Osallistuminen tuumorinekroositekijä-α ylössäätelyyn CXCR4 ilmentymisen mahasyövän aiheuttama Helicobacter pylori

Osallistuminen tuumorinekroositekijä-α ylössäätelyyn CXCR4 ilmentymisen mahasyövän aiheuttama Helicobacter pylori
Abstract
tausta
H. pylori, jonka infektio lisää kasvaimen invasiivisuus ja etäpesäkkeiden, on merkitty yleisesti vahvin riski tekijä mahalaukun syövän syntyyn. Se ei näytä olevan sattumaa, että siellä on myös yli-CXCR4 ja ilmeinen osallistumista mahasyövässä etäpesäkkeitä. Tutkimuksen tavoitteena tutkimus pyrkii selvittämään ja edelleen luoda yhteys niiden välille. H. pylori on indusoi TNF-α, onko TNF-α, kasvain promoottori, on mukana induktioon CXCR4 ilmaisun helikobakteerin oli myös alle tutkimusta tässä tutkimuksessa. Tool Menetelmät
Expression CXCR4: n, TNF-α, IL-6 ja IL-1β mRNA määritettiin reaaliaikaisella PCR: llä. CXCR4-proteiinia ilmentyminen havaittiin Western-blottauksella. Pitoisuuksia TNF-α, IL-6 ja IL-1β soluviljelmässä supernatanteissa mitattiin käyttäen Quantikine Elisa kit. Kumota TNF-α ilmentymisen HGC27 soluissa TNF-a: RNAi plasmidia käytettiin transfektoimaan niitä.
Tulokset
tasot CXCR4: n ja TNF-α-mRNA oli merkittävästi korkeampi H. pylori-positiivisia syöpien (n = 19) verrattuna helikobakteeri-negatiivisia (n = 15). Myöhemmin Spearmanin rank korrelaatio koe osoitti oli positiivinen korrelaatio tason CXCR4 mRNA ja että TNF-α 34 ensisijaisen syöpien. Muut tulokset seurasi: Expression of CXCR4 ja TNF-α oli yläreguloituja mahasyövässä solussa MKN45 ja HGC27 jälkeen infektion helikobakteeri 26695 (CAG PAI +) tai Tx30a (CAG PAI -); Induktion CXCR4 ilmaisun helikobakteerin estyi merkittävästi neutraloiva TNF-α-vasta infliksimabi; CXCR4 ilmentyminen säädeltiin vuonna MKN45 soluissa hoidon jälkeen eksogeenisen TNF-α tai co-kulttuurin makrofagi, ja sen vaimentua in HGC27 soluissa transfektion jälkeen TNF-a: RNAi-plasmidin. Oli huomattava kasvu muuttoa MKN45 käsiteltyjen solujen helikobakteeri 26695, ja voimakkaan eston kun AMD 3100, joka on CXCR4-antagonisti, tai infliksimabi, lisättiin.
Johtopäätökset
Tulosten osoitettiin, että H. pylori ylössäätelee CXCR4 ilmentyminen mahasyövässä kautta TNF-α.
Tausta
on yleisesti hyväksytty, että Helicobacter pylori (H. pylori) on vahva riskitekijä kehittää erilaisia ​​mahalaukun sairauksien, nimittäin krooninen gastriitti, mahahaava, mahalaukun limakalvon liittyvä imukudokseen lymfooma ja mahasyövän, ja todetaan, että vuorovaikutus helikobakteeri ja epiteelisolujen myötävaikuttaa tällaiseen kehitykseen. Itse asiassa, H. pylori-infektio indusoi tulehdusta mikroympäristön mahalaukun liittyy induktioon proinflammatoristen sytokiinien, kuten tuumorinekroositekijä-α (TNF-α), interleukiini-1β (IL-1β) ja IL-6 [1-3 ], mikä tekee mahasyövän suotuisat.
H. pylori infektio lisää myös kasvaimen invasiivisuus ja etäpesäkkeiden [4-6], vaikka mekanismi ei ole vielä täysin ymmärretty. Prosessi syövän etäpesäkkeiden ei ole satunnaista, ja erilaiset syövät ovat haluamansa itseohjautuva sivustoja. Aivan kuten leukosyyttiliikenteen, tuumorisolun muuttoliikettä kriittisesti säätelee kemokiinin /kemokiinireseptorin järjestelmässä. Toinen huomiomme vuodatetaan CXCR4, yleisin kemokiinireseptoria yliekspressoituvan sarjassa syöpiä (mahalaukun syöpä mukana) ylivoimaisesti [7, 8]. Tutkimukset ovat osoittaneet CXCL12 /CXCR4 akseli on mukana mahasyövässä etäpesäkkeiden [9]. Siksi se herättää suuria etuja löytää yhteys helikobakteeri-infektion ja CXCR4 yli-ilmentymisen mahasyövässä.
