Évaluation du passage de Lactobacillus gasseri K7 et les bifidobactéries de l'estomac à l'intestin en utilisant un seul réacteur d'évaluation model

du passage de Lactobacillus gasseri
K7 et des bifidobactéries de l'estomac à l'intestin en utilisant un modèle de réacteur unique
Résumé
Contexte
les bactéries probiotiques semblent jouer un rôle important dans le système digestif et doivent donc survivre au passage de l'estomac à l'intestin. Récemment, une nouvelle approche pour simuler le passage de l'estomac à l'intestin en un seul bioréacteur a été développé. L'avantage de ce système automatisé d'un réacteur était la possibilité de tester l'influence de l'acide, les sels biliaires et pancréatine.
Lactobacillus gasseri
K7 est une souche isolée de fèces des bébés avec des propriétés rendant la souche intéressante pour la production de fromage. Dans cette étude, un système de réacteur unique a été utilisé pour évaluer la survie de L. gasseri
et K7 choisi bifidobactéries de notre collection à travers le passage estomac-intestin.: Résultats
dépistage initial pour résistance à l'acide dans la culture acidifié les médias ont montré une faible tolérance de Bifidobacterium dentium
pour cette condition qui indique une faible survie dans le passage. Des résultats similaires ont été obtenus avec B. longum
subsp. infantis
alors subsp B. animalis. lactis
avait une survie élevé.
Ces premiers résultats ont été confirmés dans le modèle de bioréacteur du passage estomac-intestin. subsp B. animalis. lactis
avait le plus haut taux de survie (10%) atteignant environ 5 x 10 6 ufc ml -1 par rapport aux autres souches de bifidobactéries testées qui ont été réduits par un facteur allant jusqu'à 10 6 . Lactobacillus gasseri
K7 était moins résistant que subsp B. animalis. lactis
mais a survécu à des concentrations cellulaires environ 1000 fois plus élevé que d'autres bifidobactéries.
Conclusion
Dans cette étude, nous avons pu montrer que L. gasseri
K7 a eu un taux de survie élevé dans le stomach- passage de l'intestin. En comparant les résultats avec une étude précédente chez les porcelets nous avons pu confirmer la fiabilité de notre simulation. Parmi les souches de bifidobactéries testées, seulement
B. animalis subsp. lactis
a montré la survie acceptable pour un passage réussi dans le système de simulation.
fond
Probiotiques, des bactéries d'acide lactique en particulier ont des effets bénéfiques sur la santé des consommateurs comme l'a suggéré en 1907 [1]. On croyait que les bactéries infections causées par des pathogènes entériques et toxoaemia réglementé, ce qui améliore la santé et influencer la mortalité principalement contrôlées. En attendant, il a été connu que quelques-uns des effets positifs sur la santé des consommateurs sont l'amélioration de l'équilibre de la microflore dans le tube digestif, la stimulation du système immunitaire, et d'aider l'organisme à lutter contre les micro-organismes pathogènes [2]. Une grande partie de l'intérêt a été concentrée sur l'utilisation des souches des genres Lactobacillus et Bifidobacterium

, même s'il y a aussi d'autres bactéries ayant des effets probiotiques, par exemple certains propioniques.
Les propriétés mentionnées ci-dessus sont également la base d'un micro-organisme à être étiqueté probiotique. Il existe différentes définitions à travers le monde, mais ils sont semblables dans le contenu. L'un des critères d'une souche probiotique est sa résistance à l'acidité gastrique et des solutions dans le tractus gastro-intestinal humain [3]. Il est donc important, pour évaluer la résistance d'une souche probiotique potentiel pour l'environnement acide et gastrique dans l'intestin.
