Arviointi kulkua Lactobacillus gasseri K7 ja bifidobakteerien mahasta suolistossa yhdellä reaktorimalli

Arviointi kulkua Lactobacillus gasseri
K7 ja bifidobakteerien mahasta suolistossa käyttämällä yhdessä reaktorissa mallin
tiivistelmä
tausta
probioottisten bakteerien uskotaan olevan tärkeä rooli ruoansulatuskanavan ja siksi on hengissä siirtyminen vatsan suolistossa. Äskettäin uusi lähestymistapa simuloida kulkua mahalaukusta suolistossa yhdessä bioreaktorissa kehitettiin. Etuna tässä automatisoitu yhden reaktorin järjestelmä oli mahdollisuus testata happojen vaikutuksesta, sappisuolojen ja pankreatiinista.
Lactobacillus gasseri
K7 on eristetty kanta pikkulasten ulosteista, joiden ominaisuudet tekevät kanta mielenkiintoinen juuston tuotantoa. Tässä tutkimuksessa yksireaktorijärjestelmällä käytettiin arvioimaan selviytymisen L. gasseri
K7 ja valittu bifidobakteerien meidän kokoelma mahan läpi suoliston kulkua.
Tulokset
Alustava seulonta haponkestokykyä Happamoituneista kulttuuri media oli alhainen sietokyky Bifidobacterium dentium
tämä ehto osoittaa alhainen selviytymistä kulkua. Samanlaisia ​​tuloksia saavutettiin B. longum
subsp. infantis
taas B. animaliksella
subsp. lactis
oli korkea selviytymisen.
Nämä ensimmäiset tulokset vahvistettiin bioreaktorissa malli mahan-suolen kulkua. B. animaliksella
subsp. lactis
oli korkein eloonjäämisaste (10%) saavuttamiseksi noin 5 x 10 6 pmy ml -1 verrattuna muihin testattu bifidobakteerien kantoja, jotka vähenivät kertoimella jopa 10 6 . Lactobacillus gasseri
K7 oli vähemmän kestävä kuin B. animaliksella
subsp. lactis
mutta selvisi solussa pitoisuus on noin 1000 kertaa suurempi kuin muissa bifidobakteerien.
Päätelmä
Tässä tutkimuksessa pystyimme osoittamaan, että L. gasseri
K7 oli korkea eloonjäämisaste on vatsa- suoli passage. Vertaamalla tuloksia aikaisemmassa tutkimuksessa porsailla voisimme vahvistaa luotettavuutta simulointi. Testatuista bifidobakteerien kantoja, vain B. animaliksella
subsp. lactis
osoitti hyväksyttävää selviytymisen onnistuneen kulun simulaatiossa järjestelmässä.
Background
Probiootit, erityisesti maitohappobakteerit suotuisia vaikutuksia kuluttajiin terveydelle kuten on ehdotettu vuonna 1907 [1]. Uskottiin, että bakteerit kontrolloivat pääasiassa aiheuttamien infektioiden enteerisellä taudinaiheuttajien ja säännellyn toxoaemia, mikä parantaa terveyttä ja vaikuttaminen kuolleisuutta. Samalla se on ollut tiedossa, että jotkut myönteiset vaikutukset kuluttajiin terveyteen ovat parannus mikroflooran tasapainoa suolistossa, stimulaatio immuunijärjestelmän, ja avunanto organismi taistella patogeenisten mikro-organismien [2]. Suuri osa kiinnostusta keskittyi käytöstä kantoja suvuista Lactobacillus
ja Bifidobacterium
, vaikka on olemassa myös muita bakteereita probioottien vaikutuksia, esim. Joissakin propionibakteerien.
Edellä mainitut ominaisuudet ovat myös perusta mikro-organismi on merkittävä probiootti. On olemassa erilaisia ​​määritelmiä maailmanlaajuisesti, mutta ne ovat samanlaisia ​​sisällöltään. Yksi kriteerit probioottikannois- on sen kestävyys happamuus ja mahalaukun ratkaisuja ruoansulatuskanava [3]. Siksi on tärkeää, arvioida vastuksen mahdollisen probioottikanta happamaan ja mahan ympäristöä suolistossa.
