Vertinimas Lactobacillus gasseri K7 ir bifidobakterijų iš skrandžio perėjimo į žarnyną, naudojant vieną reaktoriaus modelį

Vertinimas Lactobacillus gasseri pervežimas K7 plaukimo ir bifidobakterijų iš skrandžio į žarnyną, naudojant vieną reaktoriaus modelį
tezės
Background pervežimas probiotinių bakterijų yra manoma, kad svarbų vaidmenį virškinimo sistemą ir todėl turi išgyventi perėjimą iš skrandžio į žarnyną. Neseniai naujas metodas imituoti ištrauką iš skrandžio į žarnyną vienu bioreaktorius buvo sukurtas. Šio automatizuotas vieno reaktoriaus sistemos privalumas buvo galimybė išbandyti rūgšties, tulžies druskų ir pankreatino įtaką.
Lactobacillus gasseri
K7 yra štamas izoliuotas nuo kūdikių išmatose su savybės priėmimo įtampą įdomaus sūrio gamybai. Šiame tyrime, vieno reaktoriaus sistema buvo naudojama įvertinti L. gasseri pervežimas K7 išlikimą ir pasirinktų bifidobakterijų iš mūsų kolekcijos per pilvo žarnyno ištrauka.
Rezultatai
Pradinė atranka rūgšties atsparumo parūgštintu kultūros Media parodė mažą toleranciją Bifidobacterium dentium
šią sąlygą nurodant išgyvens neilgai ištrauka. Panašūs rezultatai buvo pasiekti su B. longum pervežimas subsp. infantis
o B. Animalis
subsp. lactis
turėjo aukštą išlikimą.
Šie pradiniai rezultatai buvo patvirtinti bioreaktorius modelio skrandžio-žarnyno ištrauka. B. Animalis
subsp. lactis
turėjo aukščiausią išgyvenamumas (10%) pasiekti maždaug 5 × 10 6 ksv ml -1, palyginti su kitomis išbandytų bifidobakterijų padermės, kurios buvo sumažintos nuo iki 10 kartų 6 , Lactobacillus gasseri
K7 buvo mažiau atsparūs nei B. Animalis
subsp. lactis
bet išgyveno ne ląstelių koncentracija maždaug 1000 kartų didesnis nei kitų bifidobakterijų.
Išvada
Šiame tyrime mes galėjome parodyti kad L. gasseri
K7 turėjo aukštą išgyvenamumas į stomach- žarnyno ištrauka. Palyginant rezultatus su ankstesnių tyrimų metu paršelių galėtume patvirtinti mūsų modeliavimas patikimumą. Tirtų bifidobakterijų padermių, tik B. Animalis
subsp. lactis
parodė priimtiną išlikimą sėkmingo plaukimo modeliavimo sistema.
faktai
Probiotikai, ypač pieno rūgšties bakterijos turi teigiamą poveikį vartotojų sveikatai, kaip siūloma 1907 m [1]. Buvo tikima, kad bakterijos daugiausia kontroliuoja sukeltoms infekcinėms žarnyno patogenų ir reguliuojamoje toxoaemia, taip gerinant sveikatą ir daryti įtaką mirtingumą. Tuo tarpu ji buvo žinoma, kad kai kurie iš teigiamo poveikio vartotojų sveikatai, yra į mikrofloros balanso pagerėjimas žarnyne, imuninės sistemos stimuliacija, ir padėti organizmui kovoti su patogeniniais mikroorganizmais [2]. Didelė dalis interesų buvo sutelktas į padermių Genčių Lactobacillus
ir Bifidobacterium
naudojimą, net jei yra ir kitų bakterijų probiotikų poveikį, pvz kai propionibacteria.
Minėtos savybės taip pat yra pagrindas mikroorganizmas turi būti paženklinti probiotikas. Yra skirtingos apibrėžtys visame pasaulyje, bet jie yra panašūs savo turiniu. Viena iš probiotikas štamo kriterijus yra jo atsparumas rūgštingumo ir skrandžio sprendimų žmogaus virškinimo trakto [3]. Todėl svarbu, siekiant įvertinti galimą probiotikų padermės atsparumą rūgščių ir skrandžio aplinkos žarnyne.
