Evaluering af passagen af ​​Lactobacillus gasseri K7 og bifidobakterier fra maven til tarmene ved hjælp af en enkelt reaktor model

Evaluering af passagen af ​​Lactobacillus gasseri
K7 og bifidobakterier fra maven til tarmene ved hjælp af en enkelt reaktor model
Abstract
Baggrund
probiotiske bakterier menes at spille en vigtig rolle i fordøjelsessystemet og derfor har at overleve passage fra maven til tarmene. For nylig blev en hidtil ukendt fremgangsmåde til at simulere passage fra maven til tarmene i en enkelt bioreaktor udviklet. Fordelen ved denne automatiske ene reaktorsystem var evnen til at teste indflydelsen af ​​syre, galdesalte og pancreatin.
Lactobacillus gasseri
K7 er en stamme isoleret fra spædbarn fæces med egenskaber, der gør stammen interessant til osteproduktion. I denne undersøgelse blev en enkelt reaktor-system, der anvendes til at vurdere overlevelsen af ​​L. gasseri
K7 og udvalgte bifidobakterier fra vores samling gennem maven-tarm passage.
Resultater
Initial screening for syre resistens i syrnet kultur medier viste en lav tolerance af Bifidobacterium dentium
for denne tilstand indikerer lav overlevelse i passagen. Lignende resultater blev opnået med B. longum
subsp. infantis
hvorimod B. animalis
subsp. lactis
havde en høj overlevelsesprocent.
Disse indledende resultater blev bekræftet i bioreaktoren model af mave-tarm passage. B. animalis
subsp. lactis
havde den højeste overlevelsesrate (10%) at nå ca. 5 × 10 6 cfu ml -1 sammenlignet med de andre testede bifidobakterier stammer, som blev reduceret med en faktor på op til 10 6 . Lactobacillus gasseri
K7 var mindre modstandsdygtige end B. animalis
subsp. lactis
men overlevede ved cellekoncentrationer cirka 1000 gange højere end andre bifidobakterier.
Konklusion
I denne undersøgelse var vi i stand til at vise, at L. gasseri
K7 havde en høj overlevelsesprocent i mave- tarmen passage. Ved at sammenligne resultaterne med en tidligere undersøgelse hos smågrise kunne vi bekræfte pålideligheden af ​​vores simulering. Af de testede bifidobakterier stammer, kun B. animalis
subsp. lactis
viste acceptabel overlevelse for en vellykket passage i simuleringen systemet.
Baggrund
probiotika, især mælkesyrebakterier have gavnlige virkninger for forbrugerne sundhed som foreslået i 1907 [1]. Man mente, at bakterier hovedsageligt kontrolleres infektioner forårsaget af enteriske patogener og reguleret toxoaemia og derved forbedre sundheden og påvirke dødelighed. I mellemtiden har det været kendt, at nogle af de positive virkninger for forbrugerne sundhed er forbedringen i mikrofloraen balance i tarmen, stimulering af immunsystemet, og medvirken organismen til at bekæmpe patogene mikroorganismer [2]. En stor del af interesse blev koncentreret om anvendelsen af ​​stammer af slægterne Lactobacillus
og Bifidobacterium
, selv om der også findes andre bakterier med probiotiske virkninger, f.eks nogle propionibakterier.
Ovennævnte egenskaber er også grundlaget for en mikroorganisme, der skal mærkes probiotiske. Der er forskellige definitioner på verdensplan, men de er ens i indhold. Et af kriterierne for en probiotisk stamme er dets resistens over for surhed og gastriske løsninger i fordøjelsessystemet [3]. Det er derfor vigtigt, at evaluere modstandsdygtigheden af ​​en potentiel probiotisk stamme til den sure og gastrisk miljø i tarmen.