Takia korkeat kustannukset ja eettisiä sekä turvallisuusmääräyksiä kliinisten tutkimusten seulonta selviytyminen on helpompi simuloida in vitro
. Yksinkertainen testi on inkuboida bakteerisolujen happamissa tai sapen suolaliuokset tietyksi ajaksi ja laskea, kuinka monta eloonjääneiden solujen. Seuraavassa vaiheessa, simulaatio suoritetaan levoton pulloissa yhdistyvät happamuus ja mahalaukun ratkaisuista seuraa arvio eloonjääneiden solujen koko simulointi. Tämä on realistisempi replikointi ehtojen suolistossa [4]. Toinen järjestelmä, simulaattoria ihmisen suoliston mikrobien Ecosystem (SHIME), koostuu 5-6 kytketty sarjaan pH ohjattu bioreaktoreissa [5-7]. Asennus on varsin monimutkainen ja vaatii ehdotonta anaerobiset olosuhteet. Lisäksi imeytymistä aineenvaihduntatuotteiden ja veden käyttö ei ole simuloitu. Tämä välttää käyttämällä dialyysikalvoja kuten ovat kuvanneet Marteau ym
. [8].
Äskettäin uusi järjestelmä käyttämällä yhtä bioreaktorissa on kehitetty tutkia mahan-suolen läpikulun [9]. Järjestelmä sallittu pH muutettava sisällä yhden reaktorin ja sopeutettiin retentioajat eri alueilla mahan-suolen läpikulun.
Lactobacillus gasseri
K7 äskettäin eristettiin pikkulasten ulosteista [10]. Se tuottaa bakteriosiinin joka tehoaa Clostridium
sp. ja niiden itiöt. L. gasseri
kuuluu niin kutsuttu "acidophilus" -ryhmä ja useita riippumattomia tutkimuksia tunnistaa näistä kannoista asukkaina ihon ja suoliston [11-13]. Aiemmissa kokeissa on jo osoitettu in vitro
että L. gasseri
K7 selvinnyt happamassa ympäristössä ja 0,3% sappihappojen [10]. Nämä havainnot tekevät kannan mielenkiintoinen mahdollisena probiootti.
Tässä tutkimuksessa yhden bioreaktori, joka perustuu työhön Sumeri et al
. [9] käytettiin arvioimaan selviytymisen Lactobacillus gasseri
K7 ja kahdeksan Bifidobacterium
kantoja meidän kokoelma. Pystyimme vertailemaan tuloksia L. gasseri
K7 kanssa suoritetussa tutkimuksessa porsaat [14], joka oli mahdollista arvioida, korrelaation in vitro
tutkimuksessa tulokset in vivo
kokeiluja .
retentioajat ja käytetty pH tässä tutkimuksessa saatujen tietojen perusteella kirjallisuudessa. On olemassa useita menetelmiä, joilla mitataan pH suolistossa [15]. Taulukossa 1 on esitetty pH-arvot eri osien suolistossa mitattuna Heidelberg kapseli [16, 17]. Retentioajat voidaan laskea joko käyttämällä merkkiainetta (kemiallinen) tai radiolla telemetrian kapselit kuten Heidelberg
kapseli [18]. Kuitenkin kapselit yleensä pidempi retentioajat kuin kemialliset merkkiaineet. Taulukossa 2 luetellaan joitakin Retentioaikojen löytyy kirjallisuudesta [4, 5, 19-24] .table 1 pH-arvot ihmisen suolistossa, mitattuna Heidelberg
kapseli.

Vatsa
pohjukaissuoli
tyhjäsuolen
Ileum
proksimaalisen
mediaalinen
Distal
pH
1,4 **
6,22 *
6,4 **
7,1 **
7.4 **
* Fallingborg et al
. 1994 [16]
** Fallingborg et al
. 1998 [17]
Taulukko 2 retentioajat ohutsuolessa mainittu kirjallisuudessa.
Retentioaika
Lähde
Huomautuksia

1-4 h
Huang ja Adams 2004 [21]
4,25 h
Van Den Driessche et al
. 2000 [24]
mahalaukun ja ohutsuolen
4 h
Mojaverian 1996 [22]
6 h
Picot ja Lacroix 2004 [4]
Valittu maksimiajan simulaatio
7,5 h
Fallingborg et al
. 1990 [20]
Children
8 h
Fallingborg et al
. 1989 [19]
8 h
Alander ym
. 1998 [5]
Simulation vuonna SHIME Reactor
6-10 h
Thews et al
. 1991 [23]
tietojen perusteella löytyy kirjallisuudesta ja työn Sumeri et al
. [9] käymisprosessin perustettiin esitetty materiaalit ja menetelmät ja on esitetty kuvassa 1. Kuva 1 parametrit mahan-suolen passage simulointi yli 7 h.