Dėl didelių sąnaudų ir etikos, taip pat saugos reglamentų Klinikinių tyrimų atrankos išlikimui yra lengviau imituoti in vitro,
. Paprastas testas yra inkubacijai bakterijų ląsteles rūgščiame arba tulžies druskų tirpalų apibrėžtą laikotarpį ir suskaičiuoti išlikusių ląstelių skaičių. Į tolesnį žingsnį, modeliavimas atliekamas į susijaudinę kolbos, derinant rūgštingumą ir skrandžio sprendimus po kurio buvo išgyventi ląsteles per visą modeliavimo nustatymui. Tai yra daugiau realus replikacijos iš [4] žarnyno sąlygomis. Kitas sistema, žmogaus žarnyno mikrobų ekosistemos (Shime) Simuliatorius, sudaro nuo 5 iki 6 serijiniu susijusių pH kontroliuojamas bioreaktorių [5-7]. Sąrankos yra gana sudėtingas ir reikalauja absoliučių anaerobinėmis sąlygomis. Be to, metabolitų ir vandens absorbcijos neveikia imituoti. Tai buvo įveikti naudojant dializės membranas, kaip aprašyta Marteau kt
. [8].
Neseniai naują sistemą, naudojant vieną bioreaktorių buvo sukurta siekiant ištirti skrandžio-žarnyno ištrauka [9]. Sistema leidžiama pH turi būti pakeistos viduje vieno reaktoriaus ir buvo pritaikyta sulaikymo trukmes skirtinguose regionuose skrandžio-žarnyno ištrauka.
Lactobacillus gasseri
K7 neseniai buvo izoliuotas nuo kūdikių išmatose [10]. Ji gamina bacteriocin kuris yra aktyvus prieš Clostridium
sp. ir jų sporos. L. gasseri
priklauso vadinamajai "acidophilus" -grupės ir keli nepriklausomi tyrimai nustatė šiuos štamus, kaip gyventojams odos ir žarnyno [11-13]. Ankstesniais eksperimentų, ji jau buvo in vitro
kad L. gasseri
K7 išgyveno rūgščioje aplinkoje ir su 0,3% tulžies druskų [10]. Šios išvados, kad įtampa įdomu kaip įmanoma probiotikas.
Šiame tyrime vieną bioreaktorių sistema grindžiamą Sumeri kt
darbą. [9] buvo naudojamas įvertinti Lactobacillus gasseri pervežimas K7 išlikimą ir aštuonis Bifidobacterium
štamus iš mūsų kolekcijos. Mes galėjome Palyginkite L. gasseri
K7 rezultatus su tyrimo, atlikto paršelių [14], kuri leido koreliacijos vertinimą tarp in vitro
tyrimo rezultatai, in vivo
eksperimentų .
sulaikymo trukmė ir kai naudojamas pH šiame tyrime buvo pagrįsti duomenimis, iš literatūros. Keletas metodų, leidžiančių matavimo pH žarnyne [15]. 1 lentelė rodo pH reikšmes įvairiose žarnyne, matuojant Heidelbergo kapsulę [16, 17]. Sulaikymo trukmė gali būti apskaičiuojama naudojant žymeklį medžiagų (cheminių) arba radijo telemetrijos kapsulės tokios kaip Heidelbergo pervežimas kapsulę [18]. Tačiau kapsulės paprastai turi ilgesnius išlaikymo kartų, nei cheminių žymeklių. 2 lentelė sąrašai kai rasti literatūroje sulaikymo trukmes [4, 5, 19-24] .table 1 pH į žmogaus virškinimo trakto, išmatuotas su Heidelbergo
kapsulę.

skrandžio
dvylikapirštės žarnos
tuščioji žarna
Klubinė žarna
proksimalinio
MEDIAL
Distalinė
pH
1,4 **
6.22 *
6,4 **
7,1 **
7,4 **
* Fallingborg kt
. 1994 [16]
** Fallingborg kt
. 1998 [17]
2 lentelė Saugojimo kartus plonojoje žarnoje minėto literatūroje.
sulaikymo trukmė

Šaltinis
Pastabos

1-4 val
Huang ir Adamsas 2004 [21]
4.25 val
Van Den Driessche kt
. 2000 [24]
Skrandžio ir plonoji žarna
4 val
Mojaverian 1996 [22]
6 H
Picot ir Lacroix 2004 [4]
Pasirinktos maksimalus laikas modeliavimo
7,5 val
Fallingborg kt
. 1990 [20]
Vaikų
8 val
Fallingborg kt
. 1989 [19]
8 val
Alander kt
. 1998 [5]
Modeliavimas į Shime reaktorius
6-10 val
Matthews et al
. 1991 [23]
Remiantis rasti literatūroje ir darbą Sumeri kt
duomenis. [9] fermentacija buvo įsteigtas kaip aprašyta medžiaga ir metodai ir parodytas 1 pav 1 pav parametrai skrandžio-žarnyno ištrauka modeliavimo virš 7 val.