En raison des coûts élevés et ainsi que les règles d'éthique en matière de sécurité pour les études cliniques, le dépistage de survie est plus facile de simuler in vitro
. Un test simple consiste à incuber les cellules bactériennes dans des solutions salines acides ou biliaires pour une période définie et compter le nombre de cellules survivantes. Dans une autre étape, la simulation est effectuée dans des flacons agités, en combinant l'acidité gastrique et des solutions, suivie d'une estimation de la survie des cellules sur toute la simulation. Ceci est une reproduction plus réaliste des conditions dans l'intestin [4]. Un autre système, le simulateur de l'écosystème microbien intestinal humain (SHIME), se compose de 5 à 6 pH contrôlé bioréacteurs connectés en série [5-7]. La configuration est assez complexe et exige des conditions anaérobies absolues. En outre, l'absorption des métabolites et de l'eau est pas simulé. Cela a été résolu en utilisant des membranes de dialyse, comme décrit par Marteau et al
. [8].
Récemment, un nouveau système en utilisant un seul bioréacteur a été développé pour étudier le passage estomac-intestin [9]. Le système a permis le pH à modifier l'intérieur d'un seul réacteur et a été adapté aux temps de rétention dans les différentes régions du passage estomac-intestin.
Lactobacillus gasseri
K7 a récemment été isolé à partir de matières fécales pour nourrissons [10]. Elle produit une bactériocine qui est actif contre Clostridium sp. et leurs spores. L. gasseri
appartient à la soi-disant "acidophilus" -groupe et plusieurs études indépendantes identifiées ces souches en tant qu'habitants de la peau et de l'intestin [11-13]. Dans les expériences précédentes, il a déjà été démontré in vitro que
L. gasseri
K7 survécu dans un environnement acide et avec 0,3% de sels biliaires [10]. Ces résultats font la souche intéressante en tant que possible probiotique.
Dans cette étude, un système de bioréacteur unique basé sur les travaux de Sumeri et al
. [9] a été utilisé pour évaluer la survie de Lactobacillus gasseri
et K7 huit Bifidobacterium
souches de notre collection. Nous avons pu comparer les résultats pour L. gasseri
K7 avec une étude réalisée chez les porcelets [14] qui a permis l'évaluation d'une corrélation entre l'étude in-vitro
avec des résultats de in-vivo
expériences .
les temps de rétention et le pH utilisés dans cette étude ont été fondées sur des données de la littérature. Plusieurs méthodes existent pour mesurer le pH dans l'intestin [15]. Le tableau 1 présente les valeurs de pH dans les différentes parties de l'intestin, telle que mesurée par la capsule Heidelberg [16, 17]. Les temps de rétention peuvent être calculés soit en utilisant des substances de marquage (chimiques) ou par des capsules de télémétrie radio tels que Heidelberg
capsule [18]. Cependant, les capsules ont généralement plus longues que les temps de rétention des marqueurs chimiques. Le tableau 2 énumère quelques-uns des temps de rétention dans la littérature [4, 5, 19-24] .Tableau 1 des valeurs de pH dans le tractus intestinal humain, mesurées avec la capsule de Heidelberg.

estomac
duodénum
Jéjunum
iléon
proximal

distal pH médial
1.4 **
6,22 *
6.4 **
7.1 **
7.4 **
* Fallingborg et al
. 1994 [16]
** Fallingborg et al
. 1998 [17]
Tableau 2 Temps de rétention dans l'intestin grêle, cité dans la littérature.
Temps Rétention
Remarques
de Source
1-4 h
Huang et Adams 2004 [21]
4.25 h
Van Den Driessche et al
. 2000 [24]
estomac et l'intestin grêle
4 h
Mojaverian 1996 [22]
6 h
Picot et Lacroix 2004 [4]
Selected durée maximale de la simulation
7,5 h
Fallingborg et al
. 1990 [20]
8 h pour les enfants
Fallingborg et al
. 1989 [19]
8 h
Alander et al
. 1998 [5]
Simulation dans le réacteur SHIME
6-10 h
Thews et al
. 1991 [23]
sur la base des données trouvées dans la littérature et les travaux de Sumeri et al
. [9] le processus de fermentation a été mis en place comme décrit dans Matériel et méthodes et est représenté sur la figure 1. Figure 1 Paramètres de la simulation de passage estomac-intestinal plus de 7 h.: Résultats
résistance Acid dépistage The objectif d'une première série de tests a été d'obtenir un aperçu de la résistance à l'acide de huit souches de bifidobactéries. Les figures 2, 3 et 4 montrent la survie de ces souches à l'aide des tracés de contours à base Sigmapiot. Bifidobacterium dentium
(Figure 3) a montré la moindre résistance acide. Entre pH 4,0 et pH 2,0 il n'y avait aucune différence dans la survie et la concentration des cellules a diminué de plus de 7 log dans les 40 minutes. subsp Bifidobacterium animalis. lactis
était plus résistant jusqu'à 40 min à pH 2,0, mais a diminué d'environ 3 log lorsqu'il est incubé pendant 120 minutes (figure 4). À un pH compris entre 2,5 et 3,0 la diminution est inférieure à 1 log après 120 minutes. Figure 2 Résistance aux acides de trois souches de Bifidobacterium longum. Axe X: temps (min); Axe Y: le pH; log ufc sont représentés en couleur (échelle sur la droite des graphiques). Les nombres dans les noms bactériens sont les numéros de contrainte dans la FAM-base de données de l'ALP.