Tulokset
Acid vastus seulonta
tavoitteena ensimmäinen koesarja oli saada yleiskuva haponkestoon kahdeksan bifidobakteerien kantojen. Kuviot 2, 3 ja 4 esittävät eloonjäämisen näiden kantojen avulla ääriviivapiirrokset tehty Sigmaplot. Bifidobacterium dentium
(kuvio 3) osoitti, että ainakin haponkestävyys. Välillä pH 4,0 ja pH 2,0 ei ollut eroa selviytymisen ja solujen pitoisuus laski yli 7 log 40 minuutissa. Bifidobacterium animaliksella
subsp. lactis
oli vastustuskykyisempiä jopa 40 minuuttia pH: ssa 2,0, mutta väheni sitten noin 3 log kun inkuboitiin 120 minuuttia (kuva 4). PH: ssa välillä 2,5 ja 3,0 lasku oli vähemmän kuin 1 log 120 minuutin jälkeen. Kuvio 2 Acid vastus kolme Bifidobacterium longum kantoja. X-akseli: aika (min); Y-akseli: pH; log cfu näkyvät värillisinä (asteikko oikealla kaavioita). Numerot bakteerien nimet ovat rasitusta numeroita FAM-tietokanta ALP.
Kuvio 3 Acid vastus Bifidobacterium dentium, B. longum subsp. infantis ja B. adolescentis. X-akseli: aika (min); Y-akseli: pH; log cfu näkyvät värillisinä (asteikko oikealla kaavioita). Numerot bakteerien nimet ovat rasitusta numeroita FAM-tietokanta ALP.
Kuva 4 Acid vastus Bifidobacterium breve ja B. animalis subsp. lactis. X-akseli: aika (min); Y-akseli: pH; log cfu näkyvät värillisinä (asteikko oikealla kaavioita). Numerot bakteerien nimet ovat rasitusta numeroita FAM-tietokanta ALP.
Kaikki muut testatut Bifidobacterium
kantoja (B. longum, B. breve, B. longum
subsp. Infantis ja B. adolescentiksen
) osoitti samanlaista, mutta eri mallia B. animaliksella
subsp. lactis
(kuviot 2, 3 ja 4). Heillä oli lyhyt elinaika alle pH 2,5 ja selviytyi korkeammat numerot yllä pH 3,5.
Kun tavoitteena on kehittää menetelmä simuloida GI bioreaktorissa, lisätesti tehtiin yhden kannan. Jos haluat tarkkailla vaikutus elintarvikkeen matriisin, tiivistetty B. longum
subsp. infantis
uudelleensuspendoitiin rasvatonta maitoa ennen siirrostamalla happamaksi ratkaisuihin. Kuten esitetään oikeanpuoleisessa sarakkeessa kuvion 5 maito oli suora vaikutus eloonjäämiseen kannan. Välillä pH 3,0 ja 3,5 bakteerien elossa 120 min alentamalla tukin 2. Alla pH 3,0 selviytymisen laski noin log 5 lasku eloonjääminen alle pH 3,0 oli nopea, mutta säännöllisesti ajan mittaan. PH: ssa 3,5 ja yli, kanta oli resistentti vähintään 120 minuuttia. Kuvio 5 vertailu hapon vastustuskyky Bifidobacterium longum subsp. infantis 14390 keskeytetty NaCl tai rasvatonta maitoa. Vasen: bifidobakteerit uudelleensuspendoitiin NaCl, oikeassa: bifidobakteerien resuspendoitiin maitoon. X-akseli: aika (min); Y-akseli: pH; log cfu näkyvät värillisinä (asteikko oikealla kaavioita). Numerot bakteerien nimet ovat rasitusta numeroita FAM-tietokanta ALP.
Vasemmassa sarakkeessa kuvio 5 esittää samaa kantaa ilman lisättyä rasvatonta maitoa. PH: ssa yli 3,5, ei ollut vaikutusta elinkykyyn. Kuitenkin alle pH 3,5 selviytymisen laski riippuen inkubaatioaika. Välillä pH 3,0 ja 3,5 kanta oli jo laskenut noin log 5. Inkuboitiin 30 min, oli lähes lineaarinen lasku selviytymisen laskevilla pH 3,0-2,5.
