Zapojenie TNF-a v up-reguláciu CXCR4 expresie v karcinómu žalúdka, vyvolané Helicobacter pylori

Zapojenie TNF-a v up-reguláciu expresie CXCR4 v karcinómu žalúdka, vyvolané Helicobacter pylori
abstraktné
pozadia
H. pylori, ktorého infekcia zvyšuje nádorové invazívnosti a metastáz, je všeobecne označený ako najsilnejší riziko faktorom pre vývoj rakoviny žalúdka. To sa nezdá byť náhoda, že tam je tiež zvýšená expresia CXCR4 a zrejmý zapojenie do žalúdka nádorových metastáz. Cieľom tejto štúdie sa snaží vyšetrovať a ďalej vytvoriť spojitosť medzi nimi. H. pylori je silný induktor TNF-a, TNF-α, či nádor promótor, sa podieľa na indukcii expresie CXCR4 H. pylori aj pri výskume v tejto štúdii.
Metódy
Expression z CXCR4, TNF-a, IL-6 a IL-1 mRNA bola stanovená pomocou PCR v reálnom čase. Expresie CXCR4 proteín bol detekovaný Western Blot. Koncentrácia TNF-a, IL-6 a IL-1 v supernatante bunkových kultúr boli merané pomocou súpravy Quantikine ELISA. Zrušiť TNF-α expresiu v bunkách HGC27, bol použitý TNF-a RNAi plazmid, aby ich transfekciu. Výsledky
Hladiny CXCR4 a TNF-a mRNA boli významne vyššie u H. pylori pozitívnych karcinómov žalúdka (n = 19) v porovnaní s H. pylori tie-negatívne (n = 15). A následne Spearmanův pozičné korelačný test ukázal, existovala pozitívna korelácia medzi hladinou mRNA CXCR4 a to TNF-alfa v 34 primárnych karcinómov žalúdka. Ďalšie výsledky nasledovne: Vyjadrenie CXCR4 a TNF-alfa bola up-regulovaná v žalúdku nádorových buniek MKN45 a HGC27 po infekcii s H. pylori 26695 (CAG PAI +) alebo TX30 (CAG PAI -); Indukcia expresie CXCR4 H. pylori bola významne inhibovaná neutralizačné TNF-α protilátky, infliximab; CXCR4 expresie bola up-regulovaná v bunkách MKN45 po ošetrení s exogénnym TNF-a alebo ko-kultúre s makrofágy, a bol downregulated v HGC27 buniek po transfekciu s TNF-a RNAi plazmidu. Došlo k výraznému nárastu migrácie MKN45 buniek ošetrených H. pylori 26695 a silná inhibícia, kedy AMD 3100, antagonista CXCR4, alebo infliximab, bol pridaný.
Závery
našich zistení ukázali, že H. pylori upreguluje CXCR4 expresie v karcinómu žalúdka prostredníctvom TNF-a.
pozadie
je dobre prijímané, že Helicobacter pylori (H. pylori) je významným rizikovým faktorom pre vývoj rôznych žalúdočných ochorení, najmä chronické gastritídy, peptické vredy, žalúdočnej sliznice-spojené lymfatického tkaniva lymfómu a rakoviny žalúdka, a to je uznal, že interakcia medzi H. pylori a epitelové bunky prispieva k takému vývoju. V skutočnosti, H. pylori infekcie vyvoláva zápal v mikroprostredie žalúdku spojené s indukciou prozápalových cytokínov, ako je TNF-a (TNF-a), interleukínu-1β (IL-1) a IL-6 [1-3 ], čo robí žalúdočné karcinogenéze priaznivé.
H. pylori tiež zvyšuje nádorové invazívnosti a metastázovaniu [4-6], hoci mechanizmus ešte nie je dobre známa. Proces nádorových metastáz nie je náhodný a rôzne nádory majú svoje preferované navádzací stránky. Rovnako ako s ľuďmi leukocytov, migrácia nádorových buniek je kriticky regulovaná systémom receptora chemokiny /chemokiny. Ďalšie našej pozornosti je prístrešok na CXCR4, najbežnejšie receptor chemokínu nadmerne exprimovaný v rade nádorov (rakovina žalúdka vrátane) zďaleka [7, 8]. Štúdie ukázali, os CXCL12 /CXCR4 je zapojený do žalúdka nádorových metastáz [9]. Preto vzbudzuje veľký záujem nájsť súvislosť medzi infekciou H. pylori a CXCR4 nadmernej expresii u rakoviny žalúdka.
