Evaluación del paso de Lactobacillus gasseri K7 y bifidobacterias desde el estómago a los intestinos utilizando un solo reactor de Evaluación model

del paso de Lactobacillus gasseri
K7 y bifidobacterias del estómago al intestino usando un modelo único reactor
Abstract
Antecedentes
las bacterias probióticas se cree que desempeñan un papel importante en el sistema digestivo y por lo tanto tiene que sobrevivir al paso del estómago a los intestinos. Recientemente, se desarrolló un enfoque novedoso para simular el paso del estómago a los intestinos en un único biorreactor. La ventaja de este sistema de reactor automatizado fue la habilidad de evaluar la influencia de ácidos, sales biliares y pancreatina.
Lactobacillus gasseri
K7 es una cepa aislada de las heces infantiles con propiedades haciendo la cepa interesante para la producción de queso. En este estudio, se utilizó un único sistema de reactor para evaluar la supervivencia de L. gasseri
K7 y bifidobacterias seleccionado de nuestra colección a través del paso de estómago-intestino.
Resultados
La selección inicial para la resistencia al ácido en cultivo se acidifica medios mostró una baja tolerancia de Bifidobacterium dentium
para esta condición indica una baja supervivencia en el pasaje. Resultados similares se obtuvieron con B. longum
subsp. infantis
mientras que B. animalis subsp
. lactis
tenía una elevada supervivencia.
Estos primeros resultados fueron confirmados en el modelo bio-reactor del paso del estómago-intestino. B. animalis subsp
. lactis
tenía la tasa de supervivencia más alta (10%) la consecución de aproximadamente 5 × 10 6 ufc ml -1 en comparación con las otras cepas de bifidobacterias probados que se redujeron en un factor de hasta 10 6 . Lactobacillus gasseri
K7 era menos resistentes que B. animalis subsp
. lactis
pero sobrevivió a concentraciones celulares de aproximadamente 1000 veces más altas que otras bifidobacterias.
Conclusión
En este estudio, hemos sido capaces de demostrar que L. gasseri
K7 tenía una alta tasa de supervivencia en el estómago- paso intestino. Al comparar los resultados con un estudio previo en lechones podríamos confirmar la fiabilidad de nuestra simulación. De las cepas de bifidobacterias ensayados, solamente B. animalis subsp
. lactis
mostró una supervivencia aceptable para un exitoso paso en el sistema de simulación.
Antecedentes
probióticos, las bacterias del ácido láctico en especial tiene efectos beneficiosos sobre la salud de los consumidores como se sugirió en 1907 [1]. Se creía que las bacterias infecciones causadas por patógenos entéricos y toxoaemia regulado, lo que mejora la salud y que influyen en la mortalidad controladas principalmente. Mientras tanto se ha sabido que algunos de los efectos positivos sobre la salud de los consumidores son la mejora en el equilibrio de la microflora en el intestino, la estimulación del sistema inmune, y ayudar al organismo para luchar contra microorganismos patógenos [2]. Una gran parte del interés se concentró en el uso de cepas de los géneros Lactobacillus y Bifidobacterium

, aunque también hay otras bacterias con efectos probióticos, por ejemplo, algunos propionibacteria.
Las propiedades anteriormente mencionadas son también la base de un microorganismo para ser etiquetado probiótico. Existen diferentes definiciones de todo el mundo, pero son similares en su contenido. Uno de los criterios para una cepa probiótica es su resistencia a la acidez y soluciones gástricas en el tracto gastrointestinal humano [3]. Por tanto, es importante, para evaluar la resistencia de un potencial cepa probiótica para el medio ácido gástrico y en el intestino.