På grund af høje omkostninger og etiske samt sikkerhedsbestemmelser for kliniske studier, screening overlevelse er lettere at simulere in vitro
. En simpel test er at inkubere de bakterielle celler i sure eller galde saltopløsninger i en bestemt periode og tælle antallet af overlevende celler. I et yderligere trin, er simuleringen udføres i omrørte kolber, der kombinerer surhedsgrad og gastriske løsninger efterfulgt af en vurdering af overlevende celler over hele simulering. Dette er en mere realistisk replikation af betingelserne i tarmen [4]. Et andet system, det Simulator af Human Intestinal mikrobielle økosystem (Shime), består af 5 til 6 serieforbundne pH kontrollerede bioreaktorer [5-7]. Opsætningen er ganske kompliceret og kræver absolutte anaerobe forhold. Endvidere er absorptionen af ​​metabolitter og vand ikke simuleres. Dette blev overvundet ved anvendelse af dialysemembraner som beskrevet af Marteau et al
. [8].
Nylig et nyt system under anvendelse af en enkelt bioreaktor blev udviklet for at undersøge maven-tarm passage [9]. Systemet tillod pH skal ændres i en enkelt reaktor og blev tilpasset til retentionstiderne i de forskellige regioner af mave-tarm passage.
Lactobacillus gasseri
K7 blev for nylig isoleret fra spædbarn fæces [10]. Det producerer en bacteriocin, som er aktivt mod Clostridium
sp. og deres sporer. L. gasseri
tilhører den såkaldte "acidophilus" -gruppe og flere uafhængige undersøgelser identificeret disse stammer som indbyggerne i huden og tarmen [11-13]. I tidligere forsøg, er det allerede blevet vist in vitro Hoteller, som L. gasseri
K7 overlevede i et surt miljø og med 0,3% galdesalte [10]. Disse resultater gør stammen interessant som en mulig probiotisk.
I denne undersøgelse, en enkelt bioreaktor system baseret på arbejdet i Sumeri et al
. [9] blev anvendt til at evaluere overlevelsen af ​​Lactobacillus gasseri
K7 og otte Bifidobacterium
stammer fra vores kollektion. Vi var i stand til at sammenligne resultaterne for L. gasseri
K7 med en undersøgelse udført i smågrise [14], der tillod en vurdering af en korrelation mellem in vitro
studie med resultater fra in vivo
eksperimenter .
retentionstiderne og pH anvendt i denne undersøgelse var baseret på data fra litteraturen. Der findes flere metoder til måling af pH i tarmen [15]. Tabel 1 viser pH-værdierne i de forskellige dele af tarmen målt ved Heidelberg kapslen [16, 17]. Retentionstider kan beregnes enten ved hjælp af markørstoffer (kemiske) eller ved radio telemetri kapsler såsom Heidelberg
kapsel [18]. Men kapsler har normalt længere opholdstid end kemiske markører. Tabel 2 lister nogle af de retentionstider findes i litteraturen [4, 5, 19-24] .table 1 pH-værdier i den menneskelige tarmkanal, målt med Heidelberg
kapsel.

mave
tolvfingertarm
jejunum
ileum
proksimale
mediale
Distal
pH
1,4 **
6,22 *
6,4 **
7.1 **
7.4 **
* Fallingborg et al
. 1994 [16]
** Fallingborg et al
. 1998 [17]
Tabel 2 Retentionstider i tyndtarmen citeret i litteraturen.
Opholdstid
Kilde
Bemærkninger

1-4 h
Huang og Adams 2004 [21]
4,25 h
Van Den Driessche et al
. 2000 [24]
maven og tyndtarmen
4 timer
Mojaverian 1996 [22]
6 timer
Picot og Lacroix 2004 [4]
Valgte maksimale tid af simuleringen
7,5 h
Fallingborg et al
. 1990 [20]
Børn
8 h
Fallingborg et al
. 1989 [19]
8 timer
Ålander et al
. 1998 [5]
Simulering i Shime Reactor
6-10 h
Matthews et al
. 1991 [23]
Baseret på de data, der findes i litteraturen, og det arbejde, som Sumeri et al
. [9] gæringsprocessen blev oprettet som beskrevet i Materialer og Metoder og er vist i figur 1. Figur 1 Parametre i maven-tarm passage simulering over 7 t.