Yksi keskeisimmistä kemiallisten välittäjäaineiden sekaantuneet tulehdukseen liittyvä syöpiä on TNF-α, ja nyt on merkittävää näyttöä sen osallistumisesta edistämisessä ja etenemisen kokeellisen ja ihmisen syövissä [10, 11]. Nimensä, suuria annoksia alueellisten TNF-α voi johtaa verenvuotonekroosi kautta valikoivaa tuhoamista kasvaimen verisuonten. Se voi kuitenkin yllättäen toimia endogeenisen kasvaimen promoottori, kun tuotetun kasvaimen mikroympäristössä. Meidän korko on näin ollen laadittu osallistumisensa induktion CXCR4 ilmaisun helikobakteerin, indusoi tehokkaasti TNF-α, jonka tiedetään upregulaatioon sarjan sytokiinien, kemokiinien, adheesiomolekyylien ja kasvutekijöiden syövissä.
menetelmät
mahasyöpää solulinjoissa ja kudosnäytteiden
ihmisen mahasyöpä solu MKN45 ja HGC27 saatiin Keygen Biotech. Co (Nanjing, Kiina), ja viljeltiin RPMI 1640, johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia, 37 ° C: ssa kosteassa inkubaattorissa 5% CO 2. 34 ensisijainen mahasyöpä yksilöt hankittiin potilailta alle toimintaa kaikkien niiden tietoinen suostumus at Shengjing sairaalassa, Kiinan Medical University, ja jäädytettiin nestetypessä heti kirurgisen poiston jälkeen. Haematoxylin- ja eosiini-värjäys osat valmistettiin arvioimiseksi prosenttiosuuden kasvainsolujen, ja ainoastaan ​​näytteeksi, joista > 70% tuumorisoluja, valittiin analyysiin. Tutkimus toteutettiin hyväksyntää eettisen komitean Kiinan Medical University. Kaikki kokeet tehtiin vähintään kolme kertaa.
Makrofagisolulinjassa RAW264.7
makrofaagisolukantoja RAW 264.7 saatiin American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA), ja sitä pidettiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen elatusaineessa , johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia, 37 ° C: ssa kosteassa inkubaattorissa 5% CO 2.
helikobakteeri kantoja
helikobakteeri-kantaa 26695 (ATCC 700392, CAG PAI +) ja Tx30a (ATCC 51932, cag PAI -) tarjosivat ATCC (Rockville, MD, USA). Ne kasvatettiin lampaan verta agarmaljoille 37 ° C: ssa mikroaerofiilisissä olosuhteissa. Bakteerit siirrettiin 48 tunnin kuluttua otetaan Brucella liemi, joka sisälsi 5% naudan sikiön seerumia, 24 tunnin ajan. Infektiokertoimella 100 käytettiin kaikissa tutkimuksissa.
Reaaliaikainen käänteistranskriptiotuotteiden PCR
Yhteensä RNA eristettiin kudoksista ja solulinjoista mukaan Trizol (Takara, Dalian, Kiina) protokollan mukaisesti toimittamien valmistajille. cDNA syntetisoitiin käyttäen Takara RNA PCR 3,0 Kit (Takara, Dalian, Kiina) kokonaistilavuudessa 10 ui, joka sisältää AMV käänteistranskriptaasi, 0,5 ui; satunnainen 9 pohjamaali, 0,5 ui; 25 mM MgCl 2, 2 ui; 10 x RT-puskuria, 1 ui; dNTP-seosta (kukin 10 mM), 1 ui; RNaasi-inhibiittoria, 0,25 ui; RNA 1 ui; dH 2O, 3,75 ui. Olosuhteet RT olivat: 30 ° C: ssa 10 minuuttia, 42 ° C: ssa 25 minuuttia, 99 ° C: ssa 5 minuutin ajan, ja 5 ° C: ssa 5 minuutin ajan. Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen LightCycler järjestelmää yhdessä LightCycier DNA Master SYBR Green I Kit (Roche Diagnostics). Kokonaistilavuus on 20 ui, joka sisälsi 25 mM MgCl 2, 3 ui; 10 x puskuri, 5 ui; 10gM eteenpäin Primer, 1 ui; 10 uM reverse Primer, 1 ui; LightCyclerTM DNA Master SYBR Green I, 2 ui; cDNA, 2 ui; dH 2O, 6 ui. Olosuhteet PCR olivat: 50 ° C 2 minuuttia, 95 ° C: ssa 10 minuuttia ja sitten 40 sykliä 5 sekuntia 95 ° C: ssa ja 20 sekuntia 60 ° C: ssa. Housekeeping-geeni glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH
) käytettiin sisäisenä kontrollina. Geenien ilmentyminen kvantifioitiin vertaileva CT menetelmä, normalisoi CT arvot GAPDH
ja lasketaan suhteellinen ekspressio arvoja. Alukesekvenssit toimitti Takala (Dalian, Kiina) seuraavasti: CXCR4
eteenpäin, 5'-GAGGAAATGGGCTCAGGG-3 ', kääntää, 5'-AGTCAGCAGGAGGGCAGGGA-3'; TNF-α
eteenpäin, 5'-AGTGACAAGCCTGTAGCCC-3 ', kääntää, 5'-GCAATGATCCCAAAGTAGACC-3'; IL-1β
eteenpäin, 5'-CCACCACTACAGCAAGGG-3 ', kääntää, 5'-GAACTGGGCAGACTCAAA-3'; IL-6
eteenpäin, 5'-CCTTCGGTCCAGTTGCCTTCT-3 ', kääntää, 5'-GCATTTGTGGTTGGGTCA-3'; GAPDH
eteenpäin, 5'-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3 ', kääntää, 5'-AAAGGTGGAGGAGTGGGT-3'.
Western blotting
Solulysaatit valmistettiin näytepuskuriin [50 mmol /L Tris-HCI (pH 6,8 ), 100 mmol /l DTT: tä, 2% SDS, 0,1% bromifenolisinistä ja 10% glyserolia] ja alistettiin 12% natriumdodekyylisulfaattia (SDS) /akryyliamidigeelillä. Proteiinit on akryyliamidigeelillä siirrettiin nailonkalvolle, joka blokattiin yön yli (4 ° C PBS: ssä, jossa oli 0,1% Tween ja 10% maitojauhetta). Polyklonaalisia vasta-aineita CXCR4 (Santa Cruz, CA, Amerikka), ja vastaava toissijainen vasta-aineita (Santa Cruz, CA, America) sovellettiin ennen immunoblottauksella. Ihmisen geeni β-aktiini
(Santa Cruz, CA, America) käytettiin sisäisenä kontrollina. Täplät visualisoitiin FX pro plus-järjestelmä (Bio-Rad) ja kvantifioidaan Scion Image 4.03 ohjelmisto.
RNA-interferenssi
TNF-a RNAi plasmidi ja nonsilencing ohjaus RNAi plasmidi ostettiin Takala (Dalian, Kiina). Solut ympättiin 24-kuoppalevylle tiheydellä 2 x 10 5. Seuraavana päivänä solut transfektoitiin TNF-a siRNA tai Control siRNA käyttämällä Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Iso-Britannia) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti.
ELISA sytokiinien soluviljelysupernatanttia
pitoisuudet TNF-α, IL-1β: n ja IL-6 soluviljelysupernatanttia mitattiin käyttäen Quantikine Elisa -kittiä (Boster, Wuhan, Kiina) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Herkkyys määrityksessä oli 2 pg /ml TNF-α, 4 pg /ml IL-1β ja 4 pg /ml IL-6.
Migration määrityksissä
migraatio viljellyistä soluista määritettiin käyttäen Matrigel invaasio kammio (24-kuoppainen formaatti, 8 um huokosia, BD Pharmingen). -Soluja (5 x 10 5) lisättiin ylempään kammioon ja jota on täydennetty CXCL12 (100 ng /ml, Sigma) lisättiin alempaan kammioon. Migration määritykset inkuboitiin 18 tuntia 37 ° C: ssa ja 5% CO 2. Siirtynyt solujen alapinnan värjättiin käyttämällä 1% toluidiinisinisellä jälkeen kiinnitys 100% metanolilla. Kunkin transwell määrä siirtynyt solujen 10 keski- teho kentät (x 20) laskettiin.
Tilastollinen analyysi
Mann-Whitneyn U-
-testi käytettiin vertaamaan mRNA: n ilmentymisen välillä H. pylori-positiivinen ja helikobakteeri-syöpäkasvain. Korrelaatio CXCR4 ilmaisun ja TNF-α ilmentymistä mahasyövässä yksilöitä analysoitiin Spearmanin rank korrelaatio testi. MRNA: n ilmentymistä mahan solulinjoissa verrattiin käyttäen Studentin t-
-testiä tai yksisuuntainen ANOVA. Tilastollinen analyysi suoritettiin SPSS versio 11.0 (SPSS, Chicago, IL, USA). Ero katsottiin merkitseväksi kun P
-arvo oli < 0.05.