Debido a los altos costes y éticas, así como normas de seguridad para los estudios clínicos, la detección de supervivencia es más fácil para simular in vitro
. Una prueba simple es incubar las células bacterianas en soluciones de sales ácidas o biliares durante un periodo definido y contar el número de células supervivientes. En una etapa adicional, la simulación se lleva a cabo en matraces agitados, la combinación de acidez y soluciones gástricas seguido de una estimación de las células supervivientes sobre toda la simulación. Esta es una replicación más realista de las condiciones en el intestino [4]. Otro sistema, el simulador del ecosistema humano microbiana intestinal (SHIME), consta de 5 a 6 pH controlado biorreactores conectados en serie [5-7]. La configuración es bastante complejo y exige condiciones anaerobias. Además, la absorción de metabolitos y el agua no se simula. Esto se superó mediante el uso de membranas de diálisis como se describe por Marteau et al
. [8].
Recientemente, se desarrolló un nuevo sistema utilizando un único biorreactor para estudiar el paso del estómago-intestino [9]. El sistema permitió que el pH sea alterado dentro de un único reactor y se ha adaptado a los tiempos de retención en las diferentes regiones del pasaje del estómago-intestino.
Lactobacillus gasseri
K7 ha sido recientemente aislado de heces infantiles [10]. Se produce una bacteriocina que es activo contra Clostridium sp
. y sus esporas. L. gasseri
pertenece a la llamada -group "acidophilus" y varios estudios independientes identificados estas cepas como habitantes de la piel y el intestino [11-13]. En experimentos anteriores, ya se ha demostrado in vitro que
L. gasseri
K7 sobrevivió en un ambiente ácido y con 0,3% de sales biliares [10]. Estos resultados hacen que la cepa interesante como posible probiótico.
En este estudio, un sistema de biorreactor único, basado en la obra de Sumeri et al
. [9] se utilizó para evaluar la supervivencia de Lactobacillus gasseri
K7 y Bifidobacterium
ocho cepas de nuestra colección. Hemos sido capaces de comparar los resultados de L. gasseri
K7 con un estudio realizado en lechones [14], que permitió la evaluación de una correlación entre el estudio in vitro
con los resultados de in-vivo
experimentos .
los tiempos de retención y pH utilizados en este estudio se basaron en datos de la literatura. Existen varios métodos para medir el pH en el intestino [15]. Tabla 1 muestra los valores de pH en las diferentes partes del intestino, medida por la cápsula Heidelberg [16, 17]. Los tiempos de retención se pueden calcular ya sea mediante el uso de sustancias marcadoras (químicos) o por cápsulas de radio telemetría como el Heidelberg
cápsula [18]. Sin embargo, las cápsulas generalmente tienen tiempos de retención más largos que los marcadores químicos. La tabla 2 enumera algunos de los tiempos de retención que se encuentran en la literatura [4, 5, 19-24] .Tabla 1 valores de pH en el tracto intestinal humano, medido con el de Heidelberg
cápsula.

estómago
Duodeno Yeyuno

íleon proximal


distal medial
pH 1,4
** 6,22 *

6.4 ** 7.1 **

7.4 ** *
Fallingborg et al
. 1994 [16]
** Fallingborg et al
. 1998 [17] sobre Table 2 tiempos de retención en el intestino delgado citado en la literatura.
Tiempo Retención
Fuente
Observaciones

1-4 h
Huang y Adams 2004 [21]
4.25 h de Van Den Driessche et al
. 2000 [24]
estómago y el intestino delgado página 4 h
Mojaverian 1996 [22] página 6 h
Picot y Lacroix 2004 [4]
seleccionada Tiempo máximo de la simulación
7,5 h
Fallingborg et al
. 1990 [20]
niños
8 h
Fallingborg et al
. 1989 [19] página 8 h
Alander et al
. 1998 [5]
Simulación en el reactor SHIME
6-10 h
Thews et al
. 1991 [23] basado en
en los datos encontrados en la literatura y el trabajo por Sumeri et al
. [9], el proceso de fermentación se creó como se describe en Materiales y Métodos y se muestra en la Figura 1. Figura 1 Parámetros de la simulación paso-intestinal del estómago más de 7 h.