Jedným z kľúčových chemických mediátorov podieľajúcich sa rakoviny zápaly spojené so TNF-α, a tam je teraz dostatok dôkazov vo svojom zapojení propagácia a progresiu experimentálnej a ľudskej rakoviny [10, 11]. Verný svoje meno, vysoké dávky regionálne TNF-a môžu viesť k nekróze krvácavé prostredníctvom selektívnej deštrukcii nádoru krvných ciev. Avšak, to môže neočakávane pôsobí ako endogénne promótor nádoru, keď sa vyrába v mikroprostredie nádoru. Náš záujem je v dôsledku toho treba venovať zapojeniu do indukciu expresie CXCR4 H. pylori, silného induktora TNF-a, ktorý je známy pre upregulate rad cytokínov, chemokiny, adhéznych molekúl a rastových faktorov rakoviny.
metódy
karcinómu žalúdka bunkové línie a tkanivové vzorky
ľudský žalúdočné rakovinové bunky MKN45 a HGC27 boli získané od keygen Biotech. Co. (Nanjing, Čína) a boli kultivované v médiu RPMI 1640 doplnenom 10% fetálneho séra hovädzieho dobytka, pri teplote 37 ° C vo vlhkom inkubátore s 5% CO 2. 34 primárne vzorky karcinómu žalúdka boli získané od pacientov v prevádzke so všetkými ich informovaného súhlasu v Shengjing nemocnice, Chinese Medical University, a boli zmrazené v tekutom dusíku ihneď po chirurgickom odstránení. Haematoxylin- a eosin-farbenie rezy boli pripravené pre vyhodnotenie percenta nádorových buniek, a iba vzorky s > 70% nádorových buniek boli vybrané na analýzu. Táto štúdia bola vykonaná so súhlasom etickej komisie Čínskej lekárskej univerzity. Všetky experimenty boli vykonané najmenej trikrát.
Makrofágové bunkové línie RAW264.7
makrofágov buniek RAW 264.7 boli poskytnuté v American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA), a bola udržiavaná v Eaglovho média Dulbecco , doplnenom 10% fetálneho séra hovädzieho dobytka, pri teplote 37 ° C vo vlhkom inkubátore s 5% CO 2.
kmeňov H. pylori,
H. pylori kmeň 26695 (ATCC 700392, CAG PAI +) a TX30 (ATCC 51932, CAG PAI -) boli ponúkané od ATCC (Rockville, MD, USA). Boli pestované na ovčej krvnej agarové dosky pri teplote 37 ° C za mikroaerofilní podmienok. Baktérie boli prevedené po 48 hodinách do Brucella bujóne obsahujúcom 5% fetálne hovädzie sérum po dobu 24 hodín. Multiplicitě infekcie 100 bol použitý vo všetkých štúdiách.
V reálnom čase reverznej transkripcie-PCR s
Celková RNA bola izolovaná z tkanív a bunkových línií pomocou TRIzolu (Takara, Dalian, Čína) v súlade s protokolom, ktoré poskytla výrobcov. cDNA sa syntetizuje za použitia Takara RNA PCR Kit 3.0 (Takara, Dalian, Čína) v celkovom objeme 10 ul, ktorý obsahuje AMV reverznej transkriptázy, 0,5 ul; náhodná 9 primeru, 0,5 ul; 25 mM MgCl 2, 2 ul; 10 × RT Buffer, 1 ul; dNTP zmesi (10 mM každý), 1 ul; inhibítor RNase, 0,25 ul; RNA 1 ul; dH 2O, 3,75 ul. Podmienky pre RT boli nasledovné: 30 ° C počas 10 minút, 42 ° C počas 25 minút, 99 ° C po dobu 5 minút a 5 ° C po dobu 5 minút. Real-time PCR bola vykonaná s použitím systému LightCycler spoločne s LightCycler DNA hlavného SYBR Green I Kit (Roche Diagnostics). Celkový objem je 20 ul, obsahujúci 25 mM MgCl 2, 3 ul; 10 × Buffer, 5 ul; 10 um dopredu Primer, 1 ul; 10 uM reverznej primer, 1 ul; LightCycler DNA Majster SYBR Green I, 2 ul; cDNA, 2 ul; dH 2O, 6 ul. Podmienky pre PCR boli nasledujúce: 50 ° C po dobu 2 minút, 95 ° C počas 10 minút a potom 40 cyklov 5 sekúnd pri 95 ° C a 20 sekúnd pri teplote 60 ° C. Upratovanie gen glyceraldehyd-3-fosfát dehydrogenázy (GAPDH
) bol použitý ako vnútorná kontrola. Génová expresia bola kvantifikovaná porovnávacie metódou CT, normalizovanie hodnôt CT k GAPDH stroje a výpočtom relatívnych hodnôt expresie. Primer sekvencie boli poskytnuté Takala (Dalian, Čína) takto: CXCR4
dopredu, 5'-GAGGAAATGGGCTCAGGG-3 ', reverzné, 5'-AGTCAGCAGGAGGGCAGGGA-3'; TNF-α
dopredu, 5'-AGTGACAAGCCTGTAGCCC-3 ', 5'-reverznej, GCAATGATCCCAAAGTAGACC-3'; IL-1β
dopredu, 5'-CCACCACTACAGCAAGGG-3 ', reverzné, 5'-GAACTGGGCAGACTCAAA-3'; IL-6
dopredu, 5'-CCTTCGGTCCAGTTGCCTTCT-3 ', reverzné, 5'-GCATTTGTGGTTGGGTCA-3'; GAPDH
dopredu, 5'-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3 ', reverzné, 5'-AAAGGTGGAGGAGTGGGT-3'.