Resultater
Acid modstand screening
Formålet med en første række af tests var at få et overblik over den sure modstand otte bifidobakterier stammer. Figur 2, 3 og 4 viser overlevelsen af ​​disse stammer under anvendelse kontur plots lavet med Sigmaplot. Bifidobacterium dentium
(figur 3) viste den mindste syre modstand. Mellem pH 4,0 og pH 2,0 var der ingen forskel i overlevelse og koncentrationen af ​​celler faldt med mere end 7 log inden for 40 minutter. Bifidobacterium animalis
subsp. lactis
var mere modstandsdygtige op til 40 minutter ved pH 2,0, men derefter faldt med omkring 3 log, når de inkuberes i 120 minutter (figur 4). Ved en pH mellem 2,5 og 3,0 faldet var mindre end 1 log efter 120 minutter. Figur 2 Acid modstand på tre Bifidobacterium longum stammer. X-akse: tid (min); Y-akse: pH; log cfu er vist i farve (skala til højre på graferne). Tal i de bakterielle navne er stammen numre i FAM-database over ALP.
Figur 3 Acid modstand Bifidobacterium dentium, B. longum subsp. infantis og B. adolescentis. X-akse: tid (min); Y-akse: pH; log cfu er vist i farve (skala til højre på graferne). Tal i de bakterielle navne er stammen numre i FAM-database over ALP.
Figur 4 Acid modstand Bifidobacterium breve og B. animalis subsp. lactis. X-akse: tid (min); Y-akse: pH; log cfu er vist i farve (skala til højre på graferne). Tal i de bakterielle navne er stammen numre i FAM-database over ALP.
Alle de andre testede Bifidobacterium
stammer (B. longum, B. Breve, B. longum
subsp. Infantis og B. adolescentis
) viste en lignende, men forskellige mønster fra B. animalis
subsp. lactis
(figur 2, 3 og 4). De havde en kort overlevelsestid under pH 2,5 og overlevede i større antal over pH 3,5.
Med det formål at udvikle en metode til at simulere GI i bioreaktoren, var en yderligere test udført med en stamme. At observere indflydelse af en fødevare matrix, koncentreret B. longum
subsp. infantis
blev resuspenderet i skummetmælk før inokulering i sure opløsninger. Som vist i højre kolonne af figur 5, mælk havde en direkte virkning på overlevelsen af ​​stammen. Mellem pH 3,0 og 3,5 bakterierne overlevede i 120 minutter med en reduktion af log 2. Under pH 3,0 overlevelsesraten faldt til ca. log 5. Faldet i overlevelse under pH 3,0 var hurtig men regelmæssige over tid. Ved pH 3,5 og derover, stammen var resistent i mindst 120 minutter. Figur 5 Sammenligning af syreresistens af Bifidobacterium longum subsp. infantis 14390 suspenderet i NaCl eller skummetmælk. Venstre: bifidobakterier resuspenderes i NaCl, til højre: bifidobakterier resuspenderes i mælk. X-akse: tid (min); Y-akse: pH; log cfu er vist i farve (skala til højre på graferne). Tal i de bakterielle navne er stammen numre i FAM-database over ALP.
Den venstre kolonne af Figur 5 viser den samme stamme uden tilsat skummetmælk. Ved en pH-værdi over 3,5, der var ingen indflydelse på overlevelsen af ​​bakterierne. Men under pH 3,5 overlevelsen faldt afhængigt af varigheden af ​​inkubationen. Mellem pH 3,0 og 3,5 stammen allerede var faldet med ca. Log 5. Efter 30 minutters inkubation var der næsten en lineært fald i overlevelse med faldende pH fra 3,0 til 2,5.