Resultados
Resistencia a los ácidos Francia El cribado objetivo de una primera serie de pruebas era obtener una visión general de la resistencia a los ácidos de ocho cepas de bifidobacterias. Las figuras 2, 3 y 4 muestran la supervivencia de estas cepas utilizando gráficos de contorno hechos con Sigmaplot. Bifidobacterium dentium gratis (Figura 3) mostró la menor resistencia ácido. Entre pH 4,0 y pH 2,0 no hubo diferencia en la supervivencia y la concentración de las células se redujo en más de 7 log en 40 minutos. Bifidobacterium animalis subsp
. lactis
era más resistente hasta 40 min a pH 2,0, pero luego disminuyó en aproximadamente 3 log cuando se incuba durante 120 minutos (Figura 4). A un pH entre 2,5 y 3,0 la disminución fue menos de 1 log después de 120 minutos. Figura 2 Resistencia a los ácidos de tres cepas de Bifidobacterium longum. Eje X: tiempo (min); Eje Y: pH; log ufc se muestran en el color (escala a la derecha de los gráficos). Los números en los nombres bacterianas son las cifras de tensión en la base de datos de la FAM-ALP.
Figura 3 Resistencia a los ácidos de Bifidobacterium dentium, B. longum subsp. infantis y B. adolescentis. Eje X: tiempo (min); Eje Y: pH; log ufc se muestran en el color (escala a la derecha de los gráficos). Los números en los nombres bacterianas son las cifras de tensión en la base de datos de la FAM-ALP.
Figura 4 Resistencia a los ácidos de Bifidobacterium breve y B. animalis subsp. lactis. Eje X: tiempo (min); Eje Y: pH; log ufc se muestran en el color (escala a la derecha de los gráficos). Los números en los nombres bacterianas son las cifras de tensión en la base de datos de la FAM-ALP. MyBestPlay Todos los demás Bifidobacterium
cepas analizadas (B. longum, B. breve, B. longum
subsp. Infantis y B. adolescentis
) mostraron un patrón similar pero diferente de B. animalis subsp
. lactis
(Figuras 2, 3 y 4). Tenían un corto tiempo de supervivencia por debajo de pH 2,5 y sobrevivieron en mayor número por encima de pH 3,5. Vaya con el objetivo de desarrollar un método para simular el GI en el biorreactor, un nuevo ensayo fue realizado con una cepa. Para observar la influencia de una matriz alimentaria, se concentró B. longum
subsp. infantis
se resuspendió en leche descremada antes de inocular en soluciones ácidas. Como se muestra en la columna de la derecha de la figura 5, la leche tiene un efecto directo sobre la supervivencia de la cepa. Entre pH 3,0 y 3,5 a las bacterias sobrevivido durante 120 min con una reducción de log 2. Por debajo de pH 3,0 el índice de supervivencia disminuyó a aproximadamente log 5. La disminución de la supervivencia por debajo de pH 3,0 fue rápida pero regular en el tiempo. A pH 3,5 y por encima de, la cepa era resistente durante al menos 120 minutos. Figura 5 Comparación de la resistencia a los ácidos de Bifidobacterium longum subsp. infantis 14390 suspendido en NaCl o leche descremada. Izquierda: Las bifidobacterias se resuspendieron en NaCl, a la derecha: Las bifidobacterias resuspendió en leche. Eje X: tiempo (min); Eje Y: pH; log ufc se muestran en el color (escala a la derecha de los gráficos). Los números en los nombres bacterianos son los números de tensión en la base de datos de FAM-ALP. México La columna de la izquierda de la figura 5 muestra la misma cepa sin leche descremada añadido. A un pH por encima de 3,5, no hubo influencia sobre la supervivencia de las bacterias. Sin embargo, por debajo de pH 3,5 la disminución de la supervivencia en función de la duración de la incubación. Entre pH 3.0 y 3.5 de la cepa ya había disminuido en un log 5. Después de 30 minutos de incubación, no había casi una disminución lineal en la supervivencia con la disminución de pH de 3,0 a 2,5.