Simulation bioreaktorissa Dating kuvattujen kirjallisuudessa koostua useista reaktion alusta, esimerkiksi SHIME [6]. Muut tutkimukset käytetään immobilisoituja soluja, jossa on kolme reaktoria [25], tai sen dialyysijärjestelmä [8]. Perustuu työn Sumeri et al
. [9] ja kerättyjen tietojen ehtojen suoliston passage pystyimme rajoittaa simulointi yksi alus. Yhdessä datan haponkestoon seulonta, valinta mahdollisen alkaa pH ja liemen koostumus simulaattoria voidaan valita. Tuloksena simulointi parametrit on esitetty kuvassa 1 ja kuvattu Materiaalit ja menetelmät osassa. Aikana kokeiluasteella Tämän tutkimuksen Sumeri et al
. [9] kehittänyt samanlaisen järjestelmä arvioi Lactobacillus
sp. mahassa suoliston läpikulun simulointi.
ohjelmistopaketti "Lucullus" oli erinomainen työkalu pH: n säätämiseksi ja menetelmän mukaan on kehitetty simulointi. Valitaan väliaine bioreaktorissa yksinkertaistettiin valitsemalla vastaava kasvualusta Kantojen täydennetty kuorittua maitoa, joka toimii simuloidun elintarvikkeiden matriisi. Sen jälkeen se tehtiin happamaksi lähtöaineena pH ja täydennetty entsyymin ratkaisuja, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Simuloinnit suoritettiin sarjoittain, yksi päivässä. Tulokset on esitetty kuviossa 6. kantoja käytetään simuloinnissa on lueteltu taulukossa 3 (vain Bifidobacterium dentium
jätettiin) ja standardoitu OD 650 1,5 ennen siirrostusta. Kuva 6 kehitys 7 Bifidobacterium-kantojen aikana mahalaukun ja suoliston kulkua simulointi 7 tuntia. Katkoviiva näyttää ajan lisäämisen sappisuolojen ja haiman mehu. Numerot bakteerien nimet ovat rasitusta numeroita FAM-tietokanta ALP.
Taulukko 3 Kannat testattiin simulaation.
Name
tunnistenumero ALP kantakokoelmasta
Bifidobacterium adolescentis
FAM-14377
Bifidobacterium breve
FAM-14398
Bifidobacterium longum
subsp. infantis
FAM-14390
Bifidobacterium animaliksella
subsp. Lactis
FAM-14403
Bifidobacterium dentium
FAM-14396
Bifidobacterium longum
FAM-14382, -14383, -14406
Lactobacillus gasseri
K7
FAM-14459
Bifidobacterium adolescentis
ympättiin edellä kuvatulla alkupitoisuutena 10 7 pmy ml -1 ja laski lähes lineaarisesti alle 10 4 pmy ml -1 5 tunnin kuluttua. B. breve
ja B. longum
kannat oli aluksi pitoisuutena 10 7 ja 10 8 pmy ml -1 ja vähentynyt alle 10 2 pmy ml -1 ensimmäisten 30 minuutin aikana. B. animaliksella
subsp. lactis
14403 selviytyi noin 15% alkuperäisestä keskimääräinen cfu 5 x 10 8 pmy ml -1. Oli nopea väheneminen selviytymisen B. longum
subsp. infantis
yli ensimmäisen 30 min. Jälkeenpäin selviytymisen laski vain hitaasti 10 5-10 4 pmy ml -1.
Myöhemmässä vaiheessa, Lactobacillus gasseri
K7 otettiin mukaan tutkimukseen, koska useita projekteja käynnissä tällä kertaa meidän instituutin kanssa tämän kannan. Lactobacillus gasseri
K7 ympättiin 2,2 x 10 7 pmy ml -1 ja sen jälkeen 7 h simulaatio pitoisuuteen 10 5 pmy ml -1 eläviä soluja oli edelleen läsnä elatusaineet (kuvio 7, käyrä 250 ml pre-kulttuuri). Korkein väheneminen eloonjääminen oli ensimmäisten 2 tunnin aikana ja alkoi heti lisäämisen jälkeen mahanesteen ja sappihappojen. Tuona aikana oli vähentää elävien solujen log 2. Muina simulaation ajan, oli vain log 1 väheneminen eläviä soluja. Kuva 7 vertailu vaikutuksesta 100 ml ennalta Lactobacillus gasseri K7 250 ml pre-kulttuuri. Pre-viljelmä talteen sentrifugoimalla ja suspendoitiin uudelleen fysiologiseen natriumkloridiliuokseen saavuttaa OD600 -arvoon 1,5. Vatsa-suolikanavan läpikulku simulointi inkuboitiin käyttäen säädetyn liuoksen ja inkuboitiin 7 tuntia. Katkoviiva osoittaa lisäksi sappisuolojen ja haiman mehu. Käyrät ovat keskiarvoja päällekkäisiä kokeita.