Simulering i bioreaktoren
fleste systemer er beskrevet i litteraturen består af flere reaktionsbeholdere, f.eks Den Shime [6]. Andre undersøgelser anvendes immobiliserede celler med tre reaktorer [25] eller et dialysesystem [8]. På grundlag af arbejdet i Sumeri et al
. [9], og de indsamlede data fra forholdene i den intestinale passage var vi i stand til at begrænse simuleringen til et fartøj. Sammen med dataene fra syreresistensen screening, kunne udvælgelsen af ​​en mulig begyndende pH og bouillon sammensætning i simulatoren vælges. De resulterende simuleringsparametrene er vist i figur 1 og beskrevet i afsnittet Materialer og Fremgangsmåder. Under den eksperimentelle fase af denne undersøgelse, Sumeri et al
. [9] udviklet et lignende system til evaluering Lactobacillus
sp. i en mave-tarm passage simulering.
softwarepakke "Lucullus" var et fremragende redskab til at styre pH og fremgangsmåden ifølge den udviklede simulering. Valg af medium i bioreaktoren blev forenklet ved at vælge den tilsvarende vækstmedium for stammerne, suppleret med skummetmælk, der fungerer som en simuleret fødevare matrix. Derefter blev det syrnet til udgangs pH og suppleret med enzymopløsninger som beskrevet i Materialer og Metoder. Simuleringerne blev udført serielt, en om dagen. Resultaterne er vist i figur 6. De stammer, der anvendes til simulering, er anført i tabel 3 (kun Bifidobacterium dentium
blev udelukket) og blev standardiseret til en OD 650 på 1,5 forud for inokulering. Figur 6 Udvikling af 7 Bifidobacterium stammer under mave-tarm passage simulering for 7 timer. Stiplet linie viser tidspunktet for tilsætning af galdesalte og bugspyt. Tal i de bakterielle navne er stammen numre i FAM-database over ALP.
Tabel 3 Stammer testet i simuleringen.
Name
identifikationsnummer ALP stammen samling
Bifidobacterium adolescentis
FAM-14377
Bifidobacterium breve
FAM-14398
Bifidobacterium longum
subsp. infantis
FAM-14390
Bifidobacterium animalis
subsp. Lactis
FAM-14403
Bifidobacterium dentium
FAM-14396
Bifidobacterium longum
FAM-14382, -14.383, -14.406
Lactobacillus gasseri
K7
FAM-14459
Bifidobacterium adolescentis
blev podet som beskrevet ovenfor med en initial koncentration på 10 7 cfu ml -1 og faldt næsten lineært til under 10 4 cfu ml -1 efter 5 timer. B. breve
og B. longum
stammer havde en initial koncentration på mellem 10 7 og 10 8 cfu ml -1 og formindsket til under 10 2 cfu ml -1 inden for de første 30 minutter. B. animalis
subsp. lactis
14403 overlevet til ca. 15% af den oprindelige gennemsnitlige cfu 5 × 10 8 cfu ml -1. Der var et hurtigt fald i overlevelsen af ​​B. longum
subsp. infantis
over den første 30 min. Bagefter overlevelsen faldt kun langsomt fra 10 5 til 10 4 cfu ml -1.
I en senere fase, Lactobacillus gasseri
K7 blev inkluderet i undersøgelsen, da flere projekter kørte på dette tidspunkt på vores institut med denne stamme. Lactobacillus gasseri
K7 blev podet på 2,2 × 10 7 cfu ml -1 og efter 7 timer simulering en koncentration på 10 5 cfu ml -1 levende celler stadig var til stede i dyrkningsmedier (figur 7, kurve for 250 ml præ-kultur). Den højeste reduktion i overlevelse var inden for de første 2 timer og begyndte umiddelbart efter tilsætningen af ​​mavesaft og galdesalte. Inden for denne tid, var der en reduktion af levende celler ved log 2. Under resten af ​​simuleringen tid, der var kun en log 1 reduktion af levende celler. Figur 7 Sammenligning af indflydelsen af ​​100 ml præ-kultur af Lactobacillus gasseri K7 med 250 ml præ-kultur. Præ-kulturen blev høstet ved centrifugering og resuspenderet i fysiologisk natriumchloridopløsning til opnåelse af en OD600 på 1,5. Mave-tarm passage simulering blev inkuberet ved anvendelse af den justerede opløsning og inkuberet i 7 timer. Den stiplede linje viser tilsætning af galdesalte og bugspyt. Kurver er gennemsnittet af dobbelte eksperimenter.