Simulación en el biorreactor
mayoría de los sistemas descritos en la literatura consiste en varios recipientes de reacción, por ejemplo, la SHIME [6]. Otros estudios utilizaron células inmovilizadas con tres reactores [25] o un sistema de diálisis [8]. Basado en el trabajo de Sumeri et al
. [9] y los datos recogidos de las condiciones en el tránsito intestinal que fueron capaces de limitar la simulación a un buque. Junto con los datos de la proyección resistencia a los ácidos, la selección de una posible composición de pH y el caldo de partida en el simulador podría ser elegido. Los parámetros de simulación resultantes se muestran en la Figura 1 y se describen en la sección de Material y Métodos. Durante la fase experimental de este estudio, Sumeri et al
. [9] desarrollado un sistema similar para evaluar Lactobacillus
sp. en una simulación paso estómago-intestino.
El paquete de software "Lucullus" era una excelente herramienta para controlar el pH y el procedimiento de acuerdo con la simulación desarrollado. Selección del medio en el biorreactor se ha simplificado mediante la elección del medio de crecimiento correspondiente para las cepas, suplementado con leche desnatada, que funciona como una matriz alimentaria simulado. Después, se acidificó a pH de partida y suplementado con soluciones de enzima como se describe en Materiales y Métodos. Las simulaciones se llevaron a cabo en serie, una por día. Los resultados se muestran en la Figura 6. Las cepas utilizadas para la simulación se muestran en la Tabla 3 (sólo Bifidobacterium dentium
fue excluido) y se estandarizaron a una OD 650 de 1,5 antes de la inoculación. Figura 6 Desarrollo de 7 cepas de Bifidobacterium durante la simulación paso-intestinal del estómago durante 7 h. La línea de puntos muestra el momento de la adición de sales biliares y el jugo pancreático. Los números en los nombres bacterianas son las cifras de tensión en la base de datos de la FAM-ALP.
Tabla 3 cepas probadas en la simulación.
Nombre
Número de identificación de colección de cepas ALP
Bifidobacterium adolescentis
FAM-14377
Bifidobacterium breve
FAM-14398
Bifidobacterium longum
subsp. infantis
FAM-14390
Bifidobacterium animalis subsp
. Lactis
FAM-14403
Bifidobacterium dentium
FAM-14396
Bifidobacterium longum
FAM-14382, -14383, -14406
Lactobacillus gasseri
K7
FAM-14459
Bifidobacterium adolescentis
se inoculó como se describió anteriormente a una concentración inicial de 10 7 ufc ml -1 y una disminución casi lineal hasta por debajo de 10 4 ufc ml -1 después de 5 horas. B. breve y B. longum

cepas tenían una concentración inicial de 10 7 y 10 8 ufc ml -1 y disminuido a menos del 10 2 ufc ml -1 dentro de los primeros 30 minutos. B. animalis subsp
. lactis
14403 sobrevivieron a aproximadamente el 15% de la UFC promedio inicial de 5 x 10 8 ufc ml -1. Hubo una rápida disminución de la supervivencia de B. longum
subsp. infantis
sobre el primero 30 min. Posteriormente, la supervivencia disminuyó lentamente de 10 5 a 10 4 ufc ml -1.
En una fase posterior, Lactobacillus gasseri
K7 se incluyó en el estudio, ya que varios proyectos se ejecutan en este momento en nuestro instituto con esta cepa. Lactobacillus gasseri
K7 se inoculó en el 2,2 × 10 7 ufc ml -1 y después de 7 h simulación de una concentración de 10 células vivas 5 ufc ml -1 todavía estaba presente en el medios de cultivo (Figura 7, la curva de 250 ml pre-cultivo). La mayor reducción en la supervivencia estaba dentro de las primeras 2 horas y comenzó inmediatamente después de la adición de sales biliares y de jugo gástrico. Dentro de este tiempo, hubo una reducción de las células de registro 2. vida durante el resto del tiempo de simulación, sólo había una reducción logarítmica 1 de las células vivas. Figura 7 Comparación de la influencia de 100 ml pre-cultivo de Lactobacillus gasseri K7 con 250 ml de precultivo. El pre-cultivo se recogió mediante centrifugación y se resuspendió en solución fisiológica de cloruro de sodio para alcanzar una DO600 de 1,5. La simulación paso-estómago intestinal se incubó con la solución ajustado y se incubó durante 7 h. La línea discontinua muestra la adición de sales biliares y el jugo pancreático. Las curvas son la media de experimentos por duplicado.