Western blotting
Bunkové lyzáty boli pripravené s vzorkovým pufrom [50 mmol /l Tris-HCl (pH 6,8 ), 100 mmol /l DTT, 2% SDS, 0,1% brómfenolovej modrej, 10% glycerolu a], a boli podrobené 12% dodecylsulfát sodný (SDS) s /akrylamidovém gélu. Proteíny na akrylamidovém gélu boli prenesené na nylonovú membránu, ktorá bola blokovaná cez noc (4 ° C v PBS s 0,1% Tween a 10% sušeného mlieka). Polyklonálne protilátky pre CXCR4 (Santa Cruz, CA, America) a zodpovedajúce sekundárne protilátky (Santa Cruz, CA, America) boli aplikované pred imunoblotováním. Ľudského génu β-Aktinová
(Santa Cruz, CA, Amerika) bol použitý ako vnútorná kontrola. Škvrny boli vizualizované s FX Pre Plus systém (Bio-Rad) a kvantifikované s použitím Scion Image 4.03 softvéru. Interference RNA
TNF-alfa RNAi plazmid a nonsilencing kontrolné RNAi plazmid boli zakúpené od Takala (Dalian, Čína). Bunky boli schovať do 24-jamkové doštičky v hustote 2 x 10 5. Nasledujúci deň boli bunky transfekovány s TNF-alfa siRNA alebo siRNA ovládanie pomocou Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Veľká Británia) v súlade s pokynmi výrobcu.
ELISA na cytokínov v supernatante bunkových kultúr
koncentrácie TNF-a, IL-1β a IL-6 v supernatante bunkových kultúr boli merané za použitia Quantikine ELISA kitu (Boster, Wuhan, Čína) podľa inštrukcií výrobcu. Citlivosť testu bola 2 pg /ml TNF-a, 4 pg /ml pre IL-1 a 4 pg /ml pre IL-6.
Migrácia testy
migráciu kultivovaných buniek bola testovaná s použitím Matrigelu invázie komora (formát 24 jamiek, 8 um pórov, BD Pharmingen). Bunky (5 x 10 5) boli pridané do hornej komory a médiá doplneného CXCL12 sa pridá (100 ng /ml, Sigma) do dolnej komory. Migračné testy boli inkubované po dobu 18 hodín pri teplote 37 ° C a 5% CO 2. Migrovaných buniek na spodnom povrchu boli zafarbené za použitia 1% toluidínová modrá po fixácii sa 100% metanolom. Pre každú Transwell, počet migrovaných buniek v 10 stredný výkon poľa (x 20) sa počíta.
Štatistická analýza
Mann-Whitney U-test
bol použitý pre porovnanie expresie mRNA medzi H. pylori-pozitívnych a H. pylori-negatívne nádory. Korelácia medzi CXCR4 prejavu a TNF-alfa expresie vo vzorkách s karcinómom žalúdka bola analyzovaná pomocou Spearmanova rank porovnávací test. Expresie mRNA v bunkových líniách žalúdku bola porovnaná za použitia Studentovho t-test alebo
jeden spôsob, ANOVA. Štatistická analýza bola vykonaná s použitím SPSS verzia 11.0 (SPSS, Chicago, IL, USA). Rozdiel bol považovaný za významný pri P
-hodnota bola < 0,05.