Figure 3 Résistance aux acides de Bifidobacterium dentium, B. longum subsp. infantis et B. adolescentis. Axe X: temps (min); Axe Y: le pH; log ufc sont représentés en couleur (échelle sur la droite des graphiques). Les nombres dans les noms bactériens sont les numéros de contrainte dans la FAM-base de données de l'ALP.
Figure 4 Résistance aux acides de Bifidobacterium breve et B. animalis subsp. lactis. Axe X: temps (min); Axe Y: le pH; log ufc sont représentés en couleur (échelle sur la droite des graphiques). Les nombres dans les noms bactériens sont les numéros de contrainte dans la FAM-base de données de l'ALP.
Toutes les autres souches testées Bifidobacterium
(B. longum, B. breve, B. longum
subsp. Infantis et B. adolescentis
) ont montré une tendance similaire mais différent de subsp B. animalis. (Figures 2, 3 et 4) de lactis. Ils avaient un temps de survie à court pH inférieur à 2,5 et ont survécu en plus grand nombre au-dessus de pH 3,5.
Dans le but de développer une méthode pour simuler le GI dans le bioréacteur, un nouvel essai a été fait avec une souche. Pour observer l'influence d'une matrice alimentaire, concentrée subsp B. longum. infantis
a été remis en suspension dans le lait écrémé avant d'inoculer dans des solutions acides. Comme indiqué dans la colonne de droite de la figure 5, le lait a eu un effet direct sur la survie de la souche. Entre pH 3,0 et 3,5 les bactéries survécu pendant 120 minutes avec une réduction de log 2. pH inférieur à 3,0 le taux de survie a diminué à environ log 5. La diminution de la survie pH inférieur à 3,0 a été rapide mais régulière au fil du temps. À un pH de 3,5 et au-dessus, la souche est résistante à au moins 120 minutes. Figure 5 Comparaison de la résistance acide de Bifidobacterium longum subsp. infantis 14390 en suspension dans NaCl ou du lait écrémé. Gauche: bifidobactéries remises en suspension dans NaCl, à droite: bifidobactéries remis en suspension dans le lait. Axe X: temps (min); Axe Y: le pH; log ufc sont représentés en couleur (échelle sur la droite des graphiques). Les nombres dans les noms bactériens sont les numéros de contrainte dans la FAM-base de données de l'ALP.
La colonne de gauche de la figure 5 montre la même souche sans lait écrémé ajouté. À un pH supérieur à 3,5, il n'y a pas eu d'influence sur la survie des bactéries. Cependant, un pH inférieur à 3,5 la survie diminuée en fonction de la durée d'incubation. Entre pH 3,0 et 3,5 la souche avait déjà diminué d'environ log 5. Après 30 minutes d'incubation, il y avait presque une diminution linéaire de la survie avec la diminution de pH de 3,0 à 2,5.
