Dalyvavimas naviko nekrozės faktoriaus alfa į CXCR4 išraiška ląstelę skrandžio vėžio sukeltas Helicobacter pylori

dalyvavimo naviko nekrozės faktoriaus alfa atsižvelgiant į CXCR4 išraiška ląstelę skrandžio vėžio sukeltas Helicobacter pylori
tezės
Background
Helicobacter pylori, kurio infekcija padidina naviko invazinis ir metastazes, paprastai ženklinami kaip stipriausiu rizikos veiksnys skrandžio vėžio vystymąsi. Atrodo, negali būti sutapimas, kad ten taip pat yra CXCR4 raiška ir akivaizdus dalyvavimas skrandžio vėžio metastazių. Šio tyrimo tikslas bando ištirti ir toliau nustatyti ryšį tarp jų. H. pylori yra stiprus induktorius TNF-alfa, ar TNF-α, navikas promotorius, yra dalyvauja CXCR4 raiškos indukcijos H. pylori buvo pagal mokslinių tyrimų šiame tyrime.
Metodai
išraiška iš CXCR4, TNF-alfa, IL-6 ir IL-1β mRNR buvo nustatomas pagal realaus laiko PGR. CXCR4 baltymo ekspresija buvo aptikta Vakarų blotingo metodu. Koncentracijos TNF-alfa, IL-6 ir IL-1β ląstelių kultūroje nuopile buvo matuojamas naudojant Quantikine Elisa rinkinys. Panaikinti TNF-α išraišką HGC27 ląstelių, TNF-alfa RNAi plazmidės buvo naudojamos jų transfekcijai.
Rezultatai
lygiai CXCR4 ir TNF-alfa mRNR buvo žymiai didesnis H. pylori teigiamų skrandžio vėžio (N = 19), lyginant su H. pylori neigiamus (n = 15). A Vėliau Spearman rango koreliacijos tyrimas parodė, kad buvo teigiama koreliacija tarp CXCR4 mRNR lygio ir kad TNF-alfa 34 pirminių skrandžio vėžio. Kita Rezultatai po: išraiška CXCR4 ir TNF-alfa buvo aktyvinama skrandžio vėžio ląstelių MKN45 ir HGC27 po užsikrėtimo Helicobacter pylori 26.695 (CAG PAI +) arba Tx30a (CAG PAI -); Iš CXCR4 išraiška pagal H. pylori indukcija buvo žymiai slopinamas neutralizuojančiu TNF-α antikūnų, infliksimabo; CXCR4 išraiška buvo aktyvinama į MKN45 ląstelių po gydymo egzogeninės TNF-alfa arba bendro kultūros su makrofagų ir buvo downregulated į HGC27 ląstelių po transfekciją su TNF-alfa RNAi plazmidės. Reikšmingai padidėjo MKN45 ląstelių gydomiems H. migracijos pylori 26695 ir stiprus slopinimas, kai AMD 3100 A CXCR4 antagonistas arba infliksimabas buvo pridėta.
Išvados
Mūsų išvados parodė, kad H.pylori upregulates CXCR4 išraišką skrandžio vėžiu per TNF-alfa.
faktai
Jis yra gerai priimta, kad Helicobacter pylori (H. pylori) yra stiprus rizikos veiksnys įvairių skrandžio ligų, ty lėtiniu gastritu, skrandžio opos vystymuisi, skrandžio gleivinės limfoidinis audinys yra limfoma ir skrandžio vėžys, ir ji yra pripažinta, kad tarp H. pylori ir epitelinių ląstelių sąveika, prisideda prie šio vystymosi. Iš tiesų, H. pylori infekcija sukelia uždegimą mikroaplinkos skrandžio, susijusios su indukcijos priešuždegiminiais citokinų, pavyzdžiui, naviko nekrozės faktoriaus-alfa (TNF-alfa), interleukino-1β (IL-1β) ir IL-6 [1-3 ], todėl skrandžio Kancerogeninis palanki.
H. Helicobacter pylori infekcija taip pat padidina naviko invazinis ir metastazes [4-6], nors mechanizmas dar nėra gerai suprantama. Vėžio metastazių procesas nėra atsitiktinis, ir įvairių vėžio turi savo pageidaujamą dažniais svetainėse. Tiesiog kaip ir prekyba leukocitų, naviko ląstelių migracija kritiškai reglamentuoja chemokino /chemokino receptorių sistema. Kitas mūsų dėmesio centre yra išskiriamas į CXCR4, dažniausiai chemokino receptorių ekspresija į vėžio serija (skrandžio vėžys įtrauktas) iki šiol [7, 8]. Tyrimai parodė, CXCL12 /CXCR4 ašis dalyvauja skrandžio vėžio metastazių [9]. Todėl kelia didelius interesus rasti tarp H. pylori infekcija ir CXCR4 raiškos skrandžio vėžio ryšį.