Siirrostuksen valmistus L. gasseri
K7 100 ml: n viljelmä tilavuus arvioitiin myös. Tulokset kokeista on esitetty kuviossa 7. 250 ml: n viljelmä lasku elävien solujen oli noin log 2 ottaa huomioon, että lasku, jossa on 100 ml: n viljelmä kirjautua sisään vain 1 koko inkuboinnin ajan. Kuitenkin 2 h lisäyksen jälkeen sappisuolojen ja haiman mehu, lasku solumäärä oli samanlainen molemmille määriä.
Keskustelu
korjuussa kulttuurin jälkeen tietyn inkubointiajan kasvuvaiheen kunkin bakteerikantaa voi olla erilainen, koska kaikilla on erilaisia ​​kasvun dynamiikkaa. Jotta saataisiin soluja suunnilleen samalla kasvuvaiheessa, alustavat kokeet suoritettiin (tietoja ei ole esitetty). Inkubointiaika 15 h: n esiviljelmä oli sopiva kaikille testatuilla kannoilla, paitsi Bifidobacterium longum
subsp. infantis
joka tarvitaan inkuboidaan vain 12 h.
haponsietokyky seulonta (kuviot 2, 3 ja 4) suoritettiin vaikutuksen arvioimiseksi pH riippumatta muita ehtoja. Bifidobacterium dentium
oli erittäin herkkä hapan ja siksi eivät todennäköisesti selviäisi läpikulun vatsaan. Kantaa näin ollen eivät sisälly Simulointikokeiden. B. longum
kantoja (kuvio 2) eivät tuottaneet paljon parempia tuloksia kuin B. dentium
(kuvio 3). Kuitenkin lähellä pH 4 olivat vastustuskykyisempiä kuin B. dentium
.
B. longum
subsp. infantis
on yksi ensimmäisen lajin asuttaa ihmisen suolistossa pian syntymän jälkeen [26]. Kokeiden perusteella tässä tutkimuksessa kuitenkin testattu B. longum
subsp. infantis
kanta olisi vain voi siirtää vauvan vatsa suurina määrinä, jos nousuaika happamassa mahalaukussa oli hyvin lyhyt. Selviytyminen Valitun rasitusta testattu ympäristö oli liian alhainen onnistuneen kulun suurina määrinä. Kun kanta suspendoitiin rasvaton maito, selviytyminen lisääntyi (kuvio 5). Tämä voi olla merkki siitä, että äidinmaidon auttaa B. longum
subsp. infantis
kannat siirtää mahan-suolen passage korkeammalla eloonjääneitä.
suojaavia vaikutuksia maidon proteiinien ruoansulatuskanavan on jo kuvattu kirjallisuudessa [27]. Protection maidon proteiinien on myös osoitettu tässä tutkimuksessa (kuvio 5). Kun sopiva matriisi tai jopa harjoittaja, probioottibakteereille voisi turvallisesti läpi mahalaukun suolistoon päästä niiden päällä toiminnan.
B. adolescentiksen
kantoja, jotka kansoittavat ihmisen suolistossa myöhemmässä iässä, oli hieman suurempi vastus kuin B. longum
subsp. infantis
mikä voi selittää vähentäminen jälkimmäisen edetessä ihmisen lapsen aikuisuuteen [26].
mielenkiintoisin kanta oli B. animalis
subsp. lactis
, joka oli vähiten herkkä kanta tutkimuksessamme. Tämä pH-resistentti kanta on suuri potentiaali käytettäväksi elintarvikkeissa kuin probiootti täydentää, koska suurempi määrä bakteerisolujen selviäisi kulkua. Kuitenkin käyttää tätä rasitusta kuin probiootti, lisää tutkimuksia on suoritettava saavuttamiseksi probiootti aseman mukaan määritelmän Klaenhammer [3].
Tutkimuksessamme nauttimisen elintarvikkeen matriisin simuloitiin aluksi ympäristö hapatettu maito ja kasvualustaan. Lisätyn simuloitu maha- liuos ja happi aikana mahan vaiheen lisäsi stressiä. Aikana simuloitu siirtymistä ohutsuoleen happi korvattiin typellä ja väliaine neutraloitiin pH-arvoon 6,3. Lisäämällä haiman liuosta ja sappihappojen loppuun kulumisen ohutsuoleen. Tämä in vitro
järjestelmä ei ota huomioon, että in vivo
ruoansulatus, entsyymit aktivoituvat ja passiivinen ja muita aineita, esim. sappi suolat imeytyvät. Sumeri ym
. [9] löysi osaratkaisu ohittaa tämän ongelman. Ne laimennettiin sisältö reaktoriin on erityisesti suunniteltu laimennus väliaineessa. Toinen mahdollisuus olisi saostamiseksi sappihappojen lopussa simulointi ohutsuolen jäljitellä enterohepaattiseen kiertoon. Tämä voitaisiin suorittaa kalsiumionien [28-30]. Irrottaminen sappisuolojen paremmin simuloida ympäristön paksusuolen ja saattavat jopa antaa bifidobakteerien lisääntyä.