Tulokset
Expression CXCR4 ja TNF-α-mRNA ensisijainen mahasyövistä
CXCR4 mRNA määritettiin reaaliaikaisella käänteistranskriptiotuotteiden PCR 34 syöpien, ja sen ilmentyminen kussakin näyte standardoidun GAPDH
ilme. Tulokset paljastivat sen tasoa merkittävästi korkeampi helikobakteeri-positiivinen mahasyöpä (n = 19) verrattuna helikobakteeri-negatiivisia (n = 15) (7,2-kertainen, P
< 0,01, kuvio 1A). Samassa kohortin kasvaimia, TNF-α-mRNA: n ekspressiota havaittiin myös reaaliaikaisen käänteistranskriptiotuotteiden PCR: llä ja sen havaittiin vahvempi H. pylori-positiivisia syöpien verrattuna H. pylori-negatiivisia (4,3-kertainen, P
< 0,01, kuvio 1 B). Spearmanin rank korrelaatio koe edelleen todentaa positiivinen korrelaatio CXCR4 ilmaisun TNF-α näissä 34 syöpien (P
< 0,01, kuvio 1C). Kuvio 1 ilmentäminen CXCR4 ja TNF-α-mRNA ensisijainen mahasyövistä reaaliaikaisella PCR: llä. (A) ja (B) helikobakteeri-positiivinen mahasyöpä (harmaa pylväät, n = 19) ilmaistuna korkeamman tason CXCR4 (A) ja TNF-α (B) mRNA verrattuna helikobakteeri-negatiivinen syöpien (mustat pylväät , n = 15), * P
< 0,01. Vaakarivillä: keino mRNA-tasolla. (C) taso CXCR4 mRNA korreloi positiivisesti että TNF-α-mRNA 34 syöpien, P
< 0,01. Musta rhombus: H. pylori-negatiivinen syöpien; harmaa rhombus: H. pylori-positiivisia mahasyövistä.
induktio CXCR4 ja TNF-α ilmentyminen H. pylori mahasyövän soluissa
Reaaliaikainen-PCR ja Western blotting käytettiin tunnistamaan CXCR4 ilmaisun MKN45 ja HGC27 solut (kuvio 2A, B); ja paljastaa sen yliaktiivista merkittävästi niihin infektion jälkeen helikobakteeri 26695 24 tuntia (P
< 0,01, vastaavasti, kuvio 2A, B). Myöhemmin ne hoidettiin CAG PAI-negatiivinen H. pylori, Tx30a määrittää sen osallistumista ylösajon ja se on myös todettu aiheuttavan CXCR4 ilmaisun MKN45 ja HGC27 solujen (P
< 0,01, vastaavasti, kuviossa 2A , B). Kuvio 2 ilmentäminen CXCR4 ja TNF-α in MKN45 ja HGC27 solujen infektion jälkeen helikobakteeri. (A) ja (B) CXCR4 ilmentyminen säädeltiin vuonna MKN45 ja HGC27 solujen infektion jälkeen H. pylori 26695 (* P
< 0,01, vastaavasti, vs.
H. pylori) tai Tx30a (* P
< 0,01, vastaavasti vs
H. pylori). (C) ja (D) TNF-α ekspressio lisääntyi MKN45 ja HGC27 solujen infektion jälkeen H. pylori 26695 (* P
< 0,01, vastaavasti, vs.
H. pylori) tai Tx30a (* P
< 0,01, vastaavasti vs
H. pylori). Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD, n = 3.
vaikutus helikobakteeri-infektion TNF-α ilmentymistä tutkittiin tarkemmin käyttäen reaaliaikaista PCR ja Elisa ja havaitseminen osoitti, että infektio 26695 tai Tx30a 12 tuntia voi ovat johtaneet sekä lisää TNF-α-mRNA (P
< 0,01, vastaavasti) ja erittymisen TNF-α-proteiinin viljelmän supernatanttiin (P
< 0,01, vastaavasti) on MKN45 ja HGC27 soluja (kuvio 2C, D).
