse adicional sobre as bactérias que provavelmente alterou as verdadeiras características das cepas in vivo
.
o ufc começando na simulação variou dentro de um log ufc mesmo que o ajuste do OD 650 do inóculo foi previamente testado com as Bifidobacterium animalis
subsp. lactis Comprar e Bifidobacterium longum
subsp. infantis
estirpes. As bifidobactérias utilizadas neste estudo mostraram uma tendência para formar aglomerados que podem resultar em ufc reduzida (observações visuais, dados não mostrados). Em outro estudo, a formação de aglomerados pode ser relacionada com a diminuição do pH durante o crescimento [31]. Estes agrupamentos são geralmente contados como uma colónia em uma placa.
A Figura 6 mostra os resultados da simulação passagem estômago-intestino mais de 7 h de sete Bifidobacterium
estirpes testadas. A concentração de células de bifidobactérias vivo diminuiu imediatamente depois da incubação, devido ao baixo pH (pH 3,0). No entanto, B. animalis
subsp. lactis
manteve-se estável. Isto confirmou os resultados de experiências anteriores discutidos acima (Figura 4). Esta resistência pode ser estendido para sais biliares e suco pancreático, embora as contagens de células de B. animalis
subsp. lactis
diminuiu em cerca de 85% do valor inicial (Figura 6). Em comparação com as outras estirpes utilizadas neste estudo, no entanto, esta diminuição foi quase insignificante.
All B. longum Comprar e B. breve
estirpes morreu muito rapidamente no início da simulação e foram abaixo da detecção limite do método de plaqueamento dentro de algumas horas (Figura 6), que era de se esperar a partir dos resultados da experiência de rastreio de cima (figuras 2 e 4).
por outro lado, B. longum
subsp.
infantis 14390 diminuiu rapidamente no início de simulação, mas após a adição de sais biliares e suco pancreático e uma mudança para um ambiente anaeróbio, diminuiu a taxa de redução. Nosso estudo sugere que esta cepa está bem adaptado às condições no intestino, mas precisa ser ingerido em grande número para sobreviver às condições no estômago (oxigênio, pH baixo). Como mencionado acima, B. longum
subsp. Infantis
estirpes pertencem ao primeiro grupo de bactérias que povoam o intestino dos lactentes [26]. Em contraste com
B. longum
subsp. infantis
, B. adolescentis
diminuiu quase linearmente durante o 7 h simulação. Não houve interrupção detectável quando as condições no fermentador modificado. Com base nas experiências para o rastreio de tolerância ao ácido, este resultado foi inesperado.
No entanto, esta pode ser relacionada com as condições de ensaio em que o sal de bile e concentrações suco gástrico permaneceu no nível inicial e não foram diluídos como estariam em vivo
. Numa experiência futura, deve-se avaliar se o método de diluição desenvolvido por Sumeri
et ai. [9] estabilizaria as contagens de células de B. adolescentis
durante o período de simulação 6 h no intestino.
Em nosso estudo, também avaliamos a passagem do estômago-intestino de Lactobacillus gasseri
K7. A tensão já foi avaliado pela sobrevivência in vivo
em leitões [14]. Por isso, foi possível comparar nossos resultados in vitro
com dados de in vivo
experimentos.
Bogovic et al
. [14] Os leitões alimentados durante um período de 14 dias, com 5 * 10 10 dias ufc -1 de L. gasseri
K7. Isto resultou em aprox. 7 * 10 4 ufc g -1 nas fezes durante o período de alimentação. Tem que ser tomado em consideração que a concentração de bactérias foi diluído antes de finalmente chegaram à passagem do estômago-intestino. Em uma aproximação grosseira, estimamos que cerca de 1% chegou na passagem. Isto permitiu-nos comparar os resultados deste estudo de leitões com o fim da nossa simulação.
Como mostrado na Figura 5, L. gasseri
K7 tinha uma concentração celular de cerca de 5 * 10 4 cfu ml -1 após o período de simulação 7 h (com uma pré-cultura de 250 ml), que é semelhante à concentração nas fezes dos leitões. Isto sugere que o modelo de simulação utilizado neste estudo podia ser uma ferramenta útil para estimar os efeitos da passagem num modelo in-vitro utilizando
antes caro em modelos in vivo
. O modelo poderia ser optimizadas diluindo os sais biliares e suco pancreático como descrito por Sumeri et al
. [9]. Para simular a activação e desactivação das enzimas de um método adequado tem ainda de ser encontrado.
Quando apenas 100 ml de meio foi utilizado para o inoculo de L. gasseri
K7, a cultura sobreviveram melhor a simulação (Figura 7). Ambos os volumes tinha uma contagem de células inicial semelhante. Ambos os volumes foram inoculadas por 1 ml. Portanto, a cultura com 250 ml de volume foi numa fase anterior, de crescimento do que a cultura de 100 ml. Estes resultados foram uma indicação da dependência fase de crescimento da cultura por durante o stress.
Conclusão
Neste estudo, nós fomos capazes de mostrar que o sistema para simular a passagem do estômago-intestino desenvolvido por Sumeri et ai
. [9] era adequado para a avaliação da sobrevivência de 8 Bifidobacterium
estirpes e gasseri Lactobacillus
K7 embora nós não simular a remoção dos sais biliares e suco gástrico. Para L. K7 gasseri
fomos capazes de comparar os resultados com um estudo in vivo
em leitões e obtiveram resultados semelhantes.