Simulation dans le bioréacteur
La plupart des systèmes décrits dans la littérature se composent de plusieurs récipients de réaction, par exemple, le SHIME [6]. D'autres études ont utilisé des cellules immobilisées avec trois réacteurs [25] ou d'un système de dialyse [8]. Basé sur le travail de Sumeri et al
. [9] et les données recueillies sur les conditions dans le passage intestinal, nous avons pu limiter la simulation à un navire. En même temps que les données provenant du criblage de la résistance aux acides, la sélection d'une composition de départ possible du pH et du bouillon dans le simulateur pourrait être choisi. Les paramètres de simulation résultantes sont montrées sur la figure 1 et décrit dans la section Matériels et Méthodes. Au cours de la phase expérimentale de cette étude, Sumeri et al
. [9] ont développé un système similaire pour évaluer
Lactobacillus sp. dans une simulation de passage estomac-intestin.
Le progiciel "Lucullus" était un excellent outil pour contrôler le pH et le procédé selon la simulation développée. Sélectionner le support dans le bioréacteur a été simplifiée en choisissant le milieu de croissance pour les souches correspondant, supplémenté avec du lait écrémé, fonctionnant comme une matrice alimentaire simulée. Par la suite, il a été acidifiée au pH de départ et complété par des solutions enzymatiques, comme décrit dans Matériels et Méthodes. Les simulations ont été réalisées en série, un par jour. Les résultats sont présentés sur la figure 6. Les souches utilisées pour la simulation sont énumérés dans le tableau 3 (seulement Bifidobacterium dentium
a été exclu) et ont été normalisées à une DO 650 de 1,5 avant l'inoculation. Figure 6 Développement de 7 souches de Bifidobacterium pendant la simulation de passage estomac-intestinal pendant 7 h. La ligne pointillée montre le moment de l'addition de sels biliaires et du suc pancréatique. Les nombres dans les noms bactériens sont les numéros de contrainte dans la FAM-base de données de l'ALP.
Tableau 3 Souches testées dans la simulation.
Nom
Numéro d'identification de l'ALP collection de souches
Bifidobacterium adolescentis
FAM-14377
Bifidobacterium breve
FAM-14398
Bifidobacterium longum
subsp.
FAM-14390 de infantis
subsp Bifidobacterium animalis.
FAM-14403 de Lactis
Bifidobacterium dentium
FAM-14396
Bifidobacterium
FAM-14382 de longum, -14383, -14406
Lactobacillus gasseri
K7
FAM-14459
Bifidobacterium adolescentis
a été inoculée comme décrit ci-dessus à une concentration initiale de 10 7 ufc ml -1 et une diminution presque linéaire à moins de 10 4 ufc ml -1 après 5 heures. B. breve
et B. longum
souches avaient une concentration initiale comprise entre 10 7 et 10 8 ufc ml -1 et a diminué à moins de 10 2 ufc ml -1 au cours des 30 premières minutes. subsp B. animalis. lactis
14403 survécu à environ 15% de l'ufc moyenne initiale de 5 x 10 8 ufc ml -1. Il y avait une diminution rapide de la survie de B. longum
subsp. infantis
au cours des 30 premières minutes. Ensuite, la survie n'a diminué que lentement à partir de 10 5 à 10 4 ufc ml -1.
Dans une phase ultérieure, Lactobacillus gasseri
K7 a été inclus dans l'étude depuis plusieurs projets en cours d'exécution ont été à ce moment dans notre institut avec cette souche. Lactobacillus gasseri
K7 a été inoculé à 2,2 x 10 7 ufc ml -1 et après 7 h simulation une concentration de 10 cellules 5 ufc ml -1 vivant était encore présent dans le milieux de culture (figure 7, la courbe pour 250 ml de pré-culture). La réduction la plus élevée de la survie a été dans les 2 premières heures et commence immédiatement après l'addition de sels biliaires et de jus gastriques. Pendant cette période, il y a eu une réduction des cellules par log 2. vivant Pendant le reste du temps de simulation, il y avait seulement une réduction des cellules vivantes log 1. Figure 7: Comparaison de l'influence de 100 ml de préculture de Lactobacillus gasseri K7 avec 250 ml de pré-culture. La pré-culture a été récolté par centrifugation et remis en suspension dans une solution physiologique de chlorure de sodium pour atteindre une DO600 de 1,5. La simulation de passage estomac-intestinal a été incubé en utilisant la solution ajustée et incubé pendant 7 h. La ligne en pointillés indique l'addition de sels biliaires et de suc pancréatique. Les courbes représentent la moyenne d'essais en double.