Výsledky
Expresia CXCR4 a TNF-α mRNA v primárnych karcinómov žalúdku
CXCR4 mRNA bola stanovená pomocou real-time PCR s reverznej transkripcie v 34 karcinómov žalúdka, a jeho expresie v každej vzorke bolo štandardizované, aby GAPDH
výraz. Výsledky ukázali, jej úroveň významne vyššia u H. pylori pozitívnych karcinómov žalúdka (n = 19) v porovnaní s H. pylori tie-negatívne (n = 15) (7,2 násobne, P Hotel < 0,01, obrázok 1A). V rovnakej kohorte nádorov, expresie TNF-α mRNA bola tiež detekovaná v reálnom čase s reverznej transkripciou PCR, a zistilo sa, silnejšie v H. pylori pozitívnych karcinómov žalúdka v porovnaní s H. pylori-negatívne ty (4,3 násobne, P Hotel < 0,01, obrázok 1B). Spearmanův korelačný rank testu ďalej overená pozitívnu koreláciu CXCR4 expresie TNF-a v nasledujúcich 34 karcinómov žalúdka (P
< 0,01, obrázok 1C). Obrázok 1 Expresia CXCR4 a TNF-a mRNA v primárnych karcinómov žalúdka pomocou real-time PCR. (A) a (B) H. pylori-pozitívnych karcinómov žalúdka (šedé stĺpce, n = 19), vyjadrené vyššiu úroveň CXCR4 (A) a TNF-a (B) mRNA v porovnaní s H. pylori-negatívnych karcinómov žalúdka (čierne stĺpce , n = 15), * P Hotel < 0.01. Horizontálne línie: Prostriedky úrovni mRNA. (C) Stupeň CXCR4 mRNA korelovala pozitívne s tým TNF-a mRNA v 34 karcinómov žalúdka, P Hotel < 0.01. Čierny kosoštvorec: H. pylori-negatívnych karcinómov žalúdka; šedý kosoštvorec :. H. pylori-pozitívnych karcinómov žalúdka
Indukcia CXCR4 a TNF-α expresie H. pylori v nádorových bunkách žalúdku
v reálnom čase, PCR a westernovým prenosom boli použité na detekciu expresie v CXCR4 MKN45 a HGC27 bunky (obrázok 2A, B); a ukazujú, že významne up-regulované v nich po infekcii H. pylori 26695 po dobu 24 hodín (P
< 0,01, v danom poradí, obrázok 2A, B). Následne boli ošetrené CAG PAI-negatívne H. pylori, TX30 určiť jeho účasť v up-reguláciu, a to je tiež zistené, že indukuje CXCR4 výraz v MKN45 a HGC27 buniek (P Hotel < 0,01, respektíve Obrázok 2A , B). Obrázok 2 Expresia CXCR4 a TNF-α v MKN45 a HGC27 buniek po infekcii H. pylori. (A) a (B), CXCR4 expresie bola up-regulovaná v MKN45 a HGC27 bunky po infekcii H. pylori 26695 (* P
< 0,01, v danom poradí, vs
H. pylori-) alebo TX30 (* P
< 0,01, respektíve vs
H. pylori-). (C) a (D), TNF-α expresie bola zvýšená v MKN45 a HGC27 bunky po infekcii H. pylori 26695 (* P
< 0,01, v danom poradí, vs
H. pylori-) alebo TX30 (* P Hotel < 0,01, respektíve vs
H. pylori-). Dáta sú vyjadrené ako priemer ± SD, n = 3
Vplyv infekcie H. pylori na TNF-a expresie bol ďalej vyšetrovaný za použitia real-time PCR a ELISA, a zistilo sa, že detekcia infekcie 26695 alebo TX30 pre 12 doba môže viesť ako k väčšej expresie TNF-a mRNA (P
< 0,01, v danom poradí) a väčší sekréciu TNF-alfa proteínu do kultivačného supernatantu (P
< 0,01, v tomto poradí) v MKN45 a HGC27 bunkami (obrázok 2c, d).