vaikutus Infliksimabi, neutralisoivien vasta TNF-α, on induktio CXCR4 ilmaisun helikobakteerin
toteaminen ylössäätely TNF-α ilmentyminen tässä tapauksessa toi meitä lisätutkimusta sen osallistumista induktion CXCR4 ilmaisun helikobakteerin. Neutraloivien TNF-α-vasta-aine, infliksimabi (4 ug /ml, Sigma), käytettiin sitten hoitoon MKN45 ja HGC27 solujen jälkeen infektion 26695, ja induktio CXCR4 inhiboitui merkittävästi (P ​​
< 0,01, vastaavasti , kuvio 3A, B). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin, kun näitä soluja käsiteltiin infliksimabi jälkeen infektion Tx30a (P
< 0,01, vastaavasti, Figure3C, D). Kuvio 3 vaikutus infliksimabi on induktion CXCR4 ilmaisun H. pylori. (A) ja (B) CXCR4 ylösajon aiheuttamien helikobakteeri 26695 estyi MKN45 ja HGC27 solujen jälkeen infliksimabihoitoa, * P
< 0,01 vastaavasti vs
26695 + inf. (C) ja (D) CXCR4 ylösajon aiheuttamien helikobakteerin Tx30a myös inhiboitui MKN45 ja HGC27 solujen jälkeen infliksimabihoitoa, * P
< 0,01, vastaavasti, vs.
Tx30a + inf. Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD, n = 3. inf: infliksimabi.
Lisääntymisen merkkejä CXCR4 ilmentymisen mahalaukun syövän soluissa TNF-α
MKN45 soluja, jotka salainen alemman tason TNF-α-proteiinia, käsiteltiin 1, 10 tai 50 ng /ml TNF-α (Sigma) 6 tuntia yrittää tutkimaan edelleen rooli TNF-α in ylössäätelyyn CXCR4 ilmaisun, ja reaaliaikainen-PCR ja Western blotting tunnistus paljasti sen voimistuvan merkittävästi annoksesta riippuvalla tavalla (P
< 0,01, kuvio 4A, B), ja jopa 15,8 taittuu 50 ng /ml TNF-α hoitoon. Kuva 4 lisääntymisen merkkejä CXCR4 ilmaisun mahasyövän soluissa TNF-α. (A) ja (B) CXCR4 ilmentyminen säädeltiin vuonna MKN45 soluissa eksogeenisen TNF-α annoksesta riippuvalla tavalla, * P
< 0,01. (C) ja (d) yhteisviljelmä järjestelmä MKN45 ja RAW264.7-solut ekspressoivat enemmän CXCR4, * P
< 0,001, vs
M; ** P
< 0,001, vs
R. voimistumista CXCR4 ilmaisun estyi jälkeen infliksimabihoitoa, *** P
< 0,001, vs
M + R + inf. M: MKN45; R: RAW264.7; inf: infliksimabi. (E) Expression of TNF-α oli poissa HGC27 soluissa transfektion jälkeen TNF-a: RNAi-plasmidin. (F) CXCR4-mRNA vaimentua vuonna HGC27 soluissa transfektion jälkeen TNF-a RNAi plamida, * P
< 0,001, vs
Ei RNAi; ** P
< 0,001, vs
Ohjaus RNAi. Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD, n = 3.
Seuraavaksi CXCR4 ilmentymisen rinnakkaisviljelmätilanteessa järjestelmä tutkittiin, koska kasvaimeen liittyvät makrofagit toimivat myös lähteenä TNF-α mahalaukun syövän mikroympäristö. Aktiivisesti viljelmä MKN45 solujen RAW264.7 solujen kanssa 24 tunnin ajan ilmoittanut ilmaistu huomattavasti CXCR4 mRNA ja proteiini (P
< 0,001, kuvio 4C, D); tämä lisäys oli kuitenkin merkitsevästi inhiboi infliksimabille (P
< 0,001, kuvio 4C, D).
Lopuksi endogeenisen TNF-α oli suunnattu arvioida sen asetuksen CXCR4 ilmaisun HGC27 soluja, jotka salaisuudet korkeampi taso TNF-α-proteiinia. TNF-a: RNAi plasmidia käytettiin transfektoimaan HGC27 soluihin, ja vastaavasti nonsilencing RNAi plasmidia käytettiin vastapuolen kontrollina. Havaittiin, että TNF-α oli poissa HGC27 soluissa transfektion jälkeen TNF-a: RNAi-plasmidi (kuvio 4E). Sitten ekspressio CXCR4 havaittiin reaaliaikaisella PCR: llä ja sen todettiin havaitsemiseen, että transfektion jälkeen TNF-a: RNAi-plasmidi, CXCR4-mRNA: n ilmentyminen säädeltiin vähentävästi merkittävästi HGC27 soluissa, verrattuna soluihin, joissa ohjaus RNAi tai soluja ilman RNAi (P
< 0,001, vastaavasti, kuvio 4F).