Fremstillingen af ​​inokulum af L. gasseri
K7 i en 100 ml kulturvolumen blev også evalueret. Resultaterne af eksperimenterne er vist i figur 7. Med 250 ml kultur faldet i levende celler var omkring log 2 mens faldet med en 100 ml kultur kun blev log 1 over hele inkubationstiden. Men 2 timer efter tilsætning af galdesalte og bugspyt, faldet i celletal var ens for begge bind,.
Diskussion
Når man høster en kultur efter en given inkubationstid, kan vækstfase hver bakteriestamme være anderledes, da alle har forskellige vækstdynamikker. For at opnå celler på omtrent samme vækstfase, blev udført indledende forsøg (data ikke vist). En inkubationstid på 15 timer for den præ-kultur var egnet til alle testede stammer undtagen Bifidobacterium longum
subsp. infantis
som skulle inkuberes i kun 12 timer.
syretolerance screening (figurerne 2, 3 og 4) blev udført for at vurdere virkningen af ​​pH uafhængigt af andre betingelser. Bifidobacterium dentium
var meget følsomme over for syre og derfor ville muligvis ikke overleve passagen gennem maven. Stammen blev derfor ikke medtaget i simuleringen eksperimenter. B. longum
stammer (figur 2) ikke gav meget bedre resultater end B. dentium
(figur 3). Men tæt på pH 4 de var mere modstandsdygtige end B. dentium
.
B. longum
subsp. infantis
er en af ​​den første art til at udfylde den humane tarm kort efter fødslen [26]. Baseret på forsøg i denne undersøgelse imidlertid det testede B. longum
subsp. infantis
stamme ville kun være i stand til at passere spædbarnet maven i stort antal, hvis overgangstiden i det sure mave var meget kort. Overlevelsen af ​​den valgte stamme i den testede miljø var for lav for en vellykket passage i stort tal. Når stammen blev resuspenderet i skummetmælk, overlevelse steg (figur 5). Dette kunne være en indikation af, at modermælk hjælper B. longum
subsp. infantis
stammer til at passere mave-tarm passage med en højere overlevelsesrate.
Den beskyttende virkninger af mælkeproteiner i fordøjelsessystemet er allerede blevet beskrevet i litteraturen [27]. Beskyttelse med mælkeproteiner er også påvist i denne undersøgelse (figur 5). Med den passende matrix eller endda en bærer, kan probiotiske bakterier sikkert passere gennem maven til tarmene for at nå deres virkningssted.
B. adolescentis
stammer, der befolker den menneskelige tarm i en senere alder, havde lidt højere modstand end B. longum
subsp. infantis
hvilket kan forklare reduktionen af ​​sidstnævnte under forløbet af den menneskelige spædbarn til voksenalderen [26].
mest interessante stamme var B. animalis
subsp. lactis
, som var den mindst følsomme stamme i vores undersøgelse. Denne pH-resistent stamme har et stort potentiale til anvendelse i fødevarer som en probiotisk supplement, da et større antal bakterieceller ville overleve passagen. Imidlertid at anvende denne stamme som probiotikum, flere test skal udføres for at opnå den probiotiske status ifølge definitionen af ​​Klaenhammer [3].
I vores undersøgelse blev indtagelse af en fødevare matrix simuleret i en indledende miljø af syrnet mælk og vækstmedium. Den tilsatte simuleret gastrisk opløsning og oxygen under maven fase forøgede stress. Under den simulerede passage til tyndtarmen ilten blev erstattet med nitrogen, og mediet blev neutraliseret til pH 6,3. Tilsætningen af ​​pancreas opløsning og galdesalte afsluttet passage ind i tyndtarmen. Dette in vitro
systemet ikke tager hensyn til, at i in vivo
fordøjelse, er enzymer aktiveret og inaktiverede og andre stoffer, f.eks galdesalte reabsorberes. Sumeri et al
. [9] fundet en delvis løsning til at omgå dette problem. De fortyndede indholdet af reaktoren med en specielt designet fortynding medium. En anden mulighed ville være at udfælde galdesalte i slutningen af ​​simuleringen af ​​tyndtarmen at efterligne den enterohepatiske kredsløb. Dette kunne udføres med calciumioner [28-30]. Fjernelse af galdesyresalte vil bedre simulere miljøet af tyktarmen og måske endda give bifidobakterier at proliferere.