Vplyv infliximabu neutralizačné protilátky proti TNF-a, na indukciu CXCR4 prejave H. pylori
zistenie up reguláciu TNF-α prejavu v tomto prípade priniesla nás k ďalšiemu výskumu na jeho zapojenie do indukciu CXCR4 prejavu H. pylori. Neutralizačné TNF-α protilátky, infliximab (4 ug /ml, Sigma), potom boli použité na liečbu a MKN45 HGC27 buniek po infekcii 26695, a indukcia CXCR4 bola významne inhibovaná (P
< 0,01, v danom poradí , 3A, B). Podobné výsledky boli dosiahnuté, keď boli tieto bunky ošetrené infliximabom po infekcii TX30 (P
< 0,01, v danom poradí, Figure3C, D). Obrázok 3 Účinok infliximabu na indukciu expresie CXCR4 H. pylori. (A) a (B), CXCR4 up-regulácia vyvolanej H. pylori 26695 bola inhibovaná v MKN45 a HGC27 buniek po liečbe infliximabom, * P
< 0,01, v tomto poradí, vs
26695 + inf. (C) a (D) CXCR4 up-regulácia vyvolanej H. pylori TX30 bola tiež inhibovaná MKN45 a HGC27 buniek po liečbe infliximabom, * P
< 0,01, v tomto poradí, vs
TX30 + inf. Dáta sú vyjadrené ako priemer ± SD, n = 3 inf :. Infliximab
Zvýšená expresia CXCR4 expresie v nádorových bunkách žalúdka pomocou TNF-a
MKN45 buniek, ktoré tajné nižšiu úroveň TNF-α proteínu, boli liečené 1, 10, alebo 50 ng /ml TNF-α (Sigma) počas 6 hodín v snahe ďalej skúmať úlohu TNF-a v up-reguláciu CXCR4 prejavu, a v reálnom čase, PCR a hybridizácia na detekciu Western ukázalo, že bola významne up-regulovaná v spôsobom závislým od dávky (P
< 0,01, Obrázok 4A, B), a dokonca o 15,8 záhybov s 50 ng /ml liečby TNF-a. Obrázok 4 Zvýšená expresia CXCR4 expresiu v rakovinových bunkách žalúdka pomocou TNF-a. (A) a (B), CXCR4 expresie bola up-regulovaná v MKN45 buniek exogénnym TNF-a v spôsobom závislým od dávky, * P
< 0.01. (C) a (D) kultivácia systém MKN45 a RAW264.7 bunky exprimovali viac CXCR4, * P
< 0.001, vs
M; ** P Hotel < 0.001, vs
R. Upregulace CXCR4 prejavu bola inhibovaná po liečbe infliximabom *** P Hotel < 0.001, vs
M + R + inf. M: MKN45; R: RAW264.7; inf: infliximab. (E) Expresia TNF-a bol prítomný v HGC27 buniek po transfekciu s TNF-a RNAi plazmidu. Výraz (F) CXCR4 mRNA bola downregulated v HGC27 buniek po transfekciu s TNF-a RNAi plamid, * P
< 0.001, vs
No RNAi; ** P Hotel < 0.001, vs
Control RNAi. Dáta sú vyjadrené ako priemer ± SD, n = 3
Ďalej je CXCR4 výraz v ko-kultivačný systém bol skúmaný, pretože tumor asociované makrofágy tiež slúžiť ako zdroj TNF-a v žalúdočnej rakoviny mikroprostredie. Čo-kultúra buniek MKN45 RAW264.7 bunkami po dobu 24 hodín, uviedla, že podstatne viac vyjadrená CXCR4 mRNA a proteín (P Hotel &0,001, obr 4C, D); Tento nárast sa však významne inhibovaná infliximab (P Hotel &0,001, obr 4C, D)
A konečne, endogénne TNF-α bol zameraný na vyhodnotenie nariadenia o CXCR4 expresiu v bunkách, ktoré HGC27 tajomstvo vyšší. úroveň TNF-a proteínu. TNF-alfa RNAi plazmidu bol použitý na transfekciu buniek HGC27, a zodpovedajúcim spôsobom nonsilencing RNAi plazmid bol použitý v proťajšku ako kontrola. Bolo pozorované, že expresie TNF-a bol prítomný v HGC27 buniek po transfekciu s TNF-a RNAi plazmidu (obr 4E). Potom výraz CXCR4 bola detekovaná pomocou PCR v reálnom čase, a to bolo uvedené v detekcii, že po transfekciu s TNF-a RNAi plazmidu expresie CXCR4 mRNA bola významne downregulated v HGC27 bunkách, v porovnaní s bunkami s kontrolnou RNAi alebo bunky bez RNAi (P Hotel &0,001, v danom poradí, obrázok 4F).