Rezultatai
Acid atsparumo atrankos Viesbutis The tikslas nuo pradinės bandymų serijoje buvo gauti iš atsparumas rūgščiai aštuonių bifidobakterijų padermių apžvalgą. 2, 3 ir 4 paveikslėlius rodo šių padermių naudojant kontūro sklypai pagaminti su Sigmaplot išlikimą. Bifidobacterium dentium
(3 paveikslas) rodo mažiausią rūgšties pasipriešinimą. PH nuo 4.0 ir pH 2.0 nebuvo jokio skirtumo išgyvenimą ir ląstelių sumažėjo daugiau nei 7 žurnale per 40 minučių koncentracija. Bifidobacterium animalis
subsp. lactis
buvo labiau atsparūs iki 40 min, esant pH 2.0, bet tada sumažėjo apie 3 žurnale, kai inkubuojami 120 minučių (4 paveikslas). Esant pH tarp 2,5 ir 3,0 sumažėjimas buvo mažesnis nei 1 log po 120 minučių. 2 pav atsparumas rūgščiai trijų Bifidobacterium longum padermių. X ašis: Laikas (min); Y ašis: pH; prisijungti ksv rodomi spalvos (skalė nuo grafikų dešinėje). Skaičiai bakterijų pavadinimų yra deformacijų numeriai FAM-duomenų bazę ALP.
3 paveikslas Acid atsparumą Bifidobacterium dentium, B. longum subsp. infantis ir B. adolescentis. X ašis: Laikas (min); Y ašis: pH; prisijungti ksv rodomi spalvos (skalė nuo grafikų dešinėje). Skaičiai bakterijų pavadinimų yra deformacijų numeriai FAM-duomenų bazę ALP.
4 pav Acid atsparumą Bifidobacterium breve ir B. Animalis subsp. lactis. X ašis: Laikas (min); Y ašis: pH; prisijungti ksv rodomi spalvos (skalė nuo grafikų dešinėje). Skaičiai bakterijų pavadinimų yra deformacijų numeriai FAM-duomenų bazę ALP.
Visi kiti išbandyti Bifidobacterium
padermės (B. longum B. breve, B. longum
subsp. Infantis ir B. adolescentis
) parodė panašų, bet kitokį modelį iš B. animalis
subsp. lactis
(Skaičiai 2, 3 ir 4). Jie turėjo trumpą išgyvenimo laikas žemiau pH 2,5 ir išliko didesni skaičiai pH didesnis negu 3,5.
Su sukurti metodą, kad būtų imituotos GN į bioreaktorius tikslas, papildomas bandymas buvo atliktas su vieno kamieno. Norėdami stebėti maisto matricos įtaka, sutelkta B. longum
subsp. infantis
buvo resuspenduota lieso pieno prieš įdėję sėjimo kultūros į rūgščius sprendimus. Kaip parodyta dešinėje stulpelyje 5 paveiksle, pieno turėjo tiesioginį poveikį kamieno išlikimo. PH nuo 3,0 ir 3,5 bakterijos išgyveno 120 min su log 2. mažinimo Žemiau pH 3.0 išgyvenamumas sumažėjo iki maždaug Prisijungti 5. išgyventas žemiau pH 3.0 sumažėjimas buvo greitas, bet reguliariai laikui bėgant. Esant pH 3,5 ir aukščiau, padermė buvo atsparus ne mažiau kaip 120 minučių. 5 pav palyginimas rūgšties atsparumo Bifidobacterium longum subsp. infantis 14390 sustabdytas NaCl arba lieso pieno. Kairėje: Bifidobakterijos resuspenduota NaCl, teisus: Bifidobakterijos sumaišymo į pieną. X ašis: Laikas (min); Y ašis: pH; prisijungti ksv rodomi spalvos (skalė nuo grafikų dešinėje). Skaičiai bakterijų pavadinimų yra deformacijų numeriai FAM-duomenų bazę ALP.
Kairioji skiltis iš 5 paveiksle rodo tas pats štamas be pridėtinės lieso pieno. Esant pH didesnis už 3.5, nebuvo įtaka bakterijų išgyvenimu. Tačiau, žemiau pH 3,5 išlikimo sumažėjo priklausomai nuo inkubavimo trukmės. PH nuo 3.0 ir 3.5 kamienas jau sumažėjo apie prisijunkite 5. Po 30 min inkubacijos buvo beveik tiesinis sumažėjimas išlikimo mažėjant pH nuo 3,0 iki 2,5.