Vienas iš pagrindinių cheminių mediatorių padariusiems uždegimo susijusios vėžio yra TNF-α ir dabar yra pakankamai įrodymų savo dalyvavimo skatinimo ir progresavimo eksperimentiniais ir žmogaus vėžio [10, 11]. Tiesa, kad jo vardu, dideles dozes regioninio TNF-alfa gali sukelti hemoraginis nekrozė per selektyvaus sunaikinimo naviko kraujagyslėse. Tačiau, ji gali netikėtai veikti kaip endogeninio navikų aktyvatorius, kai jis gaminamas auglio mikroaplinka. Mūsų interesas yra todėl dėmesys į jo dalyvavimą CXCR4 raiškos indukcijos H. pylori, kuris stipriai indukuoja TNF-alfa, kuri yra žinoma upregulate daug citokinų, chemokinus, adhezijos molekulių ir augimo veiksnių vėžio seriją.
metodai
skrandžio vėžio ląstelių linijas ir audinių mėginiai
MKN45 ir HGC27 buvo gauti iš keygen Biotech "The žmogaus skrandžio vėžio ląstelių. Co (Nanjing, Kinija), ir buvo auginamos RPMI 1640 papildytas 10% vaisiaus galvijų serumo, esant 37 ° C temperatūroje, drėgnoje inkubatoriuje su 5% CO 2. 34 pirminis navikas egzemplioriai buvo įsigyti iš pacientų pagal veikimo su visais savo sąmoningą sutikimą Shengjing ligoninėje, kinų medicinos universitete, buvo įšaldytos skystu azotu iš karto po chirurginio pašalinimo. Haematoxylin- ir eozinas-dažymo skyriai buvo parengtas įvertinus naviko ląstelių procentais, ir tik bandinių su > 70% naviko ląstelės buvo pasirinktas analizei. Šis tyrimas buvo atliktas su etikos komiteto Kinijos medicinos universiteto patvirtinimą. Visi eksperimentai buvo atlikti mažiausiai tris kartus.
Makrofagų ląstelių linijos RAW264.7 Viesbutis The makrofagų ląstelių ŽALIOS 264,7 buvo pateikta American Type Culture Collection (Rockville, MD, JAV) ir išliko Dulbecco modifikuota Eagle terpėje papildytas 10% vaisiaus galvijų serumo, 37 ° C temperatūroje, drėgnas inkubatoriuje su 5% CO 2.
H. pylori padermės
H. pylori padermės 26695 (ATCC 700.392, CAG PAI +) ir Tx30a (ATCC 51932, CAG PAI -) buvo pasiūlyta ATCC (Rockville, MD, JAV). Jie buvo auginamos avys kraujo agaro lėkštelėse 37 ° C temperatūroje, esant microaerophilic sąlygomis. Bakterijos buvo perkelti po 48 h į Brucella sultinio, kurių sudėtyje yra 5% vaisiaus jaučio serumo 24 h. A infekcijos 100 įvairovė buvo naudojamas visų tyrimų.
Realaus laiko atvirkštinės transkripcijos PGR
viso RNR buvo išskirta iš audinių ir ląstelių linijų Trizol (TAKARA, Dalian, Kinija) pagal Protokolo tiekiamų gamintojai. kDNR buvo susintetintas naudojant TAKARA RNR PGR 3.0 Kit (Takara, Dalian, Kinija) bendro tūrio 10 ml, kurių sudėtyje yra AMV atvirkštinės transkriptazės, 0,5 iL; Atsitiktinės 9 gruntas, 0,5 mikrol; 25 mM MgCl 2, 2 mikrol; 10 × RT buferis, 1 mikrol; dNTP mišinys (kiekvienas 10 mM), 1 mikrol; RNazės inhibitorius, 0,25 mikrol; RNR 1 mikrol; dH 2O, 3,75 mikrol. Sąlygos RT buvo: 30 ° C temperatūroje 10 minučių, 42 ° C temperatūroje 25 minučių, 99 ° C temperatūroje 5 minutes, ir 5 ° C temperatūroje 5 min. Realaus laiko PGR buvo atliekama naudojant LIGHTCYCLER sistemą kartu su LIGHTCYCLER DNR Master SYBR Green I Kit (Roche Diagnostics). Bendras tūris yra 20 ml, kurių sudėtyje yra 25 mm MgCl 2, 3 iL; 10 × buferis, 5 mikrol; 10 mkm priekį Gruntas, 1 mikrol; 10 mkm pakeisti Primer, 1 iL; LIGHTCYCLER DNR magistras SYBR Žalia aš, 2 mikrol; kDNR, 2 mikrol; dH 2O, 6 mikrol. Sąlygos, skirtų PGR buvo: 50 ° C temperatūroje 2 min, 95 ° C temperatūroje 10 minučių, po to 40 ciklų 5 sekundes ne mažesnis nei 95 ° C ir 20 sekundžių 60 ° C temperatūroje. Į namų ūkį genas gliceraldehido-3-fosfato dehidrogenazės (GAPDH