O sistema de reactor único aqui apresentado permite uma identificação mais simples da fase de crescimento ideal para qualquer possível cepa probiótica que é necessário para passar a passagem de estômago-intestino do que se tivesse que ser realizada com outros sistemas com uma configuração difícil.
o estudo também mostrou que todos testados Bifidobacterium
cepas, exceto para B. animalis
subsp. lactis
, exigiria agentes protectores para sobreviver à passagem através do estômago, intestino em números elevados. Isso poderia ser feito usando uma matriz alimentar adequado ou encapsulamento das células.
Métodos
estirpes bacterianas
Todas as cepas de bifidobactérias foram selecionados a partir da coleção estirpe de Agroscope Liebefeld-Posieux ALP Research Station Suíça, isolado por ALP de fontes humanas. Lactobacillus gasseri
K7 originado a partir da Colecção ZIM de Microrganismos Industriais da Universidade de Ljubljana, Biotécnica Faculdade (ZIM 105) [10] e também foi depositada na colecção de estirpes ALP. As cepas testadas e seus números da colecção de estirpes ALP identificação estão listados na tabela 3. Todas as cepas de bifidobactérias são propriedade dos ALP.
Media e condições de crescimento Compra de pré-culturas, conservas 1 ml congelados das estirpes foram inoculada em 250 ml de Wilkins-Chalgren caldo (WC CM0643, Oxoid, Hampshire, Reino Unido) suplementado com 9 gl -1 adicional lactose mono-hidratada (bifidobactérias) ou de Man-Rogosa-Sharpe (MRS; Biolife, Milano, Itália) médio (Lactobacillus gasseri
K7) [32]. Para L
. gasseri K7, um ensaio com um ml de pré-cultura de 100 foi também realizada. Todas as estirpes, excepto Bifidobacterium longum
subsp. infantis
, foram incubadas a 37 ° C durante 15 horas sob condições anaeróbicas. Bifidobacterium longum
subsp. infantis
foi incubada durante 12 h, uma vez que foi muito sensível a períodos de incubação prolongados. As pré-culturas foram centrifugadas durante 15 min a 3500 rpm e os sedimentos ressuspensos em 10 ml de solução de cloreto de sódio fisiológica tamponada com fosfato (PBS).
Determinação do número de células
A contagem das células foi determinada por 10 vezes diluição em série da cultura em solução salina fisiológica. As duas diluições mais elevadas foram então semeadas em ágar MRS (Biolife, Milano, Itália), utilizando uma placa em espiral (IUL Instruments, Barcelona, ​​Espanha) e avaliados por um contador de colónias automatizado com o software correspondente (IUL Instruments, Barcelona, ​​Espanha).
triagem para resistência a ácidos
para a resistência a ácidos rastreio da suspensão de células a partir do concentrado de pré-cultura foi pipetada para 20 ml de PBS até uma OD 650 de 1,0. 4 ml desta suspensão de células foram então inoculadas em 16 ml de tampão citrato-HCl (tri-Na-Citratex2 H 2O 7,35 g e 250 ml de destilados H 2O, adaptado para o pH correspondente com HCl 1 M) nos pHs de 2,0, 2,5, 3,0, 3,5 e 4,0. A incubação foi feita a 37 ° C e foram retiradas amostras a cada 30 min durante 120 min. 1 mL das amostras foram misturadas com 9 mL de 0,25 M de tampão de fosfato a pH 7,0 no primeiro passo da série de diluições. Para o ensaio de resistência ao ácido em uma matriz de comida, a mesma quantidade de pré-cultura tal como utilizado acima (ajustado a um valor OD 650 de 1,0) foi pipetada para 20 ml de UHT leite desnatado. 4 ml desta suspensão de células em leite foram inoculadas em 16 ml de tampão citrato-HCl. Todos os produtos químicos foram adquiridos a Merck (Darmstadt, Alemanha). Os dados para as experiências de rastreio foi visualizado nos gráficos de contorno utilizando o software SigmaPlot 11.0 (Systat Software Inc., Chicago IL, EUA).
Simulação no bioreactor
Todas as soluções foram preparadas de fresco para cada experiência. solução estômago simulado era de 50 mg de pepsina porcina mucosa gástrica (P7012 Sigma-Aldrich, Buchs, Suíça) em 20 ml de HCl 0,1 M. Para o suco pancreático simulada 2 g de pancreatina (Sigma-Aldrich P7545) foram dissolvidos em 50 ml de tampão de fosfato 0,02 M a um pH de 7,5. solução de sal biliar foi simulado feito de 7,5 g de bílis de bovino (Sigma-Aldrich B3883) fez-se a 50 ml com água destilada H 2O. O caldo para a simulação era ou 1 l WC ou caldo MRS com 29,41 g citratex2 tri-sódio H 2O. Durante os testes de leite de sobrevivência em uma matriz de comida, a 500 ml de leite UHT desnatado foram adicionados e o pH ajustado a 3,0 com HCl 5 M, pouco antes da simulação. 1 L meio foi adicionado ao bioreactor (NewMBR Mini, NewMBR, Suíça), previamente esterilizada com água (121 ° C, 20 min), e aqueceu-se a 37 ° C. Durante a simulação de estômago, aeração foi implementado. A fermentação foi controlado e gravado usando o Lucullus software de gerenciamento de processo integrado (Biospectra, Schlieren, Suíça). A suspensão de células de concentrado a partir da pré-cultura foi pipetada para 40 ml de PBS a uma DO 650 de 1,5. Pouco tempo antes da inoculação da suspensão de células de 40 ml, 20 ml da solução do estômago simulado foi adicionado ao meio (1 L) no bioreactor. O pH foi ajustado utilizando NaOH 2 M.
Sessenta minutos após a inoculação das células, o oxigénio foi substituído por azoto para se obter uma atmosfera anaeróbia.

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