La préparation de l'inoculum de L. gasseri
K7 dans un volume de culture de 100 ml a été également évaluée. Les résultats des expériences sont présentés sur la figure 7. Avec 250 ml de culture de la diminution dans les cellules vivantes est d'environ log 2, alors que la diminution d'une culture de 100 ml a été seulement 1 log sur toute la durée d'incubation. Discussion de
Cependant, 2 h après l'addition de sels biliaires et du pancréas jus, la diminution des cellules comptages était similaire pour les deux volumes. Lorsque la récolte d'une culture après un temps d'incubation donné, la phase de chaque souche bactérienne de croissance peut être différent puisque tous ont des dynamiques différentes de croissance. Afin d'obtenir des cellules à approximativement la même phase de croissance, des expériences préliminaires ont été réalisées (données non représentées). Un temps d'incubation de 15 h pour la pré-culture est approprié pour toutes les souches testées, à l'exception Bifidobacterium longum
subsp. infantis
qui devait être incubé pendant seulement 12 h.
La tolérance acide criblage (figures 2, 3 et 4) a été réalisée pour évaluer l'effet du pH indépendamment des autres conditions. Bifidobacterium dentium
est très sensible à l'acide et par conséquent ne peut pas survivre au passage à travers l'estomac. La souche n'a donc pas inclus dans les expériences de simulation. Les souches de B. longum (figure 2) n'a donné de bien meilleurs résultats que B. dentium
(Figure 3). Cependant, près de pH 4, ils étaient plus résistants que B. dentium
.
B. longum subsp.
infantis est une des premières espèces de peupler l'intestin humain, peu après la naissance [26]. Sur la base des expériences de cette étude, cependant, le B.longum
subsp testés. infantis la souche ne serait en mesure de passer l'estomac du nourrisson en grand nombre, si le temps de transition dans l'estomac acide a été très court. La survie de la souche sélectionnée dans l'environnement testé était trop faible pour le passage réussi en grand nombre. Lorsque la souche a été remis en suspension dans le lait écrémé, la survie augmentée (figure 5). Cela pourrait être une indication que le lait maternel aide B. longum
subsp. Les souches infantis de passer le passage estomac-intestin avec à un taux de survie plus élevé.
Les effets protecteurs de protéines de lait dans le système digestif ont déjà été décrits dans la littérature [27]. La protection des protéines du lait a également été démontré dans cette étude (figure 5). Avec la matrice appropriée ou même un support, des bactéries probiotiques pourraient passer en toute sécurité à travers l'estomac dans les intestins pour atteindre leur site d'action.
B. Les souches adolescentis de qui peuplent l'intestin humain à un âge plus tard, avaient une résistance légèrement plus élevée que B. longum
subsp. infantis
qui peut expliquer la réduction de celle-ci au cours de la progression de l'enfant humain à l'âge adulte [26].
La souche la plus intéressante était subsp B. animalis. lactis
, qui était la souche moins sensible dans notre étude. Cette souche de pH résistant a un grand potentiel pour une utilisation dans les aliments comme un supplément de probiotiques car un nombre plus élevé de cellules bactériennes pourraient survivre au passage. Toutefois, pour utiliser cette souche comme probiotique, d'autres études doivent être effectués afin d'obtenir le statut probiotique selon la définition de Klaenhammer [3].