Indukcia cytokínov makrofágy H. pylori
real-time PCR a ELISA boli použité na vyhodnotenie účinku H. pylori 26695 na expresiu cytokínov v RAW264.7 bunkách, pretože je všeobecne známe, že cytokíny sú zapojené do chronických zápalových procesov vyvolaných H. pylori. Detekcia PCR v reálnom čase ukázala expresiu TNF-a, IL-1 a IL-6 mRNA bola up-regulovaná v 26695-ošetrených buniek v porovnaní s 26695-neošetrených buniek (TNF-a, P Hotel &0,001, IL-1β , P Hotel &0,001 a IL-6, P Hotel &0,001, Obrázok 5A). A Elisa Výsledky ukázali viac proteínov z TNF-a, IL-1 a IL-6 boli vylučované do kultivačného supernatantu na 26695 buniek ošetrených v porovnaní s 26695-neošetrených buniek (TNF-a, P Hotel &0,001, IL-1β , P Hotel &0,001 a IL-6, P Hotel &0,001, Obrázok 5B). Obrázok 5 Indukcia cytokínov v makrofágoch H. pylori. (A) a (B) Expresia TNF-a, IL-1 a IL-6 bola up-regulovaná v 26695 liečených RAW264.7 buniek, * P
< 0.001, vs
neošetrené bunky. (C) a (D) ani IL-1β, ani IL-6 môže upregulate CXCR4 expresiu v bunkách MKN45. Dáta sú vyjadrené ako priemer ± SD, n = 3
Nakoniec MKN45 bunky boli ošetrené s exogénnym IL-1 (50 ng /ml) a IL-6 (50 ng /ml), v danom poradí, aby sa vylúčila možnosť, že IL -1β a IL-6 môže upregulate CXCR4 expresiu, ako je TNF-a. Ani IL-1β, ani IL-6 bolo zistené, že upregulate CXCR4 expresie významne (obrázok 5C, D). Analýza
Migrácia
analýza Migrácia bola vykonaná s použitím Matrigelu invázne komory v snahe zistiť, či je up-regulovaná CXCR4 bol funkčný , V počiatočnej fáze experimentu s 100 ng /ml CXCL12 v dolnej komore, bolo významné zvýšenie (až do 4,5 záhyby) v migrácii MKN45 buniek s 26695 zaobchádzanie v hornej komore, v porovnaní s kontrolnými bunkami bez 26.695 liečba (P Hotel < 0,001, obrázok 6A). Neskôr však bolo zvýšenie významne inhibovaná, keď AMD 3100 (1 ug /ml, Sigma), antagonista CXCR4 alebo infliximab, bol pridaný (P Hotel < 0,01, v danom poradí, obrázok 6A). Obrázok 6 štúdium migrácie. (A) MKN45 bunky vykazovali významné zvýšenie ich migrácia po ošetrení 26695, * P
< 0.001, vs
kontrolou. Nárast migrácia MKN45 buniek indukovaných 26695 bol potlačený, keď AMD 3100 (** P Hotel < 0,01, vs
26695 + AMD), alebo infliximab (*** P Hotel < 0,01, vs pridá sa
26695 + INF). AMD: AMD3100; inf: infliximab. (B) TNF-α zvýšená migrácia MKN45 buniek, * P Hotel < 0.001, vs
kontrolou. Ani IL-1β, ani IL-6 môže zvýšiť migráciu buniek MKN45 výrazne. Dáta sú vyjadrené ako priemer ± SD, n = 3
Okrem toho bol tiež skúmaný vplyv cytokínov na migráciu buniek MKN45, a zistilo sa, TNF-α (50 ng /ml), k zvýšeniu migrácia buniek MKN45 významne (P Hotel < 0,001, obrázok 6B). Avšak, bolo preukázané, ani IL-1β (50 ng /ml), ani IL-6 (50 ng /ml) na podporu migrácie buniek MKN45 výrazne (obrázok 6B).