induktio sytokiinien makrofageissa helikobakteeri
Reaaliaikainen PCR ja Elisa käytettiin arvioimaan vaikutusta helikobakteeri 26695 on sytokiiniekspressiota in RAW264.7 soluissa, koska se on yleisesti tunnustettua, että sytokiinit ovat mukana krooninen tulehduksellinen prosessien aiheuttaman H. pylori. Real-time PCR havaitseminen osoitti, TNF-α, IL-1β: n ja IL-6-mRNA: n ilmentyminen li- sääntyy 26695-käsitellyissä soluissa verrattuna 26695-käsittelemättömiin soluihin (TNF-α, P
< 0,001, IL-1β P
< 0,001 ja IL-6, P
< 0,001, kuvio 5A). Ja Elisa tulokset osoittivat lisää proteiinien TNF-α, IL-1β ja IL-6 oli erittynyt natantin 26695-käsitellyissä soluissa verrattuna 26695-käsittelemättömiin soluihin (TNF-α, P
< 0,001, IL-1β P
< 0,001 ja IL-6, P
< 0,001, kuvio 5B). Kuva 5 induktio sytokiinien makrofageissa H. pylori. (A) ja (B) Expression of TNF-α, IL-1β: n ja IL-6 on yliaktiivista 26695-käsiteltyjen RAW264.7-solut, * P
< 0,001, vs
käsittelemättömät solut. (C) ja (D) ei myöskään IL-1β eikä IL-6 voi ylössäätää CXCR4 ilmentymisen MKN45 soluissa. Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD, n = 3.
Lopuksi MKN45 soluja käsiteltiin eksogeenisen IL-1β (50 ng /ml) ja IL-6 (50 ng /ml) vastaavasti, sulkea pois mahdollisuutta, että IL -1β ja IL-6 voi ylössäätävät CXCR4 ilmentymistä, kuten TNF-α. Kumpikaan IL-1β eikä IL-6: n havaittiin upregulaatioon CXCR4 ilmentymisen merkittävästi (kuvio 5C, D).
Migration analyysi
Migration analyysi suoritettiin käyttäen Matrigel hyökkäyksen kammion yritetään tutkia, voimistuvan CXCR4 oli toiminnallinen . Alkuvaiheessa kokeilun 100 ng /ml CXCL12 alemmassa kammiossa, oli merkittävä lisäys (jopa 4,5 taittuu) kun kulkeutumista MKN45 solujen 26695 hoitoa ylemmässä kammiossa verrattuna kontrolli soluja ilman 26695 käsittely (P
< 0,001, kuva 6A). Myöhemmin kuitenkin kasvu estyi merkittävästi, kun AMD 3100 (1 ug /ml, Sigma), joka on CXCR4-antagonisti, tai infliksimabi, lisättiin (P
< 0,01, vastaavasti, kuvio 6A). Kuva 6 Migration tutkimus. (A) MKN45 solut osoittivat merkittävää kasvua muuttoliikkeen hoidon jälkeen 26695, * P
< 0,001, vs
ohjaus. Kasvu migraatio MKN45 solujen aiheuttama 26695 estyi, kun AMD 3100 (** P
< 0,01, vs
26695 + AMD), tai infliksimabi (*** P
< 0,01, vs
26695 + inf) lisättiin. AMD: AMD3100; inf: infliksimabi. (B) TNF-α kasvoi MKN45 solujen vaeltamiseen, * P
< 0,001, vs
ohjaus. Kumpikaan IL-1β eikä IL-6 voi lisätä MKN45 solujen vaeltamiseen merkittävästi. Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD, n = 3.
Lisäksi vaikutus sytokiinien on MKN45 solujen vaeltaminen tutkittiin myös, ja TNF-α (50 ng /ml) havaittiin lisäävän MKN45 solujen vaeltamiseen merkittävästi (P
< 0,001, kuva 6B). Kuitenkin, ei ole IL-1β (50 ng /ml) tai IL-6 (50 ng /ml) osoittautui edistää MKN45 solujen vaeltamiseen huomattavasti (kuvio 6B).
Keskustelu
H. pylori on syytti tartuttaa noin 50% maailman väestöstä lopullisena mahalaukun syöpää aiheuttava ihmisille [12]. Patogeneesi leviämistapaansa sisältää usein tulehdus, limakalvovauriot tai mahalaukun surkastuminen, ja vaatii läheistä vuorovaikutuksesta bakteerien ja mahalaukun epiteelisolujen aktivoivat signalointireittejä, muokkaamalla isäntä solun toimintoja ja johtaa krooniseen epiteelin vastaukset [13.14]. Tällä hetkellä huomattavia todisteita yhdistää kroonisen tulehduksen ihmisten syöpiin [15-17], ja erityisesti, helikobakteeri aiheuttama krooninen tulehdus ja sytokiinien paikalliseen vatsassa mikroympäristössä olla yleisin osallistujat [18-20]. Tutkimuksessa korostettiin seurauksena limakalvon taso TNF-α-mRNA oli merkittävästi korkeampi helikobakteeri-positiivisilla potilailla kuin että negatiivisilla potilailla käyttämällä kvantitatiivista reaaliaikaista PCR, ja kaksi mahalaukun syöpäsolujen myös erittyy TNF-α proteiini in vitro. Lisäksi se viittaa siihen oletukseen, että TNF-α voi olla osallisena H. pylori mahasyövän välttämättömänä ja vahva linkkeri välillä tulehdus ja syöpään [21].