Modeliavimas bioreaktorius
Dauguma sistemų aprašyta literatūros sudarytas iš kelių reakcijos indų, pvz Shime [6]. Kiti tyrimai naudojami imobilizuota ląsteles su trimis reaktoriais [25] arba dializės sistemos [8]. Remiantis Sumeri et al
darbą. [9] ir surinkti duomenys iš žarnyno ištrauka sąlygomis mums pavyko apriboti modeliavimą į vieną indą. Kartu su duomenimis, gautais iš rūgšties atsparumo patikrinimo, gali būti pasirinktos galimos pradinę pH ir sultinio sudėties simuliatoriuje pasirinkimas. Gauti modeliavimo parametrai parodyta 1 paveiksle ir aprašyti Medžiaga ir metodai skyriuje. Per eksperimentinį etapą šio tyrimo Sumeri kt
. [9] sukūrė panašią sistemą, skirtą vertinti Lactobacillus
sp. į pilvo žarnose ištrauka modeliavimas.
programinės įrangos paketą "Lucullus" buvo puiki priemonė kontroliuoti pH ir procesą, atsižvelgiant į išsivysčiusių modeliavimas. Pasirinkę į bioreaktorius terpę buvo supaprastinta pasirenkant atitinkamą kultivavimui skirta terpe padermių papildytas lieso pieno, veikianti kaip imituojant maisto matricoje. Po to, ji buvo parūgštintas į pradinę pH ir papildyti su fermentų sprendimų, kaip aprašyta Medžiagos ir metodai. Moduliavime buvo atlikti serijiniu, po vieną dieną. Rezultatai yra parodyta 6 pav naudojami modeliavimo kamienai yra 3 lentelėje išvardytos (tik Bifidobacterium dentium
buvo pašalintas) ir buvo standartizuotas iki OD 650 1,5 iki inokuliaciją. 6 pav plėtra 7 Bifidobacterium padermių metu skrandžio-žarnyno ištrauka imitavimo 7 val. Punktyrinė linija rodo, kad to tulžies druskų ir kasos sulčių laiko. Skaičiai bakterijų pavadinimų yra deformacijų numeriai FAM-duomenų bazę ALP.
3 lentelė padermės išbandytas modeliavimas.
Vardas
identifikavimo numeris ALP padermės kolekcijos
Bifidobacterium adolescentis
FAM-14377
Bifidobacterium breve
FAM-14398
Bifidobacterium longum
subsp. infantis
FAM-14390
Bifidobacterium animalis
subsp. Lactis
FAM-14403
Bifidobacterium dentium
FAM-14396
Bifidobacterium longum
FAM-14.382, -14.383, -14.406
Lactobacillus gasseri
K7
FAM-14459
Bifidobacterium adolescentis
buvo pasėta, kaip aprašyta aukščiau už pradinę koncentraciją 10 7 KSV ml -1 ir sumažėjo beveik tiesiškai žemiau 10 4 ksv ml -1 po 5 valandų. B. breve parsisiųsti ir B. longum
padermių turėjo pradinei koncentracijai nuo 10 7 ir 10 8 KSV ml -1 ir sumažėjo žemiau 10 2 ksv ml -1 per pirmąsias 30 minučių. B. Animalis
subsp. lactis
14403 išgyveno maždaug 15% pradinio vidutinis ksv 5 × 10 8 KSV ml -1. Nebuvo sparčiai sumažėjo išlikimo B. longum pervežimas subsp. infantis
per pirmąjį 30 min. Vėliau išlikimo sumažėjo tik lėtai nuo 10 nuo 5 iki 10 4 ksv ml -1.
Vėlesniame etape Lactobacillus gasseri
K7 buvo įtraukta į tyrimą, nes keli projektai buvo paleisti šiuo metu mūsų instituto šio kamieno. Lactobacillus gasseri
K7 buvo pasėta 2,2 × 10 7 KSV ml -1 ir po 7 h modeliavimas iš 10 5 ksv ml -1 gyvų ląstelių koncentracija dar buvo pateikti į terpės (7 pav, curve 250 ml talpos kultūros). Labiausiai sumažėjo išlikimo buvo per pirmąsias 2 valandas ir pradėjo iš karto po to, kai skrandžio sulčių ir tulžies druskų to. Per šį laiką, ten buvo gyvas ląsteles žurnale 2. Per modeliavimo likusį laiką mažinimas, ten buvo tik žurnalo 1 mažinimas gyvų ląstelių. 7 pav Palyginimas 100 ml talpos kultūros Lactobacillus gasseri K7 su 250 ml talpos kultūros įtaka. Iš anksto paruošta kultūra buvo paruošta centrifuguojant ir resuspenduojamos fiziologinio natrio chlorido tirpalu, kad būtų pasiektas 1,5 OD600. Skrandžio-žarnyno ištrauka modeliavimas inkubuojami naudojant pakoreguotą sprendimą ir inkubuojami 7 val. Punktyrinė linija rodo, tulžies druskų ir kasos sultis. Kreivės yra pasikartojančių eksperimentų vidurkis.