Diskusia
H. pylori je obviňovaný infikovať asi 50% svetovej populácie ako definitívny žalúdočné karcinogénne pre človeka [12]. Patogenéza infekcii často zahŕňa zápal slizníc, poškodenie, alebo žalúdočné atrofia, a vyžaduje úzke interakcie medzi baktériami a žalúdočných epiteliálnych buniek, aktiváciu signálnej dráhy, zmenu hostiteľskej bunkovej funkcie, a vedie k chronickej epitelových reakcií [13.14]. V súčasnej dobe existuje značné dôkazy spájajúce chronický zápal do ľudských nádorov [15-17], a konkrétne, H. pylori indukovanej chronický zápal a cytokíny v lokálnom mikroprostredie žalúdku slúži ako najčastejších spolupracovníkov [18-20]. Štúdia zdôrazňuje za následok, že slizničnej úrovne TNF-a mRNA bola významne vyššia u baktérií H. pylori pozitívnych pacientov než u negatívnych pacientov pomocou kvantitatívnej PCR v reálnom čase, a dva žalúdočné rakovinové bunky tiež vylučovaný proteín TNF-a in vitro. Okrem toho sa predpokladá, že TNF-α môže byť zapojený do H. pylori pozitívnej žalúdočnej karcinogenéze ako nenahraditeľný a silné linker medzi zápalu a rakoviny [21]. Aj keď
mechanizmu indukcie TNF-a H. pylori zostáva relatívne nejasný, rodina proteínov bolo popísané v poslednom desaťročí, vrátane Helicobacter pylori-membránový proteín-1 (HP-MP1) a TNF-a indukujúce proteín (Tipα) [22-24]. Tipα génov, ktoré možno identifikovať z Helicobacter pylori kmeň 26695, je homológne s HP-MP1 génu s 94,3% homológie, a to ako z nich vykazujú silnú schopnosť indukovať génovú expresiu TNF-alfa. V štúdii, H. pylori 26695 bolo zistené, že TNF-α upregulate expresie významne v MKN45 a HGC27 buniek a CAG PAI negatívny kmeň TX30 tiež bol Videli ju vyvolať samozrejme, čo môže byť čiastočne spôsobené tým, že HP-MP1 /Tipα rodina nie je v CAG PAI regióne. Bolo však tiež uvedené, že účinok TX30 na TNF-α indukcii bol slabší ako 26695 (2,3 záhyby vs
3.1 záhyby v bunkách MKN45), z ktorých vyplýva, H. pylori výrobky CAG PAI môžu byť tiež zapojené do indukcie. V skutočnosti to bolo oznámené, že ČAGA H. pylori by mohlo vyvolať TNF-a vo vzorkách žalúdočné biopsia rakoviny [25]. Okrem toho sa čistí H. pylori bolo tiež zistené, Ureáza prinútiť MKN45 bunky k expresiu TNF-a [26].
TNF-α, čo je kľúčový cytokín v mnohých chronických zápalových ochorení, bol pôvodne označený ako sérový faktor pre indukciu hemoragickej nekrózy transplantovaných tuhých nádorov u myší. Avšak, v súčasnej dobe je bežne identifikovaná ako nádorový promótor v lokálnom mikroprostredie nádoru, a teda delécií alebo inhibíciu Predpokladá sa, že zníženie výskytu experimentálnych nádorových ochorení. TNF-a /TNF-R1 zraziť myši sú rezistentné voči chemicky indukovaných karcinogenézy [27, 28]. To je často detekovaná u biopsiou z rôznych ľudských rakovín, vytvorené buď epiteliálnych nádorových buniek alebo buniek strómy. Okrem toho je tiež zistené, aj keď v malom množstve, k sekrécii mnohých rakovinových línií in vitro bez zápalovými stimulmi, aj keď tento mechanizmus ešte nie je celkom jasná.
TNF-α bolo zistené, že sa podieľajú len na transformáciu a proliferáciu buniek , ale aj v nádorových metastáz. Takéto zistenia bola pôvodne založená na zvieracom modeli s karcinómom hrubého čreva, v ktorom injekcia LPS zvýšenú vývoj závislé na produkcii TNF-a pľúcne metastázy u hostiteľských buniek [29]. Nasledujúce výsledky ukázali zvýšenú metastázovaniu nádoru inhibovaný neutralizuje TNF-a protilátky [30]. Tieto viedlo k nášmu špekulácii, že jeden zo základných mechanizmov TNF-a v nádorových metastáz, môže byť v súvislosti s up-reguláciu chemokiny /chemokinových receptorov. Po prvé, došlo k výraznému upregulace CXCR4 do buniek karcinómu žalúdka po tom, čo boli liečení exogénnym TNF-a. Došlo k ďalšiemu zrejmé upregulace CXCR4 expresiu v rakovinových bunkách potom, čo boli spoločne kultivované s makrofágy, alternatívneho zdroja TNF-a v žalúdku rakoviny mikroprostredie. Ako sa očakávalo, táto up-regulácia by mohla byť inhibovaný TNF-a infliximabu neutralizačných protilátok. Došlo v dôsledku značného poklesu expresie CXCR4 v HGC27 buniek po RNAi sa použil zrušiť expresie TNF-a v týchto bunkách, čo naznačuje, endogénne TNF-a môže tiež upregulate CXCR4 výraz. Celková zistenie viedlo k záveru, že naša TNF-α, sa sama podieľa na metastázy rakoviny žalúdka, zvyšuje aktiváciu CXCR4 výraz.