Vaikka mekanismi induktio TNF-α helikobakteerin edelleen suhteellisen epäselvä, proteiini perhe on julkistettu viime vuosikymmenellä, mukaan lukien Helicobacter pylori-kalvo proteiini-1 (HP-MP1) ja TNF-α indusoiva proteiini (Tipα) [22-24]. Tipα geeni, tunnistettiin helikobakteeri kanta 26695, on homologinen HP-MP1 geenin 94,3% homologia, ja molemmat osoittavat vahva kyky aiheuttaa TNF-α-geenin ilmentymisen. Tutkimuksessa helikobakteeri 26695 todettiin upregulate TNF-α ilmentymisen merkittävästi MKN45 ja HGC27 soluja, ja CAG PAI-negatiivisen kannan Tx30a myös huomattiin aiheuttavan sen tietenkin, jotka voivat olla osittain johtuu siitä, että HP-MP1 /Tipα perhe ei CAG PAI alueella. Se oli kuitenkin myös merkille, että vaikutus Tx30a TNF-α induktio oli heikompi kuin 26695 (2,3 taittuu vs
3.1 taittuu MKN45 solut), joka ehdotti helikobakteeri tuotteiden CAG PAI voidaan myös osallisena induktio. Itse asiassa se oli raportoitu, että CagA H. pylori voivat aiheuttaa TNF-α mahasyövän biopsianäytteistä [25]. Lisäksi, puhdistettu H. pylori ureaasin havaittiin myös aiheuttavan MKN45 solut ilmentävät TNF-α [26].
TNF-α, joka on keskeinen sytokiini monissa kroonisissa tulehdussairauksissa, on alun perin merkitty seerumin tekijä induktion of verenvuotokuolion siirrettyjen kiinteitä kasvaimia hiirissä. Kuitenkin, tällä hetkellä se on yleisesti tunnistettu kasvaimen promoottori paikallisen kasvaimen mikroympäristössä, ja siten poistaminen tai inhibitio on tarkoitus vähentämään kokeellisen syöpiä. TNF-α /TNF-R1 kaataa hiiret ovat vastustuskykyisiä kemiallisia aiheuttaman syövän synnyn [27, 28]. Se on usein havaittu koepalat eri ihmisen syövissä, jotka on tuotettu joko epiteelikasvainsolut tai stroomasoluissa. Lisäksi se on myös todettu, vaikka pieni määrä, eritystä monien syöpälinjojen in vitro ilman tulehduksellisten ärsykkeiden, vaikka mekanismi ei ole vielä täysin selvä.
TNF-α havaittiin paitsi osallistuvat solujen transformaatio ja lisääntymistä , mutta myös tuumorimetastaasissa. Tällainen toteamus perustui alun perin eläinmallissa paksusuolen syöpä, jossa injektio LPS edistänyt keuhkometastaasitestissä riippuvainen TNF-α tuotannon isäntäsoluissa [29]. Tästä seuraavat tulokset osoittivat lisääntynyt kasvaimen etäpesäke estää neutraloivien TNF-α-vasta-ainetta [30]. Nämä johtivat meidän spekuloidaan, että yksi taustalla olevien mekanismien TNF-α tuumorimetastaasissa voi liittyä säätely kemokiinien /kemokiinireseptoreita. Ensimmäinen, oli merkittävä säätelyä CXCR4 mahasyövän soluissa sen jälkeen, kun niitä käsiteltiin eksogeenisen TNF-α. Siellä oli toinen selvä voimistumista CXCR4 ilmentymisen syöpäsoluissa, kun he olivat viljeltiin yhdessä makrofagi, vaihtoehtoisen TNF-α mahasyövän mikroympäristössä. Kuten oli odotettavissa, tämä säätelyä voitiin estää TNF-α neutraloiva vasta-aine infliksimabi. Oli näin ollen merkittävä väheneminen ilmentymisen CXCR4 HGC27 soluissa sen jälkeen, kun RNAi käytettiin kumota TNF-α ilmentymisen näissä soluissa, mikä osoitti endogeenisen TNF-α voi myös ylössäätää CXCR4 ilmaisua. Yleisenä havainnot johtivat meidän päätellä, että TNF-α, jossa itse mukana etäpesäke mahasyövän, ylössäätelee CXCR4 ilme.