Apie L. gasseri pervežimas K7 inokulą 100 ml kultūros tūrio rengimą taip pat buvo įvertintas. Eksperimentai rezultatai yra pavaizduota 7 paveiksle su 250 ml kultūroje gyvų ląstelių sumažėjimas buvo apie log 2 kadangi šis sumažėjimas su 100 ml kultūros buvo prisijungti tik 1 per visą inkubacijos laikas. Tačiau 2 val po to tulžies druskų ir kasos sulčių ląstelių kiekio sumažėjimas buvo panašus abiejose apimtis.
Diskusijos
Kai derliaus kultūrą po tam tikro inkubacijos laikas, augimo etapas kiekvieno bakterijų padermės gali būti skiriasi nuo visos turi skirtingus augimo dinamiką. Tam, kad gauti ląsteles maždaug tuo pačiu augimo fazėje, preliminarios Bandymai buvo atliekami (duomenys neparodyta). Inkubacinis laikas 15 h Iš anksto paruošta kultūra buvo tinkamas visų tirtų padermių išskyrus Bifidobacterium longum pervežimas subsp. infantis
kurios turėtų būti inkubuojami tik 12 h.
rūgšties toleranciją sijojimo (skaičiai 2, 3 ir 4) buvo atliekama siekiant įvertinti pH poveikį nepriklausomai nuo kitų sąlygų. Bifidobacterium dentium
buvo labai jautrus rūgšties, todėl galbūt ne išgyventi perėjimą per skrandį. Todėl padermės nebuvo įtraukta į modeliavimo eksperimentus. Į B. longum
kamienai (2 paveikslas) nedavė daug geresnių rezultatų nei B. dentium
(3 paveikslas). Tačiau, netoli pH 4 jie atsparesni nei B. dentium pervežimas.
B. longum
subsp. infantis
yra vienas iš pirmųjų rūšių užpildyti žmogaus žarnyną netrukus po gimimo [26]. Remiantis šio tyrimo eksperimentus, tačiau išbandyti B. longum
subsp. infantis
padermė galėtų praeiti kūdikių skrandžio dideliais kiekiais tik tada, jei pereinamojo laikotarpio metu rūgščioje skrandžio buvo labai trumpas. Pasirinkto padermės išbandyto aplinkos išgyvenimo trukmė buvo per maža sėkmingai ištrauka aukštų skaičių. Kai kamienas buvo resuspenduota lieso pieno, išlikimo padidėjo (5 paveikslas). Tai gali būti požymis, kad žmogaus pienas padeda, B. longum
subsp. infantis
kamienai perduoti skrandžio-žarnyno praėjimą su aukštesniu išgyvenimo rodiklis.
apsauginį poveikį pieno baltymų, virškinimo sistemos jau buvo aprašytos literatūroje [27]. Apsauga su pieno baltymų taip pat buvo parodyta šiame tyrime (5 pav). Su atitinkamos matricos ar net vežėjas, probiotinės bakterijos gali saugiai pereiti pro skrandį, į žarnyną pasieks savo svetainę veiksmų.
B. adolescentis
atmainos, kurios užpildyti žmogaus žarnyną vėlesniame amžiuje, turėjo šiek tiek didesnį atsparumą nei B. longum pervežimas subsp. infantis
kurie gali paaiškinti pastarojo sumažinti per žmogaus kūdikiui pažangą iki pilnametystės [26].
įdomiausių įtampą buvo B. Animalis
subsp. lactis
, kuris buvo mažiausiai jautrios padermės mūsų tyrime. Šis pH atsparios padermės turi didelį potencialą naudoti maisto produktuose, kaip probiotikas papildas nuo didesniu skaičiumi bakterinių ląstelių būtų išgyventi praėjimą. Tačiau, naudoti šią įtampą kaip probiotikai, daugiau tyrimų turi būti atliekami siekiant probiotikai statusą pagal Klaenhammer apibrėžimo [3].
Mūsų tyrime maisto matricos nurijus buvo modeliuojamas pradinis aplinka raugintas pienas ir augimo terpę. skrandžio etape sukurta pridėtinė imituoti skrandžio tirpalo ir deguonies padidino įtampą. Per imituojamą praėjimo į plonąją žarną deguonies buvo pakeistas azoto ir vidutinės buvo neutralizuota iki pH 6,3. Iš kasos tirpalo ir tulžies druskų papildymas baigtas praėjimą į plonąją žarną. Ši in vitro
sistema neatsižvelgė į tai, kad in vivo
virškinimo fermentai yra aktyvuotas ir inaktyvuotiems ir kitos medžiagos, pvz tulžies druskos amortizuoti. Sumeri kt
. [9] nustatyta, dalinis sprendimas apeiti šią problemą. Jie atskiesti reaktoriaus turinį su specialiai sukurta skiedimo terpėje. Taip pat būtų galima nusodinti tulžies druskų tuo modeliavimo plonosios žarnos imituoti enterohepatinę grandinę pabaigoje. Tai gali būti atliekamas su kalcio jonų [28-30]. Pašalinus tulžies druskų būtų geriau imituoti dvitaškis aplinką ir net gali leisti bifidobakterijos daugintis.