Nadmerná expresia CXCR4, ktorého zapojenie do rôznych ľudských nádorov je dobre známe, sa často pozorované v žalúdočných rakovinové tkanive k zvýšeniu žalúdočnej nádorových metastáz. Niektoré ľudské bunky karcinómu žalúdka taktiež exprimujú CXCR4 mRNA a proteínu na vysokej úrovni [7, 8]. Naša štúdia ukázala, H. pylori infekcie zvýšená migrácia MKN45 buniek cez up-reguláciu CXCR4 prejavu. Liečba antagonistom AMD3100 CXCR4 viedlo k výraznému potlačeniu migrácie MKN45 buniek in vitro. Ďalšie štúdie ukázali, AMD3100 významne potlačený rozvoj peritoneálnej karcinosou na myšom modeli rakoviny žalúdka, čo bolo preukázané zníženie rastu nádoru a tvorby ascitický tekutiny [9]. Predchádzajúce výskumy viedli k záveru, že naša CXCR4 nadmerná expresia vo vzorke biopsie primárnej rakoviny žalúdka môže slúžiť ako predoperačnom vyhodnotení rizík pre výskyt peritoneálnej karcinosou. Zapojenie
makrofágy 'v karcinogenézy a invázie nádoru a metastáz [31, 32 ] všeobecne je vinu motivovať TAM (Tumor asociovaný makrofágy), hlavným zdrojom TNF-a v mikroprostredie nádoru, uvoľniť rad rastových faktorov, cytokínov a zápalových mediátorov. Štúdia odhalila, došlo k výraznej expresiu TNF-a indukovanej H. pylori, a zároveň zvýšenie expresie IL-1 beta a IL-6 v RAW264.7 bunkách, avšak táto zmena sa nepodarilo indukovať CXCR4 expresiu v bunkách MKN45.
Štúdia nakoniec pripísať abnormálnu aktiváciu NF-kB v rakovinových bunkách s nadmernou sekréciou TNF-a, ktorého úloha v CXCR4 up-reguláciu sa potom predpokladá, že súvisia s dráh sprostredkovaných NF-kB. Iné nálezy ukázali, antagonisty TNF-α môže inhibovať upregulaci CXCR4 expresie H. pylori, a obaja to a antagonisti CXCR4 môže potlačiť zvýšenú migráciu buniek karcinómu žalúdka in vitro. Tieto výsledky ukazujú, že samotné tieto antagonistu, alebo v kombinácii s inými terapiami, môže slúžiť ako účinná terapia pre pacientov s rakovinou žalúdka.
Závery
TNF-α sa podieľa na up-reguláciu CXCR4 expresie v karcinómu žalúdka vyvolané H. pylori.
deklarácia
Poďakovanie
Táto práca bola podporená grantom z oddelenia školstva, provincia Liaoning, Čína (2009A751).
autorov pôvodné predloženej súbory obrazov
Nižšie sú uvedené odkazy k autorov pôvodných predložených súborov pre obrázky. "Pôvodný súbor na obrázku 1 12885_2009_2218_MOESM2_ESM.tiff autorského 12885_2009_2218_MOESM1_ESM.tiff autorov pôvodného súboru pre" pôvodného súboru pre Obrázok 3 12885_2009_2218_MOESM4_ESM.tiff autorského Obrázok 2 12885_2009_2218_MOESM3_ESM.tiff autorského pôvodného súboru na Obrázok 4 pôvodného súboru 12885_2009_2218_MOESM5_ESM.tiff autorského na obrázku 5 pôvodný súbor 12885_2009_2218_MOESM6_ESM.tiff autorov na obrázok 6 protichodnými záujmami
autori vyhlasujú, že nemajú žiadne protichodné záujmy.

• Interleukín-23A je spojená s rastom nádoru u Helicobacter pylori-súvisiace ľudské žalúdočné cancer
• Medzi najbežnejšie robotické bariatrickej postupy: revízie a technická aspects