Yliekspressio CXCR4, joiden osallistuminen erilaisissa ihmisen kasvaimissa on tunnettu, on usein havaittu mahasyövän kudoksissa lisätä mahasyövän etäpesäke. Jotkut ihmisen mahakarsinoo- solut ilmentävät myös CXCR4 mRNA ja proteiini korkealla tasolla [7, 8]. Tutkimuksemme osoitti helikobakteeri-infektion lisääntynyt MKN45 solujen vaeltamiseen kautta voimistumista CXCR4 ilmaisua. Käsittely CXCR4-antagonisti AMD3100 johti merkittävään tukahduttaminen MKN45 solumigraatiota in vitro. Toinen tutkimus osoitti, AMD3100 suppressoi merkitsevästi kehitystä vatsakalvon carcinomatosis hiirimallissa mahalaukun syövän, joka on osoituksena väheneminen kasvaimen kasvua ja vesivatsanestesupernatan- muodostumista [9]. Aikaisempi tutkimukset johtivat meidän päätellä, että CXCR4 yliekspressio ohutsuolikoepalan ensiarvoisen mahasyövän voi toimia ennen leikkausta riskien arvioinnissa esiintymisen vatsakalvon carcinomatosis.
Makrofageilla sekaantumisesta syövän synnyn ja kasvaimen invaasio ja etäpesäkkeiden [31, 32 ] yleisesti on syytti kannustaa TAM (Tumor liittyvät makrofagit), merkittävä lähde TNF-α kasvaimen mikroympäristössä, vapauttaa erilaisia ​​kasvutekijöitä, sytokiinejä, ja tulehdusvälittäjäaineiden. Tutkimus osoitti, että oli merkittävä TNF-α aiheuttama H. ​​pylori, ja samanaikaisesti säätelyä IL-1-beeta ja IL-6 RAW264.7-soluissa, kuitenkin, tämä vaihtelu ei onnistunut indusoimaan CXCR4 ilmentymisen MKN45 soluissa.
Tutkimukset ovat lopulta johtuvan epänormaalin NF-KB syöpäsoluissa liiallisen erittymisen TNF-α, jonka rooli CXCR4 ylösajon myöhemmin oletetaan liittyvän teille, joita välittävät NF-KB. Muut havainnot ovat paljastaneet TNF-α-antagonistit voivat inhiboida ylössäätelyyn CXCR4 ilmentymisen H. pylori, ja sekä se että CXCR4-antagonisteja voi estää lisääntynyt liikkuvuus mahalaukun syövän soluissa in vitro. Nämä tulokset viittaavat siihen, että nämä antagonistit yksinään tai yhdistelmänä muiden hoitojen kanssa, voivat toimia tehokkaina hoitojen mahasyöpäpotilaista.
Päätelmät
TNF-α on mukana ylössäätelyyn CXCR4 ilmentymisen mahasyövän aiheuttama H. pylori.
julistukset
Kiitokset
työtä tukivat apurahan Division of Education, Liaoningin maakunnassa, Kiina (2009A751).
Kirjoittajien alkuperäinen toimitti asiakirjat kuville
Alla linkit kirjoittajien "alkuperäiset toimitti asiakirjat kuville. 12885_2009_2218_MOESM1_ESM.tiff Kirjoittajien alkuperäinen tiedosto kuvio 1 12885_2009_2218_MOESM2_ESM.tiff Kirjoittajien alkuperäinen tiedosto kuvio 2 12885_2009_2218_MOESM3_ESM.tiff Kirjoittajien alkuperäinen tiedosto kuvio 3 12885_2009_2218_MOESM4_ESM.tiff Kirjoittajien alkuperäinen tiedosto kuvio 4 12885_2009_2218_MOESM5_ESM.tiff Kirjoittajien alkuperäisen tiedoston luku 5 12885_2009_2218_MOESM6_ESM.tiff kirjoittajien alkuperäinen tiedosto kuvio 6 kilpailevat edut
kirjoittajat ilmoittavat, että heillä ei ole kilpailevia intressejä.

• Interleukiini-23A liittyy kasvaimen kasvua Helicobacter-pylorin liittyvät ihmisen mahalaukun cancer
• Yleisimmät robotti BARIATRIC menettelyistä: tarkastelu ja tekninen aspects