Mūsų tyrime likusius tulžies druskas ir kasos sulčių modeliavimo sukėlė papildomą stresą dėl bakterijų, kurios tikriausiai pakeisti tikrąsias savybes in vivo
padermių.
pradedant kSV modeliuojant svyravo per vieną žurnalo ksv nors OT reguliavimas 650 bandinyje buvo anksčiau bandomos Bifidobacterium animalis
subsp. lactis parsisiųsti ir Bifidobacterium longum
subsp. infantis
padermes. Naudojami šiame tyrime bifidobakterijos parodė tendenciją formuoti grupes, kurios gali sumažėti ksv (vizualinius stebėjimus, duomenys nebus rodomas). Atliekant kitą tyrimą, klasterių susidarymas gali būti susijęs su mažėja pH metu augimo [31]. Šios grupės paprastai skaičiuojamas kaip vienas kolonijos plokštelės.
6 pav rodo skrandžio-žarnyno ištrauka modeliavimo rezultatus per 7 val septynių tirtų Bifidobacterium
padermių. Iš gyvų ląstelių bifidobakterijų koncentracija iš karto sumažėjo po inkubacijos dėl mažo pH (pH 3,0). Tačiau B. Animalis
subsp. lactis
išliko stabili. Tai patvirtino ankstesnių eksperimentų aukščiau (4 paveikslas) aptartų rezultatų. Šis pasipriešinimas gali būti pratęstas iki tulžies druskų ir kasos sulčių nors ląstelių skaičius B. Animalis
subsp. lactis
sumažėjo apie 85% pradinės vertės, (6 pav). Palyginti su kitų padermių naudojami šiame tyrime, tačiau šis sumažėjimas buvo beveik nežymus.
Visos B. longum parsisiųsti ir B. breve
atmainos mirė labai greitai tuo modeliavimo pradžioje ir buvo žemiau aptikimo riba dengimo metodo per kelias valandas (6 pav), kuri buvo galima tikėtis iš patikrinimo eksperimento rezultatais aukščiau (2 ir 4 pav).
kita vertus, B. longum
subsp. infantis
14390 sparčiai mažėjo tuo modeliavimo pradžioje, bet po kasos sulčių ir tulžies druskų to ir pokyčių į anaerobinės aplinkos, sumažinimas lygis sumažėjo. Mūsų tyrimas rodo, kad ši veislė yra gerai pritaikytos prie žarnyne sąlygomis, bet reikia nuryti dideliais kiekiais išgyventi, kad skrandžio sąlygas (deguonis, žemas pH). Kaip minėta pirmiau, B. longum
subsp. infantis
atmainos priklauso pirmosios grupės bakterijų užpildant kūdikių žarnyną [26].
Skirtingai B. longum pervežimas subsp. infantis
B. adolescentis
sumažėjo beveik tiesiškai per 7 h modeliavimas. Ten buvo neaptinkama nutraukimas, kai į fermentatoriaus sąlygos pakeistas. Remiantis už rūgšties tolerancijos atrankos eksperimentų, šis rezultatas buvo netikėtas.
Tačiau, tai gali būti susiję su bandymų sąlygomis, kai tulžies druskos ir skrandžio sulčių koncentracija išliko pradinio lygio ir nebuvo sumažintą kaip jie galėtų in vivo
. Į ateitį eksperimento, tai turėtų būti įvertinta, ar praskiedimo metodas sukurtas Sumeri kt
. [9] turėtų stabilizuoti ląstelių kiekis B. adolescentis
per 6 h modeliavimo laikotarpį žarnyne.
Mūsų tyrime, mes taip pat įvertino skrandžio-žarnyno ištrauka Lactobacillus gasseri pervežimas K7. Kamienas jau buvo įvertinta už išlikimą in vivo
paršelių [14]. Todėl buvo galima palyginti mūsų in vitro
rezultatus su duomenų in vivo
eksperimentams.