) buvo naudojamas kaip vidaus kontrolės. Genų ekspresija buvo įvertintas, lyginamosios KT metodu, normalizuoja CT vertybes GAPDH parsisiųsti ir skaičiavimo santykinius raiškos vertybes. Gruntas sekas teikė Takala (Dalian, Kinija) taip: CXCR4
priekį, 5'-GAGGAAATGGGCTCAGGG-3 ", atvirkštinės, 5'-AGTCAGCAGGAGGGCAGGGA-3"; TNF-α
priekį, 5'-AGTGACAAGCCTGTAGCCC-3 ", atbulinės eigos pavarą, 5'-GCAATGATCCCAAAGTAGACC-3"; IL-1β
priekį, 5'-CCACCACTACAGCAAGGG-3 ", atvirkštinio, 5'-GAACTGGGCAGACTCAAA-3"; IL-6
į priekį, 5'-CCTTCGGTCCAGTTGCCTTCT-3 ', atvirkštinio, 5'-GCATTTGTGGTTGGGTCA-3'; GAPDH
priekį, 5'-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3 ", atvirkštinės, 5'-AAAGGTGGAGGAGTGGGT-3".
Imunoblotingo
Mobilaus Lizatai parengtas mėginių buferio [50 mmol /l Tris-HCl (pH 6,8 ), 100 mmol /l DTT, 2% SDS, 0,1% bromfenolio mėlynasis, ir 10% glicerolio] ir buvo atliktas 12% natrio dodecilsulfato (SDS) /akrilamido gelyje. Baltymai akrilamido gelyje buvo perkelti į nailono membranos, kurių buvo užblokuotas per naktį (4 ° C temperatūroje PBS su 0,1% Tween ir 10% masės pieno miltelių). Polikloniniai antikūnai CXCR4 (Santa Krusas, Kalifornija, JAV), ir atitinkami antriniai antikūnai (Santa Krusas, Kalifornija, JAV) buvo taikomas prieš imunoblotingo. Žmogaus genų β-Aktinis
(Santa Krusas, Kalifornija, JAV) buvo naudojamas kaip vidaus kontrolės. Dėmės buvo ryškinamos su FX Pro Plus sistema (Bio-Rad) ir kiekybiškai naudojant Scion Image 4.03 programinę įrangą.
RNR interferencija
TNF-alfa RNAi plazmidės ir nonsilencing kontrolė RNRi plazmidės buvo įsigytas iš Takala (Dalian, Kinija). Ląstelės buvo pasėjamos į 24-šulinėlių plokštelės esant 2 × 10 tankio 5. Kitą dieną, ląstelės buvo pernešta su TNF-alfa siRNA ar kontrolės siRNA naudojant Lipofectamine 2000 (INVITROGEN, Jungtinė Karalystė) pagal gamintojo nurodymus.
ELISA citokinų ląstelių kultūroje nuopile
koncentracijos TNF-alfa, IL-1β ir IL-6 ląstelių kultūroje nuopile buvo matuojamas naudojant Quantikine Elisa komplektas (Boster, Uhanas, Kinija) pagal gamintojo instrukcijas. Į tai, tyrimo jautrumas buvo 2 pg /ml TNF-alfa, 4 pg /ml IL-1β ir 4 pg /ml IL-6.
Migracijos tyrimai
iš fermentuotų ląstelių migracijos buvo tirta naudojant Matrigel invazija kamera (24 gerai formatas, 8 mkm porų; BD Pharmingen). Ląstelės (5 × 10 5) buvo pridėta prie viršutinės kameros ir terpėje, papildytoje CXCL12 (100 ng /ml, Sigma) buvo įtraukta į apatinę kamerą. Migracijos tyrimai buvo inkubuojamos 18 valandas 37 ° C temperatūroje ir 5% CO 2. Migravo ląstelės ant apatinio paviršiaus buvo dažomi 1% toluidinas mėlynas po fiksavimo su 100% metanoliu. Už kiekvieną transwell, kad migravo ląstelių skaičiaus 10 vidutinio galingumo laukuose (x 20) buvo skaičiuojami.