Tutkimuksessamme jäljellä sappihappojen ja haiman mehu simuloinnissa johti lisärasitusta bakteereja, jotka todennäköisesti muuttanut todellisia ominaisuuksia kantojen in vivo
.
alkaen cfu simuloinnissa vaihteli yhden log pmy vaikka säätö OD 650 ymppiliuos aikaisemmin testattiin Bifidobacterium animaliksella
subsp. lactis
ja Bifidobacterium longum
subsp. infantis
kantoja. Bifidobakteereista käytettiin tässä tutkimuksessa osoitti taipumus muodostaa klustereita, jotka voivat johtaa vähentää pmy (visuaaliset havainnot, tuloksia ei ole esitetty). Toisessa tutkimuksessa, klustereiden muodostumiseen voisi liittyä alenevan pH: kasvun aikana [31]. Nämä klusterit ovat yleensä lasketaan yhdeksi pesäke lautaselle.
Kuvio 6 esittää tulokset mahan-suolen läpikulun simulointi yli 7 h seitsemän testattu Bifidobacterium
kantoja. Pitoisuus elävien solujen bifidobakteerien väheni heti inkuboinnin jälkeen alhaisen pH: n (pH 3,0). Kuitenkin, B. animalis
subsp. lactis
pysyi vakaana. Tämä vahvisti tulokset edellisten kokeiden edellä (kuvio 4). Tämä vastus voidaan laajentaa sappihappojen ja haiman mehu vaikka solumäärät B. animaliksella
subsp. lactis
laski noin 85% alkuperäisestä arvosta (kuvio 6). Verrattuna muihin kantoihin tässä tutkimuksessa käytetyt, mutta tämä lasku oli lähes olematon.
Kaikki B. longum
ja B. breve
kannat kuoli hyvin nopeasti alussa simulaation ja olivat alle määritysrajan raja pinnoitusmenetelmä muutaman tunnin kuluessa (kuvio 6), joka oli odotettavissa tuloksista seulonnan kokeen edellä (kuviot 2 ja 4).
Toisaalta, B. longum
subsp. infantis
14390 pieneni nopeasti alussa simulointi mutta lisäämisen jälkeen haimanesteen ja sappihappojen ja muutoksen anaerobiseen ympäristöön, vähentäminen laski. Tutkimuksemme osoittaa, että tämä kanta on hyvin sopeutuneita suolistossa mutta sitä nieltäväksi suurina määrinä hengissä mahassa vallitsevien olosuhteiden (happi, matala pH). Kuten edellä on mainittu, B. longum
subsp. infantis
kannat kuuluvat ensimmäiseen ryhmään bakteerien asuttavat suolisto imeväisten [26].
Toisin kuin B. longum
subsp. infantis
, B. adolescentis
laski lähes lineaarisesti aikana 7 h simulaatio. Ei ollut havaittavissa keskeytyksettä kun olosuhteet fermentorissa muuttunut. Kokeiden perusteella, että haponsietokyky seulonnan, tämä tulos oli odottamaton.
Tämä saattaa kuitenkin liittyä testausolosuhteista jossa sappi suola ja mahanesteen pitoisuudet pysyivät lähtötaso ja ei laimennettuna ne olisivat vivo
. Tulevaisuuden kokeessa, se on arvioitava onko laimennus kehittämä menetelmä Sumeri et ai
. [9] stabiloisivat solumäärät B. adolescentis
aikana 6 h simulaation aikana suolistossa.
Tutkimuksessamme me arvioitiin myös mahan-suolen läpikulun Lactobacillus gasseri
K7. Kanta on jo arvioitiin eloonjääminen in vivo
porsaista [14]. Näin ollen, oli mahdollista vertailla in vitro
tuloksia tietoja in vivo
kokeissa.