Bogovic kt
. [14] šeriami paršeliai virš 14 dienų laikotarpiui, 5 * 10 10 ksv dieną -1 L. gasseri pervežimas K7. Tai lėmė, apytiksl. 7 * 10 4 ksv g -1 per per šėrimo laikotarpiu išmatomis. Ji turi būti atsižvelgta į tai, bakterijų koncentracija praskiestose, kol ji pagaliau atvyko į pilvo-žarnyno ištrauka. Be apytikslis, mes Apskaičiuota, kad apie 1% atvyko į ištrauka. Tai leido palyginti šio paršelių tyrimo rezultatus su mūsų modeliavimas pabaigoje.
Kaip parodyta 5 pav L. gasseri
K7 turėjo mobilųjį koncentracija maždaug 5 * 10 4 ksv ml -1 po 7 h modeliavimo laikotarpį (su iš anksto kultūros 250 ml), kuri yra panaši į paršelių išmatomis koncentracijos. Tai rodo, kad imitavimo modelis, naudojamas šiame tyrime gali būti naudinga priemonė įvertinti ištraukos poveikį in-vitro
modelį prieš naudojant brangus in vivo
modelių. Modelis galėtų būti dar labiau optimizuotas skiedžiant tulžies druskas ir kasos sulčių, kaip aprašyta Sumeri kt
. [9]. Imituoti įjungimą ir išjungimą fermentų dar reikia rasti tinkamas metodas.
Kai tik po 100 ml vidutinio buvo naudojamas L. gasseri pervežimas K7 sėjimo kultūra, kultūra išgyveno modeliavimas geriau (7 paveikslas). Abu apimtys turėjo panašią pradinis ląstelių skaičių. Abu apimtys buvo užsėti iki 1 ml. Todėl kultūra su 250 ml tūrio buvo ankstesniame etape augimo nei 100 ml kultūrą. Šie rezultatai buvo priklausomybės nuo kultūros augimo fazėje nuoroda streso metu.
Išvada
Šiame tyrime mes galėjome parodyti, kad sistema imituoti pilvo žarnyno ištrauka sukurtą Sumeri et al
. [9] buvo tinkamas išlikimo 8 Bifidobacterium
padermių ir Lactobacillus gasseri vertinimo
K7 nors mes ne imituoti skrandžio sulčių ir tulžies druskų pašalinimą. Dėl L. gasseri
K7 mes galėjome palyginti rezultatus su in vivo
tyrimo dėl paršelių ir gavo panašius rezultatus.
Vieną reaktorių sistemą čia pateiktą leidžia labiau paprastą identifikuoti idealiai augimo fazėje už bet kokią galimą probiotikų padermės, kuri turi perduoti skrandžio-žarnyno ištrauka, nei jei jis turėjo būti atliekamas su kitų sistemų, su sunkiu setup.
tyrimas taip pat parodė, kad visi išbandė Bifidobacterium
padermes, išskyrus B animalis
subsp. lactis
, reikėtų apsauginius agentus išgyventi perėjimą pro skrandį-žarnyno dideli kiekiai. Tai galima padaryti naudojant tinkamą maisto matricos arba hermetizuoti ląstelių.
Metodai
bakterijos atmainų
Visi bifidobakterijų padermės buvo atrinktos iš kamieno kolekcijos Agroscope Liebefeld-POSIEUX ALP tyrimų stotis Šveicarijoje, izoliuotas ALP nuo žmogaus šaltiniai. Lactobacillus gasseri
K7 kilęs iš ZIM kolekcijos pramoninių mikroorganizmų University of Ljubljana, biotechniniu fakulteto (ZIM 105) [10], taip pat buvo kaupiamos ALP padermės kolekciją. Tiriami kamienai ir jų identifikavimo numeriai ALP padermės kolekcijos yra išvardyti 3 lentelėje Visi bifidobakterijų padermės yra iš ALP nuosavybė
Žiniasklaida ir augimo sąlygos
Pasirengimo kultūrų., 1 ml šaldytų tausoja štamų buvo užsėti 250 ml Wilkinsas-Chalgren sultinio (WC CM0643, OXOID Hampshire, Jungtinė Karalystė) papildytas 9 gl -1 papildomą laktozės monohidrato (bifidobakterijų) arba De Man-Rogosa-Sharpe (MRS; Biolife, Milanas, Italija) vidutinio (Lactobacillus gasseri
K7) [32]. Dėl L
. gasseri K7 bandomoji su 100 ml talpos kultūros taip pat buvo atliktas. Visi štamai, išskyrus Bifidobacterium longum
subsp. infantis
, buvo inkubuojami 37 ° C temperatūroje 15 valandų anaerobinėmis sąlygomis. Bifidobacterium longum
subsp. infantis
buvo inkubuojami 12 h, nes jis buvo labai jautrus pratęstas inkubacinio laikotarpio. Iš anksto-kultūros buvo centrifuguojamas 15 min 3500 apsisukimų per minutę ir granulės vėl suspenduojamos 10 ml fosfatinio buferio fiziologinis natrio chlorido tirpalu (PBS).