Statistinė analizė
Mann-Whitney U
-test buvo naudojamas palyginti iRNR raiška tarp H. pylori teigiamas ir H. pylori neigiami navikų. Koreliacija tarp CXCR4 saviraiškos ir TNF-alfa raiškos skrandžio vėžio egzempliorių buvo analizuojami naudojant Spearman koreliacijos rangas testą. Išraiška mRNR skrandžio ląstelių linijų buvo palyginti naudojant Stjudento t
-test arba vienas būdas ANOVA. Statistinė duomenų analizė atlikta naudojant SPSS 11.0 versija (SPSS, Čikaga, IL, JAV). Skirtumas buvo laikomas reikšmingu, kai p
-Pridėtinės buvo < 0,05.
Rezultatai
išraiška CXCR4 ir TNF-α mRNR pirminis skrandžio vėžio
CXCR4 mRNR nulėmė realaus laiko atvirkštinės transkripcijos PGR 34 skrandžio vėžiu, o jo išraiška kiekvieną egzempliorių buvo standartizuoti GAPDH
išraiška. Tyrimo rezultatai atskleidė jo lygis gerokai didesnis H. pylori teigiamų skrandžio vėžio (n = 19), palyginti su H. pylori neigiamus (n = 15) (7.2 kartus, p
< 0,01, 1A pav.) Į tos pačios grupės tiriamuosius auglių, TNF-α mRNR išraiška taip pat buvo aptikta realaus laiko atvirkštinio transkripcijos PGR, ir buvo nustatyta, stipresnis H. pylori teigiamų skrandžio vėžio, palyginti su H. pylori neigiamus (4.3 kartus, p
< 0,01, 1B pav). Spearman rango koreliacijos testas dar kartą patikrino teigiamą koreliaciją CXCR4 išraiška su TNF-alfa šių 34 skrandžio vėžiu (p
< 0,01, 1C pav.) 1 pav išraiška CXCR4 ir TNF-alfa mRNR pirminės skrandžio vėžio realaus laiko PGR. (A) ir (B) H. pylori-teigiamas skrandžio vėžio (stulpelių pilkos spalvos, n = 19), išreikštos aukštesnio lygio CXCR4 (A) ir TNF-alfa (B) mRNR, palyginti su H. pylori neigiamų skrandžio vėžio (juoda stulpeliai , n = 15), * P
< 0,01. Horizontalios linijos: priemonė iRNR lygiu. (C) lygis CXCR4 mRNR buvo teigiamai koreliavo su ta TNF-alfa mRNR 34 skrandžio vėžiu, p
< 0,01. Juoda rombas H. pylori neigiami skrandžio vėžio; pilkas rombas., H. pylori teigiami skrandžio vėžio
indukcija CXCR4 ir TNF-α ekspresijos H. pylori skrandžio vėžio ląstelių
realaus laiko PGR ir imunoblotingu buvo naudojamas siekiant aptikti CXCR4 išraišką MKN45 ir HGC27 ląstelės (2a pav, B); ir atskleisti tai gerokai aktyvinama juose po infekcijos su H. pylori 26695 24 valandas (P
< 0,01, atitinkamai, 2A pav B). Vėliau jie buvo gydomi CAG PAI-neigiamas, H. pylori, Tx30a nustatyti savo dalyvavimą ląstelę, ir jis taip pat nustatyta, kad sukelti CXCR4 išraišką MKN45 ir HGC27 ląstelių (P
< 0,01, atitinkamai, 2a paveikslas B). 2 pav išraiška CXCR4 ir TNF-α ir MKN45 ir HGC27 ląstelių po užsikrėtimo Helicobacter pylori. (A) ir (B), CXCR4 išraiška buvo aktyvinama į MKN45 ir HGC27 ląstelės po infekcijos H. pylori 26695 (* p
< 0,01, atitinkamai, lyginant su pervežimas H. pylori-) arba Tx30a (* p
< 0,01, atitinkamai, vs
H. pylori-). (C) ir (D) TNF-α išraiška buvo padidintas MKN45 ir HGC27 ląstelės po infekcijos su H. pylori 26695 (* P
< 0,01, atitinkamai, vs
H. pylori-) arba Tx30a (* P
< 0,01, atitinkamai, vs
H. pylori-). Duomenys pateikti kaip vidurkis ± SD, n = 3.
H. pylori infekcijos poveikio TNF-alfa išraiška buvo toliau tiriama naudojant realaus laiko PGR ir ELISA ir aptikimo parodė, kad infekcijos 26695 arba Tx30a už 12 valandos galėjo tiek daugiau išraiškos TNF-alfa mRNR (P
< 0,01, atitinkamai) ir daugiau sekreciją TNF-alfa baltymo į kultūros supernatanto (P
< 0,01, atitinkamai) į MKN45 ir HGC27 ląstelių (pav 2C, d).