Bogovic et ai
. [14] syötetään porsaat aikana 14 päivää 5 * 10 10 pmy päivä -1 L. gasseri
K7. Tämä johti noin. 7 * 10 4 pmy g -1 ulosteeseen aikana ruokinta aikana. On otettava huomioon, että bakteeripitoisuutta laimennettiin ennen kuin se viimein saapui vatsassa-suoli kulkua. Vuonna karkeita arvioita, arvioimme, että noin 1% saapui kulkua. Tämä antoi meille mahdollisuuden vertailla tuloksia tämän porsas tutkimuksen lopussa meidän simulointi.
Kuten kuvassa 5, L. gasseri
K7 oli solupitoisuus noin 5 * 10 4 pmy ml -1 jälkeen 7 h simuloinnin aikana (ennalta kulttuuri 250 ml), joka on samanlainen kuin pitoisuus ulosteissa porsaiden. Tämä viittaa siihen, että simulointimalli tässä tutkimuksessa käytetyt voisi olla hyödyllinen väline arvioida vaikutuksia passage in vitro
mallia ennen kalliiden in vivo
malleissa. Mallia voitaisiin optimoida laimentamalla sappisuolojen ja haiman mehu kuten ovat kuvanneet Sumeri et al
. [9]. Simuloida aktivointi ja deaktivointi-entsyymien sopiva menetelmä on vielä löydetty.
Kun vain 100 ml väliainetta käytettiin siirrosteena L. gasseri
K7, kulttuurin selvisi simulointi parempi (kuvio 7). Volyymit oli aluksi samanlainen solujen määrä. Molemmat määrät inokuloitiin 1 ml. Siksi kulttuuri 250 ml tilavuus oli aikaisemmassa kasvuvaiheessa kuin 100 ml: n viljelmä. Nämä tulokset olivat osoitus kasvuvaiheen riippuvuutta kulttuurin stressin aikana.
Päätelmä
Tässä tutkimuksessa pystyimme osoittamaan, että järjestelmä simuloida mahan-suolen passage kehittämä Sumeri et al
. [9] oli sopiva arviointiin selviytymisen 8 Bifidobacterium
kantoja ja Lactobacillus gasseri
K7 vaikka emme simuloida poistamista mahanesteen ja sappihappojen. L. gasseri
K7 pystyimme vertailemaan tuloksia in vivo
tutkimuksen porsaiden ja saatu samanlaisia ​​tuloksia.
Yksireaktorijärjestelmällä esitetty täällä mahdollistaa suoraviivaisempi tunnistamisen ihanteellinen kasvuvaiheen mahdollisista probioottikanta joka on siirrettävä mahan-suoli passage kuin jos se oli tehtävä muiden järjestelmien kanssa vaikea setup.
tutkimus osoitti myös, että kaikilla testatuilla Bifidobacterium
kantoja, lukuun ottamatta B. animaliksella
subsp. lactis
, vaatisi suoja-aineet hengissä läpi mahalaukun-suolen suurina määrinä. Tämä voitaisiin tehdä käyttämällä sopivaa elintarvikkeiden matriisin tai kapselointia solut.
Menetelmät
Bakteerikannat
Kaikki bifidobakteerien kantojen valittiin kanta kokoelma Agroscope Liebefeld-Posieux ALP Research Station Sveitsi, eristettiin ALP kohteesta ihmisen lähteistä. Lactobacillus gasseri
K7 peräisin ZIM Collection of Industrial mikro-organismeja Ljubljanan yliopiston, biotekninen tiedekunta (ZIM 105) [10] ja myös talletetaan ALP rasitusta kokoelma. Testatut kannat ja niiden tunnistenumerot ALP kantakokoelmasta luetellaan taulukossa 3. Kaikki bifidobakteerien kannat ovat omaisuutta ALP.
Media ja kasvuolosuhteet
For esiviljelmiin, 1 ml jäädytettyjä säilykkeiden kannoista olivat ympättiin 250 ml: Wilkins-Chalgren liemi (WC CM0643, Oxoid, Hampshire, UK) täydennettynä 9 gl -1 ylimääräisiä laktoosimonohydraattia (bifidobakteerien) tai De Man-Rogosa-Sharpe (MRS; Biolife, Milano, Italia) keskipitkän (Lactobacillus gasseri
K7) [32]. L
. gasseri K7, kokeilu, jossa on 100 ml Esiviljelmää suoritettiin myös. Kaikki kannat, paitsi Bifidobacterium longum
subsp. infantis
, inkuboitiin 37 ° C: ssa 15 tunnin ajan anaerobisissa olosuhteissa. Bifidobacterium longum
subsp. infantis
inkuboitiin 12 tuntia, koska se oli erittäin herkkä laajennettu itämisaika. Pre-viljelmiä sentrifugoitiin 15 minuutin ajan 3500 rpm: ssä ja pelletit suspendoitiin uudelleen 10 ml: aan fosfaattipuskuroitua fysiologista natriumkloridiliuosta (PBS).