La preparación del inóculo de L. gasseri
K7 en un volumen de cultivo de 100 ml también se evaluó. Los resultados de los experimentos se muestran en la Figura 7. Con 250 ml de cultivo de la disminución en las células vivas era aproximadamente log 2 mientras que la disminución con un cultivo de 100 ml, sólo se ingrese 1 en todo el tiempo de incubación. Sin embargo, 2 h después de la adición de sales biliares y el jugo pancreático, la disminución en el recuento de células fue similar para ambos volúmenes.
Discusión
Cuando la cosecha de un cultivo después de un tiempo de incubación dado, la fase de crecimiento de cada cepa bacteriana puede ser diferente, ya que todos tienen diferentes dinámicas de crecimiento. Con el fin de obtener células aproximadamente a la misma fase de crecimiento, se realizaron experimentos preliminares (datos no presentados). Un tiempo de incubación de 15 h para el precultivo era adecuado para todas las cepas ensayadas excepto Bifidobacterium longum
subsp. infantis
que debía ser incubado por sólo 12 h. México La tolerancia al ácido cribado (Figuras 2, 3 y 4) se realizó para evaluar el efecto del pH independientemente de otras condiciones. Bifidobacterium dentium
era muy sensible a ácido y por lo tanto posiblemente no podría sobrevivir el paso a través del estómago. La cepa por lo tanto no se incluyó en los experimentos de simulación. El B. longum
cepas (Figura 2) no dió resultados mucho mejores que B. dentium gratis (Figura 3). Sin embargo, cerca de pH 4 que eran más resistentes que B. dentium
.
B. longum
subsp. infantis
es una de las primeras especies que pueblan el intestino humano poco después del nacimiento [26]. Sobre la base de los experimentos en este estudio, sin embargo, el B. longum
subsp ensayar. infantis
cepa sólo sería capaz de pasar el estómago infantil en un número elevado si el tiempo de transición en el estómago ácido fue muy corto. La supervivencia de la cepa seleccionada en el entorno de la prueba era demasiado bajo para el paso con éxito en grandes cantidades. Cuando la cepa se resuspendió en leche descremada, supervivencia aumentó (Figura 5). Esto podría ser una indicación de que la leche materna ayuda a B. longum
subsp. infantis
cepas para pasar el paso estómago-intestino con a una tasa de supervivencia más alta.
Los efectos protectores de las proteínas de leche en el sistema digestivo ya han sido descritos en la literatura [27]. Protección con proteínas de la leche también se ha demostrado en este estudio (Figura 5). Con la matriz apropiada o incluso un portador, las bacterias probióticas pueden pasar con seguridad a través del estómago a los intestinos para alcanzar su sitio de acción.
B. adolescentis
cepas que pueblan el intestino humano a una edad posterior, tenían resistencia ligeramente mayor que B. longum
subsp. infantis
lo que puede explicar la reducción de este último durante el progreso del bebé humano a la edad adulta [26]. México La cepa más interesante fue B. animalis subsp
. lactis
, que era la cepa menos sensibles en nuestro estudio. Esta cepa resistente a pH tiene un gran potencial para su uso en alimentos como un suplemento probiótico ya que un mayor número de células bacterianas que sobrevivir al paso. Sin embargo, para utilizar esta cepa como probiótico, más estudios tienen que ser realizado con el fin de lograr el estado probiótico de acuerdo con la definición de Klaenhammer [3].