I vores undersøgelse, de resterende galdesalte og bugspyt i simuleringen ført til en yderligere belastning af bakterier, som sandsynligvis ændret de faktiske egenskaber af stammerne in vivo
.
start cfu i simuleringen varieres inden en log cfu selvom justering af OD 650 af inoculum tidligere testet med Bifidobacterium animalis
subsp. lactis
og Bifidobacterium longum
subsp. infantis
stammer. De bifidobakterier anvendt i denne undersøgelse viste en tendens til at danne klynger, som kan resultere i reduceret cfu (visuelle observationer, data ikke vist). I en anden undersøgelse kunne dannelsen af ​​klynger være relateret til faldende pH under vækst [31]. Disse klynger er normalt regnes som en koloni på en plade.
Figur 6 viser resultaterne af maven-tarm passage simulering over 7 timer på syv testede Bifidobacterium
stammer. Koncentrationen af ​​levende celler af bifidobakterier faldt straks efter inkubation grund af den lave pH (pH 3,0). Imidlertid B. animalis
subsp. lactis
forblev stabil. Dette bekræftede resultaterne af tidligere forsøg beskrevet ovenfor (figur 4). Denne modstand kan udvides til galdesalte og bugspyt selvom celletal af B. animalis
subsp. lactis
faldt med omkring 85% af den oprindelige værdi (figur 6). Sammenlignet med de andre stammer anvendt i denne undersøgelse, men dette fald var næsten ubetydelig.
All B. longum
og B. Breve
stammer døde meget hurtigt i begyndelsen af ​​simuleringen og var under detektionsgrænsen grænse for pletteringsfremgangsmåde indenfor få timer (figur 6), som kunne forventes ud fra resultaterne af screeningen eksperimentet ovenfor (figur 2 og 4). Salg på den anden side, B. longum
subsp. infantis
14390 faldt hurtigt i begyndelsen af ​​simuleringen, men efter tilsætning af bugspyt og galdesalte og en ændring til et anaerobt miljø, faldt den reduktion. Vores undersøgelse tyder på, at denne stamme er godt tilpasset til forholdene i tarmen, men skal indtages i stort tal til at overleve betingelserne i maven (oxygen, lav pH). Som nævnt ovenfor, B. longum
subsp. infantis
stammer hører til den første gruppe af bakterier befolker tarmen af ​​spædbørn [26].
I modsætning til B. longum
subsp. infantis
, B. adolescentis
faldt næsten lineært i løbet af 7 timer simulering. Der var ingen påviselig afbrydelse når betingelserne i fermentoren ændret. Baseret på de eksperimenter for syretolerance screening, dette resultat var uventet.
Men dette kan være relateret til de testbetingelser, hvor galdesaltet og mavesaft koncentrationer forblev på udgangsniveauet og blev ikke fortyndet som de ville være i vivo
. I en kommende eksperiment, skal det vurderes, om den fortynding metode udviklet af Sumeri et al
. [9] vil stabilisere celletal af B. adolescentis
under 6 timer simulation periode i tarmen.
I vores undersøgelse har vi evalueret også maven-tarm passage af Lactobacillus gasseri
K7. Stammen er allerede blevet bedømt for overlevelse in vivo
hos smågrise [14]. Derfor var det muligt at sammenligne vores in-vitro
resultater med data fra in vivo
eksperimenter.