Dans notre étude, l'ingestion d'une matrice alimentaire a été simulé dans une première environnement du lait acidifié et d'un milieu de croissance. La solution gastrique simulé et de l'oxygène ajouté au cours de la phase de l'estomac ont augmenté le stress. Pendant le passage simulé à l'intestin grêle, l'oxygène a été remplacé par l'azote et le milieu a été neutralisé à pH 6,3. L'addition des sels biliaires du pancréas et la solution a terminé le passage dans l'intestin grêle. Cette in vitro
système n'a pas tenu compte du fait que la digestion in vivo
, les enzymes sont activés et inactivés substances et d'autres, par exemple les sels biliaires sont réabsorbés. Sumeri et al
. [9] ont trouvé une solution partielle pour contourner ce problème. Ils dilue le contenu du réacteur avec un milieu de dilution spécialement conçu. Une autre possibilité serait de faire précipiter les sels biliaires, à la fin de la simulation de l'intestin grêle, pour imiter le circuit entérohépatique. Ceci peut être réalisé avec des ions calcium [28-30]. Retrait des sels biliaires serait mieux simuler l'environnement du côlon et pourrait même permettre à bifidobactéries de proliférer.
Dans notre étude, les sels biliaires restants et le suc pancréatique dans la simulation conduit à un stress supplémentaire sur les bactéries qui ont probablement modifié les véritables caractéristiques des souches in vivo
.
le ufc à partir de la simulation varier dans un journal ufc même si le réglage de la DO 650 de l'inoculum a déjà été testé avec subsp les Bifidobacterium animalis. lactis
et Bifidobacterium longum
subsp. infantis
souches. Les bifidobactéries utilisées dans cette étude ont montré une tendance à former des amas qui peuvent résulter en ufc réduite (observations visuelles, données non présentées). Dans une autre étude, la formation de grappes pourrait être liée à la diminution du pH au cours de la croissance [31]. Ces groupes sont généralement considérés comme une seule colonie sur une plaque.
Figure 6 montre les résultats de la simulation de passage estomac-intestin plus de 7 h de sept souches Bifidobacterium
testées. La concentration des cellules de bifidobactéries vivant a diminué immédiatement après l'incubation en raison du faible pH (pH 3,0). Cependant, subsp B. animalis. lactis
est resté stable. Ceci confirme les résultats des expériences antérieures discutées ci-dessus (figure 4). Cette résistance pourrait être étendue aux sels biliaires et le suc pancréatique bien que le nombre de cellules de subsp B. animalis. lactis
a diminué d'environ 85% de la valeur initiale (figure 6). Par rapport aux autres souches utilisées dans cette étude, cependant, cette baisse est presque négligeable.
Tous B. longum
et les souches de B. breve est mort très rapidement au début de la simulation et étaient au-dessous de la détection limite de la méthode de placage en quelques heures (figure 6) qui était à prévoir à partir des résultats de l'expérience de criblage ci-dessus (figures 2 et 4).
d'autre part, B. longum
subsp.
infantis 14390 diminue rapidement au début de la simulation, mais après l'addition de sels biliaires et de jus pancréatique et un changement dans un environnement anaérobie, le taux de réduction diminue. Notre étude suggère que cette souche est bien adaptée aux conditions dans l'intestin, mais il doit être ingéré en grand nombre pour survivre aux conditions dans l'estomac (oxygène, pH bas). Comme il est mentionné ci-dessus, B.longum
subsp. Les souches de infantis appartiennent au premier groupe de bactéries peuplant l'intestin des nourrissons [26].
Contrairement aux B.longum
subsp. infantis
, B. adolescentis
a diminué de façon presque linéaire pendant la simulation de 7 h. Il n'y avait pas d'interruption détectable lorsque les conditions dans le fermenteur modifié. Sur la base des expériences pour le criblage de la tolérance de l'acide, ce résultat était inattendu.
Toutefois, cela pourrait être lié aux conditions d'essai où le sel de la bile et des concentrations de jus gastriques sont restés au niveau initial et ne sont pas dilués comme ils le seraient dans vivo
. Dans une expérience avenir, il convient d'évaluer si la méthode de dilution au point par Sumeri
et al. [9] stabiliserait le nombre de cellules de B. adolescentis
au cours de la période de simulation de 6 h dans l'intestin.
Dans notre étude, nous avons également évalué le passage estomac-intestin de Lactobacillus gasseri
K7. La souche a déjà été évalué pour la survie in vivo
chez les porcelets [14]. Par conséquent, il était possible de comparer nos résultats in vitro
avec des données provenant vivo
expériences.