poveikis infliksimabą neutralizavimo antikūnų prieš TNF-alfa, dėl CXCR4 raiškos indukcijos H. pylori
į ląstelę TNF-α ekspresijos išvadą šioje byloje, mums tolesnius tyrimus apie savo dalyvavimą CXCR4 raiškos indukcijos H. pylori. Neutralizuojantį TNF-α antikūnų, infliksimabo (4 mikrogramų /ml, Sigma), tada buvo naudojamas gydyti MKN45 ir HGC27 ląsteles po infekcijos 26695, ir CXCR4 indukcija buvo žymiai slopinamas (P
< 0,01, atitinkamai , 3A pav B). Panašūs rezultatai buvo pastebėta, kai šios ląstelės buvo gydomi infliksimabo po infekcijos Tx30a (P
< 0,01, atitinkamai, Figure3C, D). Skaičius 3 poveikis infliksimabo dėl CXCR4 išraiška indukcijos H. pylori. (A) ir (B) CXCR4 ląstelę sukeltas H. pylori 26695 buvoinhibuotas MKN45 ir HGC27 ląstelių po gydymo su infliksimabo, * P
< 0,01, atitinkamai, lyginant su
26.695 + INF. (C) ir (D) CXCR4 ląstelę sukeltas H. pylori Tx30a taip pat buvoinhibuotas MKN45 ir HGC27 ląstelių po gydymo su infliksimabo, * P
< 0,01, atitinkamai, lyginant su
Tx30a + inf. Duomenys pateikti kaip vidurkis ± SD, n = 3. INF. Infliksimabas
ląstelę CXCR4 išraiška skrandžio vėžio ląstelių TNF-alfa pervežimas MKN45 ląstelių, kurios paslaptis žemesnio lygio TNF-α baltymo, buvo gydomi 1, 10, arba 50 ng /ml TNF-α (Sigma) 6 valandų bandant toliau nagrinėti TNF-alfa vaidmenį CXCR4 išraiška ląstelę, ir realaus laiko PGR ir imunoblotingu aptikimo atskleidė jis buvo žymiai aktyvinama priklausomai nuo dozės priklausomu būdu (P
< 0,01, 4A pav B), ir net 15,8 raukšlės su 50 ng /ml TNF-alfa gydymui. 4 pav ląstelę CXCR4 išraiška skrandžio vėžio ląstelių TNF-alfa. (A) ir (B) CXCR4 išraiška buvo aktyvinama į MKN45 ląstelėse egzogeninės TNF-alfa priklausomai nuo dozės priklausomu būdu, * P
< 0,01. (C) ir (D) coculture sistema MKN45 ir RAW264.7 ląstelių išreiškė daugiau CXCR4, * p
< 0.001, V. pervežimas M; ** P
< 0.001, V.
R. Iš CXCR4 išraiška ląstelę buvo slopinamas po gydymo infliksimabui, *** p
< 0.001, V. pervežimas M + R + inf. M: MKN45; R RAW264.7; INF: infliksimabas. (E), išraiška TNF-alfa buvo išvykęs į HGC27 ląstelių po transfekciją su TNF-alfa RNAi plazmidės. (F), CXCR4 iRNR raiška buvo downregulated į HGC27 ląstelių po transfekciją su TNF-alfa RNAi plazmidės, * p
< 0.001, V.
Nėra RNRi; ** P
< 0.001, V. pervežimas kontrolės RNAi. Duomenys pateikti kaip vidurkis ± SD, n = 3.
Be to, CXCR4 išraiška per bendro kultūros sistemoje buvo tikrinama, nes naviku susijusių makrofagai taip pat tarnauja kaip TNF-alfa šaltinis skrandžio vėžio mikroaplinka. Co-kultūra MKN45 ląstelių, turinčių RAW264.7 ląstelių 24 valandas, nurodė, kad ji žymiai daugiau išreikštas CXCR4 mRNR ir baltymų (P
< 0,001, pav 4C, D); šis padidėjimas, tačiau buvo smarkiai slopino infliksimabui (p
< 0,001, 4c paveikslas, D),
Galiausiai, endogeninė TNF-α buvo skirta įvertinti jos reguliavimą CXCR4 raiškos HGC27 ląstelių, kurios paslapčių didesnis. lygis TNF-alfa baltymo. TNF-alfa RNAi plazmidės buvo naudojamas transfekcijai HGC27 ląsteles ir atitinkamai nonsilencing RNRi plazmidės buvo įdarbintas į atitikmens kontrolę. Buvo pastebėta, kad išraiška TNF-alfa nestebėtas HGC27 ląstelių po transfekciją su TNF-alfa RNRi plazmidės (4E pav). Tada išraiška CXCR4 buvo aptiktas realaus laiko PGR, ir tai buvo pažymėta aptikti, kad po transfekciją su TNF-alfa RNAi plazmidžių, CXCR4 iRNR raiška buvo žymiai downregulated į HGC27 ląstelių, palyginti su ląstelėmis su valdymo RNAi ar ląstelių be RNAi (p
< 0,001, atitinkamai, 4F pav.)