En nuestro estudio, la ingestión de una matriz alimentaria se simuló en un inicial entorno de leche acidificada y medio de crecimiento. La solución gástrico simulado añadido y oxígeno durante la fase de estómago aumentaron el estrés. Durante el paso simulado para el intestino delgado el oxígeno fue reemplazado por nitrógeno y el medio se neutralizó a pH 6,3. La adición de las sales biliares y pancreáticas solución completado el paso hacia el intestino delgado. Este vitro en-
sistema no tiene en cuenta que en la digestión in vivo
, las enzimas se activan y sustancias inactivas y otros, por ejemplo, sales biliares se reabsorben. Sumeri et al
. [9] encontrado una solución parcial para eludir este problema. Se diluyeron los contenidos del reactor con un medio de dilución especialmente diseñado. Otra posibilidad sería la de precipitar las sales biliares en el extremo de la simulación del intestino delgado de imitar el circuito enterohepático. Esto podría llevarse a cabo con iones de calcio [28-30]. La eliminación de las sales biliares simularía mejor el entorno del colon e incluso podría permitir que las bifidobacterias a proliferar.
En nuestro estudio, las sales biliares restantes y el jugo pancreático en la simulación llevado a una tensión adicional sobre las bacterias que probablemente alteró las verdaderas características de las cepas in vivo
. comentario el ufc a partir de la simulación variar dentro de un log ufc a pesar de que el ajuste de OD 650 del inóculo fue probado previamente con las Bifidobacterium animalis subsp
. lactis y Bifidobacterium longum

subsp. infantis
cepas. Las bifidobacterias utilizadas en este estudio mostraron una tendencia a formar conglomerados que pueden resultar en la reducción de CFU (observaciones visuales, datos no mostrados). En otro estudio, la formación de grupos podría estar relacionado con la disminución del pH durante el crecimiento [31]. Estos grupos son por lo general cuentan como una sola colonia en una placa.
Figura 6 muestra los resultados de la simulación paso estómago-intestino más de 7 h de siete Bifidobacterium
cepas probadas. La concentración de células de bifidobacterias vivir disminuyó inmediatamente después de la incubación debido al pH bajo (pH 3,0). Sin embargo, B. animalis subsp
. lactis
se mantuvo estable. Esto confirmó los resultados de los experimentos anteriores discutidos anteriormente (Figura 4). Esta resistencia podría extenderse a sales biliares y jugo pancreático Aunque los recuentos de células de B. animalis subsp
. lactis
disminuyó en aproximadamente un 85% del valor inicial (Figura 6). En comparación con las otras cepas utilizadas en este estudio, sin embargo, esta disminución era casi insignificante.
Todo B. longum
y B. breve
cepas murió muy rápidamente al comienzo de la simulación y estaban por debajo de la detección límite de la técnica de siembra en unas pocas horas (Figura 6), que era de esperar a partir de los resultados del experimento de muestreo anteriormente (Figuras 2 y 4).
Por otra parte, B. longum
subsp. infantis
14390 disminuyó rápidamente al comienzo de la simulación, pero después de la adición de sales biliares y de jugo pancreático y un cambio a un ambiente anaeróbico, disminución de la tasa de reducción. Nuestro estudio sugiere que esta cepa se adapta bien a las condiciones en el intestino, pero necesita ser ingerido en grandes cantidades para sobrevivir a las condiciones en el estómago (oxígeno, pH bajo). Como se mencionó anteriormente, B. longum
subsp. infantis
cepas pertenecen al primer grupo de bacterias que pueblan el intestino de los lactantes [26].
En contraste con B. longum
subsp. infantis
, B. adolescentis
disminuyó casi linealmente durante los 7 h simulación. No había ninguna interrupción detectable cuando las condiciones en el fermentador cambiaron. Con base en los experimentos para la selección de tolerancia ácido, este resultado fue inesperado.
Sin embargo, esto puede estar relacionado con las condiciones de prueba, donde la sal de la bilis y las concentraciones de jugo gástrico mantuvo en el nivel inicial y no se diluyeron como lo serían en
vivo. En un experimento futuro, se debe evaluar si el método de dilución desarrollado por Sumeri et al
. [9] estabilizaría los recuentos de células de B. adolescentis
durante el período de simulación 6 h en el intestino.
En nuestro estudio, también se evaluó el paso del estómago-intestino de Lactobacillus gasseri
K7. La cepa ya ha sido evaluada por la supervivencia in vivo
en lechones [14]. Por lo tanto, fue posible comparar nuestros resultados in vitro
con los datos de los experimentos in vivo
.