Bogovic et al
. [14] porcelets nourris sur une période de 14 jours avec 5 * 10 10 jours ufc -1 de L. gasseri
K7. Cela a abouti à env. 7 * 10 4 ufc g -1 dans les matières fécales pendant la période d'alimentation. Il doit être pris en compte que la concentration de bactéries a été diluée avant d'arriver finalement au passage de l'estomac intestin. Dans une approximation grossière, nous avons estimé qu'environ 1% sont arrivés au passage. Cela nous a permis de comparer les résultats de cette étude de porcelet à la fin de notre simulation.
Comme le montre la Figure 5, L. gasseri
K7 avait une concentration cellulaire d'environ 5 * 10 4 ufc ml -1 après la période de simulation 7 h (avec une pré-culture de 250 ml) qui est similaire à la concentration dans les matières fécales des porcelets. Ceci suggère que le modèle de simulation utilisé dans cette étude pourrait être un outil utile pour estimer les effets du passage dans un modèle in-vitro
avant l'utilisation coûteuse dans des modèles in vivo
. Le modèle pourrait être encore optimisé en diluant les sels biliaires et du suc pancréatique, comme décrit par Sumeri
et al. [9]. Pour simuler l'activation et la désactivation des enzymes d'une méthode appropriée doit encore être trouvé.
Lorsque seulement 100 ml de milieu a été utilisé pour l'inoculum de L. gasseri
K7, la culture a survécu à la simulation meilleure (figure 7). Les deux volumes ont eu un nombre similaire de cellule initiale. On a inoculé des volumes de 1 ml. Par conséquent, la culture avec 250 ml de volume était dans un stade précoce de la croissance de la culture de 100 ml. Ces résultats sont une indication de la dépendance de la phase de croissance de la culture pour en période de stress.
Conclusion
Dans cette étude, nous avons pu montrer que le système pour simuler le passage estomac-intestin développé par Sumeri et al
. [9] a été adapté à l'évaluation de la survie des 8 souches Bifidobacterium et Lactobacillus
gasseri
K7, même si nous ne simulons l'élimination des sels de jus et de la bile gastriques. Pour L. gasseri
K7, nous avons pu comparer les résultats avec une étude in vivo sur
porcelets et obtenu des résultats similaires.
Le système de réacteur unique présenté ici permet une identification plus simple de la phase de croissance idéale pour toute souche probiotique possible qui est nécessaire pour passer le passage estomac-intestin que si elle devait être réalisée avec d'autres systèmes avec une configuration difficile.
l'étude a également montré que tous testé des souches Bifidobacterium de, sauf pour B. animalis subsp. lactis
, nécessiterait des agents de protection pour survivre au passage dans l'estomac-intestin en grand nombre. Cela pourrait être fait en utilisant une matrice alimentaire appropriée ou l'encapsulation des cellules.
Méthodes
souches bactériennes
Toutes les souches de bifidobactéries ont été sélectionnés à partir de la collection de souches d'Agroscope Liebefeld-Posieux ALP Station de recherche Suisse, isolé par ALP à partir sources humaines. Lactobacillus gasseri
K7 provient de la Collection ZIM des micro-organismes industriels de l'Université de Ljubljana, Faculté biotechnique (ZIM 105) [10] et a également été déposé dans la collection de souches ALP. Les souches testées et leur numéro d'identification de la collection de souches ALP sont énumérés dans le tableau 3. Toutes les souches de bifidobactéries sont la propriété de ALP
médias et des conditions de croissance
Pour pré-cultures., Conserve 1 ml congelés des souches étaient inoculée dans 250 ml Wilkins-Chalgren bouillon (WC CM0643, Oxoid, Hampshire, Royaume-Uni) additionné de 9 gl -1 supplémentaire lactose monohydraté (bifidobactéries) ou de Man-Rogosa-Sharpe (MRS; Biolife, Milan, Italie) moyen (Lactobacillus gasseri
K7) [32]. Pour L
. gasseri K7, un essai avec une pré-culture ml 100 a également été réalisée. Toutes les souches, sauf subsp Bifidobacterium longum.
infantis, ont été incubées à 37 ° C pendant 15 heures dans des conditions anaérobies. Bifidobacterium longum
subsp. infantis
a été incubé pendant 12 h, car il était très sensible aux périodes d'incubation prolongées. Les pré-cultures ont été centrifugées pendant 15 min à 3500 tours par minute et les culots remis en suspension dans 10 ml d'une solution de chlorure de sodium physiologique tamponnée au phosphate (PBS).