indukcija citokinų makrofaguose H. pylori
realiojo laiko PGR ir Elisa dirbo įvertinti H. poveikį pylori 26695 nuo citokinų išraiškos į RAW264.7 ląstelių, nes ji yra visuotinai pripažinta, kad citokinai dalyvauja lėtinių uždegiminių procesų sukeltų H. pylori. Realaus laiko PGR aptikimo parodė išraišką TNF-alfa, IL-1β ir IL-6 mRNR buvo aktyvinama per 26695 gydytų ląstelių, lyginant su 26.695-neapdorotų ląstelių (TNF-alfa, p
< 0,001; IL-1β , P
< 0,001 ir IL-6, P
< 0,001, 5A pav). Ir Elisa rezultatai parodė daugiau baltymų TNF-alfa, IL-1β ir IL-6 buvo išskiriamas į kultūros supernatantą 26695 gydytų ląstelių, palyginti su 26695-neapdorotų ląstelių (TNF-alfa, p
< 0,001; IL-1β , P
< 0,001 ir IL-6, P
< 0,001, 5B pav). 5 paveikslas indukcijos citokinų makrofaguose H. Pylori. (A) ir (B) išraiška TNF-alfa, IL-1β ir IL-6 buvo aktyvinama į 26695 gydytų RAW264.7 ląstelių, * P
< 0.001, V.
neapdorotas ląstelės. (C) ir (D) Nei IL-1β, nei IL-6 gali upregulate CXCR4 išraiška MKN45 ląstelių. Duomenys yra pateikti kaip vidurkis ± SD, n = 3.
Galiausiai MKN45 ląstelės buvo gydomi egzogeninės IL-1β (50 ng /ml) ir IL-6 (50 ng /ml) atitinkamai, kad būtų atmesti galimybės, kad IL -1β ir IL-6 gali upregulate CXCR4 išraiška kaip TNF-alfa. Nei IL-1β nei IL-6 buvo nustatyta, kad upregulate CXCR4 išraišką reikšmingai (pav 5C, D).
Migracijos analizė
Migracijos analizė buvo atlikta naudojant Matrigel invazija kamerą, bandant ištirti, ar aktyvinama CXCR4 buvo funkcinis , Pradiniame etape eksperimento su 100 ng CXCL12 /ml apatinėje kameroje, buvo gerokai padidinti (iki 4,5 raukšlės) į MKN45 ląstelių migraciją su 26695 gydymo viršutiniame kambaryje, lyginant su kontrolinės ląstelių be 26.695 gydymas (p
< 0,001, 6a paveikslas). Vėliau, tačiau šis augimas buvo slopinamas nepaprastai kai AMD 3100 (1 g /ml, Sigma), CXCR4 antagonistas, arba infliksimabas, buvo įtraukta (P
< 0.01, atitinkamai, 6a paveikslas). 6 pav migracijos tyrimą. (A), MKN45 ląstelės parodė gerokai padidinti jų migracijos po gydymo 26695, * p
< 0.001, V.
kontrolę. Į migracijos MKN45 ląstelių sukeltų 26695 augimas buvo slopinamas, kai AMD 3100 (** p
< 0,01, lyginant
26.695 + AMD), arba infliksimabui (*** p
< 0,01, lyginant su
26.695 + inf) buvo įtraukta. AMD: AMD3100; INF: infliksimabas. (B) TNF-α padidėjo MKN45 ląstelių migraciją, * P
< 0.001, V.
kontrolę. Nei IL-1β nei IL-6 gali padidinti MKN45 ląstelių migraciją žymiai. Duomenys yra pateikti kaip vidurkis ± SD, n = 3.
Be to, taip pat buvo ištirti, ar tam citokinų apie MKN45 ląstelių migracija poveikis, ir TNF-α (50 ng /ml) buvo nustatyta, kad žymiai padidinti MKN45 ląstelių migraciją (P
< 0,001, 6B pav.) Tačiau, buvo įrodyta, kad skatinti MKN45 ląstelių migraciją žymiai (6B pav) nei IL-1β (50 ng /ml), nei IL-6 (50 ng /ml).