Bogovic et al
. [14] fodret grise over en periode på 14 dage med 5 * 10 10 cfu dag -1 L. gasseri
K7. Dette resulterede i ca.. 7 * 10 4 cfu g -1 i fæces i løbet af fodring periode. Det skal tages i betragtning, at koncentrationen af ​​bakterier blev fortyndet, før den endelig kommet på maven-tarm passage. I en grov tilnærmelse, anslås det, at ca. 1% ankom til passagen. Dette tillod os at sammenligne resultaterne af denne pattegris undersøgelse med enden af ​​vores simulering.
Som vist i figur 5, L. gasseri
K7 havde en cellekoncentration på ca. 5 * 10 4 cfu ml -1 efter 7 timer simuleringsperioden (med en forkultur af 250 ml), som svarer til koncentrationen i afføringen fra smågrisene. Dette antyder, at simuleringsmodellen anvendt i denne undersøgelse kunne være et nyttigt værktøj til at vurdere virkningerne af passagen i en in-vitro
model før brug af dyre in vivo
modeller. Modellen kunne optimeres yderligere ved at fortynde de galdesalte og bugspyt som beskrevet af Sumeri et al
. [9]. At simulere aktivering og deaktivering af enzymerne en egnet fremgangsmåde er endnu ikke fundet.
Når kun 100 ml medium blev anvendt til inokulum af L. gasseri
K7, kulturen overlevede simuleringen bedre (figur 7). Begge bind havde en lignende indledende celletal. Begge mængder blev podet med 1 ml. Derfor er kulturen med 250 ml volumen var i en tidligere fase af vækst end 100 ml kultur. Disse resultater var en indikation af vækstfasen afhængighed af kulturen for under stress.
Konklusion
I denne undersøgelse var vi i stand til at vise, at systemet til at simulere maven-tarm passage udviklet af Sumeri et al
. [9] var egnet til at vurdere overlevelsen af ​​8 Bifidobacterium
stammer og Lactobacillus gasseri
K7, selvom vi ikke simulere fjernelsen af ​​mavesyre og galdesalte. For L. gasseri
K7 var vi i stand til at sammenligne resultaterne med en in vivo
undersøgelse om smågrise og opnåede lignende resultater.
Enkelt reaktor-system præsenteres her giver mulighed for en mere ligetil identifikation af den ideelle vækstfase for eventuelle probiotisk stamme, der er nødvendig for at passere mave-tarm passage, end hvis det skulle udføres med andre systemer med en vanskelig opsætning.
undersøgelsen viste også, at alle testede Bifidobacterium
stammer, bortset fra B. animalis
subsp. lactis
, ville kræve beskyttende midler til at overleve passagen gennem maven-tarmen i stort tal. Dette kunne gøres ved hjælp af en passende mad matrix eller indkapsling af cellerne.
Metoder
Bakteriestammer
Alle bifidobakterier stammer blev udvalgt fra stammen samling af Agroscope Liebefeld-Posieux ALP Research Station Schweiz, isoleret af ALP fra humane kilder. Lactobacillus gasseri
K7 stammede fra ZIM Indsamling af industrielle mikroorganismer af University of Ljubljana, biotekniske Fakultet (ZIM 105) [10] og blev også deponeret i ALP stammen kollektion. De testede stammer og deres identifikationsnumre for ALP stammen samling er angivet i tabel 3. Alle bifidobakterier stammer tilhører ALP.
Medier og vækstbetingelser
For pre-kulturer, 1 ml frosne konserves af stammerne var podet i 250 ml Wilkins-Chalgren bouillon (WC CM0643, Oxoid, Hampshire, UK) suppleret med 9 gl -1 ekstra laktose-monohydrat (bifidobakterier) eller De Man-Rogosa-Sharpe (MRS, Biolife, Milano, Italien) medium (Lactobacillus gasseri
K7) [32]. For L
. gasseri K7, et forsøg med en 100 ml forkultur blev også udført. Alle stammer undtagen Bifidobacterium longum
subsp. infantis
, blev inkuberet ved 37 ° C i 15 timer under anaerobe forhold. Bifidobacterium longum
subsp. infantis
blev inkuberet i 12 timer, da det var meget følsomme over for forlængede inkubationsperioder. De præ-kulturer blev centrifugeret i 15 minutter ved 3500 rpm, og pellets resuspenderes i 10 ml phosphatpufret fysiologisk natriumchloridopløsning (PBS).