Détermination du nombre
Le nombre de cellules a été déterminée par 10 un facteur cellulaire la dilution en série de la culture dans une solution saline physiologique. Les deux plus hautes dilutions ont ensuite été étalées sur gélose MRS (Biolife, Milano, Italie) en utilisant un plater en spirale (Instruments IUL, Barcelone, Espagne) et évaluées par un compteur de colonies automatique avec le logiciel correspondant (Instruments IUL, Barcelone, Espagne).
criblage pour la résistance à l'acide
pour le criblage de la résistance à l'acide à la suspension concentrée de cellules de la pré-culture a été introduit à la pipette dans 20 ml de PBS jusqu'à une DO 650 1,0 a été atteint. 4 ml de cette suspension cellulaire ont ensuite été inoculées dans 16 ml de tampon citrate-HCI (tri-Na-Citratex2 H 2 O 7,35 g et 250 ml d'eau distillée H 2 O, adaptée au pH correspondant avec du HCl 1 M) à des pH de 2,0, 2,5, 3,0, 3,5 et 4,0. L'incubation a été effectuée à 37 ° C et on prélève des échantillons toutes les 30 minutes pendant 120 minutes. 1 ml d'échantillons ont été mélangés avec 9 ml de 0,25 M de tampon phosphate à pH 7,0 à la première étape de la série de dilutions. Pour le test de résistance à l'acide dans une matrice alimentaire, la même quantité de pré-culture telle qu'elle est utilisée ci-dessus (ajustée à une DO 650 1,0) a été introduit à la pipette dans 20 ml de lait UHT écrémé. 4 ml de cette suspension cellulaire dans le lait ont été inoculées dans 16 ml de tampon citrate-HCI. Tous les produits chimiques ont été achetés chez Merck (Darmstadt, Allemagne). Les données pour les expériences de criblage a été visualisées dans des parcelles de contour en utilisant le logiciel Sigmaplot 11.0 (Systat Software Inc., Chicago IL, USA).
Simulation dans le bioréacteur
Toutes les solutions ont été fraîchement préparées pour chaque expérience. la solution de l'estomac simulé a été de 50 mg de pepsine muqueuse gastrique porcine (Sigma-Aldrich P7012, Buchs, Suisse) dans 20 ml de 0,1 M HCl. Pour la simulation de jus pancréatique 2 g de pancreatine (Sigma-Aldrich P7545) ont été dissous dans 50 ml de tampon phosphate 0,02 M à un pH de 7,5. solution de sel de bile simulée a été faite de 7,5 g de bile bovine (Sigma-Aldrich B3883) en jusqu'à 50 ml avec de l'eau distillée 2O. Le bouillon pour la simulation était soit 1 l WC ou MRS bouillon avec 29,41 g citratex2 trisodique H 2O. Au cours de l'essai de survie dans une matrice alimentaire, 500 ml de lait UHT écrémé ont été ajoutés et le pH a été ajusté à 3,0 avec HCl 5 M, peu avant la simulation. 1 l de milieu a été ajouté au bioréacteur (NewMBR Mini, NewMBR, Suisse) préalablement stérilisé avec de l'eau (121 ° C, 20 min) et on chauffe à 37 ° C. Pendant la simulation de l'estomac, l'aération a été mis en œuvre. La fermentation a été contrôlée et enregistrée en utilisant le Lucullus de logiciel de gestion de processus intégré (Biospectra, Schlieren, Suisse). La suspension cellulaire concentrée à partir de la pré-culture a été introduit à la pipette dans 40 ml de PBS à une DO 650 1,5. Peu de temps avant l'inoculation de 40 ml de suspension cellulaire, 20 ml de la solution de l'estomac simulé a été ajouté au milieu (1 litre) dans le bioréacteur.

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