Bogovic et al
. [14] Los lechones alimentados durante un período de 14 días con 5 * 10 10 day ufc -1 de L. gasseri
K7. Esto dio lugar a aprox. 7 * 10 4 ufc g -1 en las heces durante el período de alimentación. Hay que tener en cuenta que se diluyó la concentración de bacterias antes de que finalmente llegó al pasaje estómago-intestino. En una primera aproximación, se estima que alrededor del 1% llegó al pasaje. Esto nos permitió comparar los resultados de este estudio lechones con el final de nuestra simulación.
Como se muestra en la Figura 5, L. gasseri
K7 tenía una concentración de células de aproximadamente 5 * 10 4 ufc ml -1 después del período de simulación 7 h (con un pre-cultivo de 250 ml), que es similar a la concentración en las heces de los lechones. Esto sugiere que el modelo de simulación utilizado en este estudio podría ser una herramienta útil para estimar los efectos del paso en un modelo in vitro
anterior utilizando caros en modelos in vivo
. El modelo podría optimizarse aún más mediante la dilución de las sales biliares y jugo pancreático tal como se describe por Sumeri et al
. [9]. Para simular la activación y desactivación de enzimas un método adecuado Aún está pendiente de que se encuentran.
Cuando sólo se utilizó 100 ml de medio para el inóculo de L. gasseri
K7, la cultura sobrevivió a la simulación mejor (Figura 7). Ambos volúmenes tenían un recuento de células inicial similar. Ambos volúmenes se inocularon con 1 ml. Por lo tanto, el cultivo con 250 ml de volumen estaba en una fase anterior de crecimiento que el cultivo de 100 ml. Estos resultados fueron una indicación de la dependencia de la fase de crecimiento del cultivo de durante el estrés.
Conclusión
En este estudio, hemos sido capaces de demostrar que el sistema para simular el paso del estómago-intestino desarrollado por Sumeri et al
. [9] era adecuado para la evaluación de la supervivencia de 8 cepas de Bifidobacterium y Lactobacillus
gasseri
K7 a pesar de que no simular la eliminación de las sales biliares y de jugos gástricos. Para L. gasseri
K7 hemos sido capaces de comparar los resultados con un estudio in-vivo
en lechones y se obtuvieron resultados similares. Francia El sistema de reactor único que aquí se presenta permite una identificación más sencilla de la fase de crecimiento ideales para cualquier posible cepa probiótica que se requiere para pasar el paso del estómago-intestino que si se tenía que llevar a cabo con otros sistemas con una configuración complicada. Francia el estudio también mostró que todas se prueba Bifidobacterium
cepas, a excepción de B. animalis subsp
. lactis
, requeriría agentes protectores para sobrevivir al paso por el estómago-intestino en grandes cantidades. Esto podría hacerse utilizando una matriz alimentaria adecuada o la encapsulación de las células.
Métodos Cepas bacterianas

Todas las cepas de bifidobacterias fueron seleccionados de la colección de cepas de Agroscope Liebefeld-Posieux ALP Estación de Investigación Suiza, aislado por la ALP de fuentes humanas. Lactobacillus gasseri
K7 originó a partir de la Colección de Microorganismos Industriales ZIM de la Universidad de Ljubljana, Facultad de Biotecnología (ZIM 105) [10] y también fue depositada en la colección de cepas ALP. Las cepas probadas y sus números de identificación de la cepa de colección ALP se enumeran en la tabla 3. Todas las cepas de bifidobacterias son propiedad de ALP.