Nustatymas ląstelių skaičius
ląstelių skaičius buvo nustatyta 10 kartų serijos praskiedimas į fiziologiniame druskos tirpale kultūros. Tuomet du aukščiausios skiedinius buvo padengtas ant MRS agaro (Biolife, Milano, Italija), naudojant spiralės Plater (Iul priemonių, Barselona, ​​Ispanija) ir įvertino automatizuotą kolonijos skaitiklis su atitinkamą programinę įrangą (Iul priemonių, Barselona, ​​Ispanija).
patikrinimas, rūgšties atsparumo
dėl rūgšties atsparumo tikrinimą koncentruotą ląstelių suspensijos iš anksto paruošta kultūra buvo įpilama į 20 ml PBS iki OD 650 1,0. 4 ml šio ląstelių suspensijos tada buvo inokuliuota po 16 ml citrato-HCl buferiniame tirpale (tri-Na-Citratex2 H 2O 7,35 g, o 250 ml distiliuoto H 2O, suderintų su atitinkamomis pH su 1 M HCl) ne pH reikšmių 2,0, 2.5, 3.0, 3.5 ir 4.0. Inkubacinis buvo padaryta 37 ° C temperatūroje ir mėginiai buvo paimti kas 30 min per 120 min. 1 ml mėginių buvo sumaišyti su 9 ml 0,25 M fosfatinis buferis, kurio pH 7,0 pirmos pakopos į praskiedimo serijos. Dėl rūgšties atsparumo testas maisto matricos, ta pati suma iš anksto paruošta kultūra, vartojama anksčiau (pritaikyta OD 650 1,0) buvo įpilama į 20 ml UHT lieso pieno. 4 ml šio ląstelių suspensijos pieno buvo inokuliuojamas į 16 ml citrato-HCl buferiniame tirpale. Visos cheminės medžiagos buvo perkamos iš Merck (Darmstadt, Vokietija). Sutartys dėl šių patikros eksperimentų duomenys buvo ryškinamos kontūrų sklypų naudojančių Sigmaplot 11.0 programinę įrangą (SYSTAT Software Inc., Chicago IL, JAV).
Modeliavimas bioreaktorius
Visi sprendimai buvo ruošiamas kiekvieno eksperimento. Imituotas skrandžio tirpalas buvo pagamintas iš 50 mg pepsino kiaulių skrandžio gleivinės (Sigma-Aldrich P7012, Buchs, Šveicarija) 20 ml 0,1 M HCl. Už imituojamą kasos sultys 2 g pankreatinas (Sigma-Aldrich P7545) buvo ištirpinta 50 ml 0,02 M fosfato buferio, esant 7,5 pH. Imituoti tulžies druskos tirpalas buvo 7,5 g galvijų tulžies (Sigma-Aldrich B3883) sudarė 50 ml praskieskite distiliuotu H 2O. Už modeliavimo sultinys buvo arba 1 l, tualetas ar PONIA sultinys su 29,41 g trinatrio citratex2 H 2O. bandymų išlikimo maisto matricos metu, 500 ml UHT lieso pieno buvo pridėta ir pH reguliuoti iki 3,0 5 M HCl prieš modeliavimo. 1 L vidutinės buvo įtraukta į bioreaktorių (NewMBR Mini, NewMBR, Šveicarija), anksčiau sterilizuoti su vandeniu (121 ° C, 20 min), ir kaitinamas iki 37 ° C temperatūroje. Per skrandžio modeliavimas, vėdinimas buvo įgyvendintas. Fermentacija buvo kontroliuojama ir registruojama naudojant integruotą procesų valdymo programinės įrangos Lucullus (Biospectra, Schlieren, Šveicarija). Koncentruotas ląstelių suspensija iš anksto paruošta kultūra buvo įpilama į 40 ml PBS į OD 650 1,5. Prieš pat 40 ml ląstelių suspensijos inokuliacijos, 20 ml imituojamą skrandžio tirpalo buvo įtraukta į terpės (1 l) yra bioreaktoriuje. PH pasiekiamas naudojant 2 M NaOH.
Šešiasdešimčiai minučių po to, kai ląstelių inokuliacijos, deguonies buvo pakeistas azoto atomu, prie gauti anaerobinis atmosferą.

• Rizikos vertinimas skrandžio vėžio, susijusio su asbestozės: byla report
• Baktericidinis veikla katijoninių steroidų CSA-13 ir cathelicidin peptido LL-37 prieš Helicobacter pylori imituojant skrandžio sulčių