Bestemmelse af celletal
celletallet blev bestemt ved 10 gange seriel fortynding af kulturen i fysiologisk saltvandsopløsning. De to højeste fortyndinger blev derefter belagt på MRS-agar (Biolife, Milano, Italien) ved hjælp af en spiral plater (IUL Instruments, Barcelona, ​​Spanien) og evalueret af en automatiseret koloni tæller med den tilsvarende software (IUL Instruments, Barcelona, ​​Spanien).
screening for syreresistens Hus til syreresistensen screening den koncentrerede cellesuspension fra præ-kulturen blev pipetteret over i 20 ml PBS indtil en OD 650 på 1,0 blev nået. 4 ml af denne cellesuspension blev derefter inokuleret i 16 ml citrat-HCI-buffer (tri-Na-Citratex2 H 2O 7,35 g og 250 ml destilleret H 2O, tilpasset til den tilsvarende pH med 1 M HCI) ved pH-værdier på 2,0, 2,5, 3,0, 3,5 og 4,0. Inkubationen blev udført ved 37 ° C, og prøver blev udtaget hver 30. minut i løbet af 120 min. 1 ml prøver blev blandet med 9 ml 0,25 M phosphatpuffer ved pH 7,0 i det første trin af fortyndingsrækken. For syreresistensprøven i en fødevare matrix, den samme mængde af for-kultur som anvendt ovenfor (justeret til en OD 650 på 1,0) blev pipetteret i 20 ml UHT skummetmælk. 4 ml af denne cellesuspension i mælk blev inokuleret i 16 ml citrat-HCI-buffer. Alle kemikalier blev indkøbt fra Merck (Darmstadt, Tyskland). Al data for screening eksperimenter blev visualiseret i kontur plots bruger Sigmaplot 11.0 software (Systat Software Inc., Chicago IL, USA).
Simulering i bioreaktoren
Alle løsninger blev frisklavet for hvert forsøg. Simuleret mave opløsning blev fremstillet af 50 mg pepsin porcin gastrisk mucosa (Sigma-Aldrich P7012, Buchs, Schweiz) i 20 ml 0,1 M HCI. For det simulerede bugspyt 2 g pancreatin (Sigma-Aldrich P7545) blev opløst i 50 ml 0,02 M phosphatpuffer ved et pH på 7,5. Simuleret galdesalt blev fremstillet af 7,5 g bovin galde (Sigma-Aldrich B3883) fyldt op til 50 ml med destilleret H 2O. Bouillon til simulering var enten 1 l WC eller MRS bouillon med 29,41 g tri-natrium citratex2 H 2O. Under testen af ​​overlevelse i en fødevare matrix, 500 ml UHT skummetmælk blev tilsat, og pH justeret til 3,0 med 5 M HCI kort før simuleringen. 1 l medium blev tilsat til bioreaktoren (NewMBR Mini, NewMBR, Schweiz), der tidligere er steriliseret med vand (121 ° C, 20 min), og opvarmet til 37 ° C. Under maven simuleringen blev beluftning implementeret. Gæringen blev kontrolleret og registreret ved hjælp af den integrerede proces management software Lucullus (Biospectra, Schlieren, Schweiz). Den koncentrerede cellesuspension fra præ-kulturen blev pipetteret i 40 ml PBS til en OD 650 på 1,5. Kort før inokulering af 40 ml cellesuspension blev 20 ml af den simulerede maven opløsning tilsat til mediet (1 l) i bioreaktoren. PH blev indstillet ved anvendelse af 2 M NaOH.
Tres minutter efter inokulering af cellerne blev oxygen erstattet med nitrogen til opnåelse af en anaerob atmosfære.

• Risikovurdering af mavekræft er forbundet med asbestose: en case-rapport
• Baktericide aktiviteter af den kationiske steroid CSA-13 og cathelicidin peptid LL-37 over for Helicobacter pylori i simulerede gastriske juice