Aptarimas
H. pylori yra kaltinamas užkrėsti apie 50% pasaulio gyventojų kaip galutinį skrandžio kancerogenas žmonėms [12]. Patogenezė jos infekcijos dažnai apima uždegimą, gleivinės pažeidimas, ar skrandžio atrofija ir reikalauja glaudžius tarpusavio sąveiką tarp bakterijų ir skrandžio epitelinių ląstelių, įjungiant signalizacijos kelius, keisti šeimininko ląstelių funkcijas, ir todėl lėtinių epitelio atsakymų [13.14]. Šiuo metu yra nemažai įrodymų susiejimas lėtinis uždegimas žmogaus vėžio [15-17] ir specialiai H. pylori sukelta lėtinė uždegimu ir citokinų vietos skrandžio mikroaplinkos tarnauja kaip labiausiai paplitusių Autoriai [18-20]. Šis tyrimas pabrėžia rezultatą, kad gleivinės lygis TNF-alfa mRNR buvo žymiai didesnis H. pylori teigiamų pacientų, nei, kad neigiamų pacientų naudojant kiekybinis realaus laiko PGR, ir du skrandžio vėžio ląsteles, taip pat, sekretuoto TNF- baltymų in vitro. Ji taip pat atkreipia dėmesį į tai prielaida, kad TNF-α gali būti įtraukta į H. pylori teigiamą skrandžio kancerogenezės kaip būtinas ir stiprus tilteliu tarp uždegimas ir vėžio [21].
Nors indukcijos TNF-alfa mechanizmo H. pylori lieka gana neaiški, baltymų šeima buvo atskleista per pastarąjį dešimtmetį, įskaitant Helicobacter pylori membranos baltymo-1 (HP-MP1) ir TNF-alfa indukuojamojo baltymo (Tipα) [22-24]. Tipα genų, nustatė nuo H. pylori padermės 26695, yra homologiczne HP MP1 geno su 94,3% Homologijos ir abu rodo stiprų gebėjimą sukelti TNF-alfa genų ekspresiją. Tyrime H. pylori 26.695 buvo nustatyta, kad upregulate TNF-α išraišką reikšmingai MKN45 ir HGC27 ląstelių ir CAG PAI neigiamas padermės Tx30a taip pat buvo pastebėtas sukelti ją akivaizdu, kuris gali būti iš dalies dėl to, kad "HP-MP1 /Tipα šeima yra ne CAG PAI regione. Tačiau ji taip pat buvo pažymėta, kad Tx30a poveikis TNF-α indukcijos buvo silpnesnis nei 26695 (2,3 raukšlės vs
3.1 raukšlės MKN45 ląstelių), kuris pasiūlė H. pylori produktus CAG PAI gali būti taip pat dalyvauja indukcija. Tiesą sakant, tai buvo pranešta, kad CagA H. pylori gali paskatinti TNF-alfa skrandžio vėžio biopsijos [25]. Be to, išgrynintas H. pylori ureazės taip pat buvo nustatyta, kad sukelti MKN45 ląsteles išreikšti TNF- [26].
TNF-α, kuris yra pagrindinis citokinų į daugelio lėtinių uždegiminių ligų, iš pradžių buvo pavadintas kaip serumo veiksnys indukcijos hemoraginio nekrozė transplantuotų solidinių navikų pelių. Tačiau šiuo metu jis dažniausiai identifikuojami kaip naviko promotoriaus vietos naviko mikroaplinkos, taigi ir ištrynimą ar slopinimu Manoma, kad sumažinti eksperimentiniais vėžio tikimybę. TNF- /TNF-R1 numušti pelės yra atsparūs cheminiam sukeltos kancerogenezės [27, 28]. Ji dažnai aptinkama biopsijų iš žmogaus vėžio įvairovė, gaminiai gaminami arba epitelinių navikų ląstelių arba stromos ląstelėse. Be to, ji taip pat nustatė, nors mažo dydžio, daugelio vėžio linijų in vitro be uždegimo dirgiklius sekrecija, nors mechanizmas dar nėra visiškai aiškus.