Medios y condiciones de crecimiento
para pre-cultivos, conservas congelados 1 ml de las cepas eran inoculado en 250 ml de caldo de Wilkins-Chalgren (WC CM0643, Oxoid, Hampshire, Reino Unido) suplementado con 9 gl -1 adicional a la lactosa monohidrato (bifidobacterias) o de Man-Rogosa-Sharpe (MRS; Biolife, Milano, Italia) medio (Lactobacillus gasseri
K7) [32]. Para L
. También se realizó gasseri K7, un ensayo con un ml de precultivo 100. Todas las cepas, excepto Bifidobacterium longum
subsp. infantis
, se incubaron a 37 ° C durante 15 horas en condiciones anaeróbicas. Bifidobacterium longum
subsp. infantis
se incubó durante 12 h, ya que era muy sensible a los periodos de incubación prolongados. Los pre-cultivos se centrifugaron durante 15 min a 3500 rpm y los sedimentos se resuspendieron en 10 ml de solución fisiológica de cloruro sódico tamponada con fosfato (PBS).
Determinación de la célula conteo
El recuento de células se determinó mediante 10 veces dilución en serie de la cultura en solución salina fisiológica. Los dos diluciones más altas se sembraron en agar MRS (Biolife, Milano, Italia) usando un dispensador en espiral (Instrumentos IUL, Barcelona, ​​España) y evaluadas por un contador de colonias automatizado con el software correspondiente (IUL Instruments, Barcelona, ​​España).
detección de resistencia a los ácidos
para la resistencia a los ácidos de cribado la suspensión celular concentrada desde el pre-cultivo se pipeteó en 20 ml de PBS hasta una DO 650 de 1,0. a continuación, se inocularon 4 ml de esta suspensión celular en 16 ml de tampón de citrato-HCl (tri-Na-Citratex2 H 2O 7,35 g y 250 ml de agua destilada H 2O, adaptado al pH correspondiente con HCl 1) a valores de pH de 2,0, 2,5, 3,0, 3,5 y 4,0. La incubación se realizó a 37 ° C y se tomaron muestras cada 30 min durante 120 min. 1 ml de las muestras se mezclaron con tampón fosfato de 9 ml 0,25 M a pH 7,0 en la primera etapa de la serie de dilución. Para la prueba de resistencia a los ácidos en una matriz alimentaria, la misma cantidad de pre-cultivo tal como se utiliza anteriormente (ajustado a un OD 650 de 1,0) se pipeteó en 20 ml de leche descremada UHT. se inocularon 4 ml de esta suspensión celular en la leche en 16 ml de tampón de citrato-HCl. Todos los productos químicos se adquirieron de Merck (Darmstadt, Alemania). Los datos de los experimentos de selección fue visualizado en gráficos de contorno utilizando el software Sigmaplot 11.0 (Systat Software Inc., Chicago IL, EE.UU.).
Simulación en el biorreactor
Todas las soluciones se preparan para cada experimento. solución estómago simulado se hizo de 50 mg de pepsina mucosa gástrica porcina (Sigma-Aldrich P7012, Buchs, Suiza) en 20 ml de HCl 0,1 M. Para la simulación de páncreas jugo de 2 g de pancreatina (Sigma-Aldrich P7545) se disolvieron en 50 ml de tampón de fosfato 0,02 M a un pH de 7,5. solución de sales biliares simulado se hizo de 7,5 g de bilis bovina (Sigma-Aldrich B3883) hecha hasta 50 ml con agua destilada H 2O. El caldo para la simulación fue de 1 litro de caldo MRS WC o con 29,41 g citratex2 trisódico H 2O. se añadieron Durante las pruebas de supervivencia en una matriz alimentaria, a 500 ml de leche descremada UHT y el pH se ajustó a 3,0 con HCl 5 poco antes de la simulación. 1 l de medio se añadió al biorreactor (NewMBR Mini, NewMBR, Suiza), previamente esterilizado con agua (121 ° C, 20 min), y se calentó a 37 ° C. Durante la simulación de estómago, se llevó a cabo la aireación. La fermentación se controla y registra utilizando el software de gestión de Lúculo proceso integrado (Biospectra, Schlieren, Suiza). La suspensión celular concentrada desde el pre-cultivo se pipeteó en 40 ml de PBS a un OD 650 de 1,5. Poco antes de la inoculación de la suspensión de células 40 ml, se añadieron 20 ml de la solución de estómago simulado para el medio (1 l) en el biorreactor.

• La evaluación del riesgo de cáncer gástrico asociado con la asbestosis: una evaluación caso report
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