Määritys solumäärän
solujen määrä määritettiin 10-kertaiseksi sarjalaimennokselle kulttuurin fysiologista suolaliuosta. Kaksi korkeinta laimennosta maljattiin sitten MRS agar (Biolife, Milano, Italia) käyttäen spiraali plater (IUL Instruments, Barcelona, ​​Espanja) ja arvioi automaattisen pesäkelaskuri vastaavaan ohjelmisto (IUL Instruments, Barcelona, ​​Espanja).
seulonta haponkestävyyttä
varten haponkestoon seulomalla väkevää solususpensiota esi-viljelmä pipetoitiin 20 ml: aan PBS: ää, kunnes OD 650 1,0 oli saavutettu. 4 ml tätä solususpensiota siirrostettiin sitten 16 ml: aan sitraatti-HCl-puskuria (tri-Na-Citratex2 H 2O 7,35 g ja 250 ml: aan tislattua H 2O, joka on sovitettu vastaaviin pH-arvoon 1 M HCl: lla) pH: ssa 2,0, 2,5, 3,0, 3,5 ja 4,0. Inkubointi tapahtuu 37 ° C: ssa ja näytteitä otettiin 30 minuutin välein 120 minuutin ajan. 1 ml näytettä sekoitettiin 9 ml 0,25 M fosfaattipuskuria pH: ssa 7,0 ensimmäisessä vaiheessa laimennussarjassa. Sillä haponkestävyyskokeista on ruokamatriisiin, sama määrä valmiiksi kulttuurin käytettynä edellä (oikaistu OD 650 1,0) pipetoitiin 20 ml UHT kuorittua maitoa. 4 ml tätä solususpensiota maito- inokuloitiin 16 ml: aan sitraatti-HCl-puskuria. Kaikki kemikaalit hankittiin Merck (Darmstadt, Saksa). Tiedot seulontaan kokeita visualisoida ääriviivapiirrokset käyttäen Sigmaplot 11,0 ohjelmisto (Systat Software Inc., Chicago IL, USA).
Simulointi bioreaktorissa
Kaikki liuokset valmistettiin tuoreeltaan kutakin koetta. Simuloitu vatsa liuos valmistettiin 50 mg pepsiiniä sian mahalaukun limakalvon (Sigma-Aldrich P7012, Buchs, Sveitsi) 20 ml: ssa 0,1 M HCI: ää. Simuloidulle haimanesteessä 2 g pankreatiinia (Sigma-Aldrich P7545) liuotettiin 50 ml: aan 0,02 M fosfaattipuskuria, jonka pH on 7,5. Simuloitu sappisuola liuos valmistettiin 7,5 g naudan sapen (Sigma-Aldrich B3883) koostuu 50 ml: ksi tislatulla H 2O. Liemi simulointiin oli joko 1 l vessa tai MRS-liemessä kanssa 29.41 g tri-natrium citratex2 H 2O. Testauksen aikana hengissä elintarvikkeen matriisiin, 500 ml UHT rasvaton maito lisättiin ja pH säädettiin arvoon 3,0 5 M HCl: lla juuri ennen simulaatio. 1 l väliainetta lisättiin bioreaktoriin (NewMBR Mini, NewMBR, Sveitsi), joka oli aiemmin steriloitu vedellä (121 ° C, 20 min), ja kuumennettiin 37 ° C: ssa. Aikana vatsa simulaatio, ilmastus toteutettiin. Käyminen hallinnassa ja kirjattiin integroidun prosessien hallinnan ohjelmistoja Lucullus (Biospectra, Schlieren, Sveitsi). Väkevöity solususpensiota esi-viljelmä pipetoitiin 40 ml: aan PBS: ää OD 650 1,5. Vähän ennen istuttamalla 40 ml solususpensiota, 20 ml simuloitua mahan lisättiin väliaineeseen (1 l) bioreaktorissa. PH säädettiin käyttäen 2 M NaOH: lla.
Kuusikymmentä minuuttia inokulaation jälkeen solujen, happi korvattiin typellä, jolloin saadaan anaerobinen ilmakehässä.

• Riskinarviointi mahasyövän liittyy asbestoosi: tapaus report
• Bakteereja tappava toiminta kationisen steroidi CSA-13 ja cathelicidin peptidi LL-37 vastaan ​​helikobakteeri simuloidussa mahanesteessä