TNF-α buvo rasti ne tik dalyvauja ląstelių transformaciją ir platinimu , bet taip pat naviko metastazių. Tokia išvada iš pradžių buvo grindžiamas gyvūnų modelyje su storosios žarnos vėžiu, kurioje injekcija LPS glaudesnio plaučių metastazių priklauso nuo TNF-alfa gamybą šeimininko ląsteles [29] vystymąsi. Tolesni rezultatai parodė, kad padidėja naviko metastazių slopinamas neutralizuoti TNF-alfa antikūnų [30]. Tai buvo mūsų spekuliacijos, kad viena iš pagrindinių mechanizmų TNF-alfa auglio metastazių, gali būti susijęs su chemokinus /chemokino receptorių ląstelę. Pirma, ten buvo reikšmingas ląstelę CXCR4 skrandžio vėžio ląstelių po to, kai jie buvo gydomi egzogeninės TNF-alfa. Buvo dar vienas akivaizdus ląstelę CXCR4 raiškos vėžinių ląstelių, kai jie buvo bendrai kultūringas su makrofagų, alternatyvaus šaltinio TNF-alfa skrandžio vėžio mikroaplinka. Kaip buvo tikimasi,, tai ląstelę gali būti slopinamas TNF-alfa neutralizuojančiu antikūnu infliksimabo. Yra todėl buvo puikus sumažinimas iš CXCR4 raiškos HGC27 ląstelių po RNRi dirbo panaikinti TNF-alfa išraiška šių ląstelių, o tai reiškia, endogeninio TNF-alfa taip pat gali upregulate CXCR4 išraiška. Bendrieji rezultatai lėmė mūsų išvados, kad TNF-α, su savaime dalyvauja skrandžio vėžio metastazių, upregulates CXCR4 išraiška.
Padidėjusi CXCR4, kurio dalyvavimas įvairiose žmogaus navikų yra gerai žinoma, dažnai buvo stebimas skrandžio vėžio audiniuose padidinti skrandžio vėžio metastazių. Kai kurios žmogaus skrandžio karcinomos ląstelės taip pat išreikšti CXCR4 mRNR ir baltymas, kuris yra aukšto lygio [7, 8]. Mūsų tyrimas parodė, H. pylori infekcija padidėjo MKN45 ląstelių migraciją per CXCR4 išraiška ląstelę. Gydymas su CXCR4 antagonistas AMD3100 lėmė reikšmingą slopinimo MKN45 ląstelių migraciją in vitro. Kitas tyrimas parodė, AMD3100 reikšmingai slopino į pilvaplėvės karcinomatoze plėtrą pelės modelio skrandžio vėžio, kuris buvo įrodytas naviko augimui ir ascitic skysčio susidarymo mažinimą [9]. Ankstesni tyrimai leido mūsų išvados, kad CXCR4 raiškos biopsija pavyzdį pirminės skrandžio vėžio gali tarnauti kaip Priešoperacinės vertinimo riziką, pilvaplėvės karcinomatoze atsiradimo.
Makrofagų įsitraukimą į kancerogenezės ir naviko invazija ir metastazių [31, 32 ] paprastai yra kaltinamas motyvuoti tAM (naviku susijęs makrofagų), didelių šaltinį TNF-alfa auglio mikroaplinkos, išleisti augimo faktorių, citokinų ir uždegimo mediatorių įvairovė. Tyrimas parodė, ten buvo reikšmingas išraiška TNF-alfa sukeltas H. pylori, ir tuo pačiu metu ląstelę IL-1beta ir IL-6 RAW264.7 ląstelių, Tačiau, pastaroji variacijos nepavyko sukelti CXCR4 išraiška MKN45 ląstelių.
tyrimai galiausiai priskirtas nenormalus aktyvavimo NF-κB į vėžio ląsteles, kad perviršinio sekrecijos TNF-alfa, kurio vaidmuo CXCR4 ląstelę vėliau prielaida gali būti susijusi su keliais tarpininkaujant NF-κB. Kiti rezultatai parodė, TNF-α blokatoriai gali slopinti CXCR4 išraiška H. pylori ląstelę, o ji ir CXCR4 antagonistai gali slopinti didėjančią migraciją skrandžio vėžio ląsteles in vitro. Šie rezultatai rodo, kad vien tik šių antagonistai, arba kartu su kitais vaistais, gali tarnauti kaip veiksmingas gydymo skrandžio vėžiu sergantiems pacientams.
Išvadas
TNF-α yra dalyvauja CXCR4 išraiška ląstelę skrandžio vėžio sukelta H. pylori.
deklaracijų
Padėka
šis darbas parėmė dotaciją iš skyriaus švietimo, Liaoningo provincijoje, Kinija (2009A751). originalūs
Autorių pateikti failai vaizdų
Žemiau išvardintos nuorodos autorių originalios pateiktų failų vaizdų. 12885_2009_2218_MOESM1_ESM.tiff Autorių originalus failas 1 pav 12885_2009_2218_MOESM2_ESM.tiff Autorių originalaus failo 2 pav 12885_2009_2218_MOESM3_ESM.tiff Autorių originalios 3 pav 12885_2009_2218_MOESM4_ESM.tiff Autorių originalaus failo 4 pav 12885_2009_2218_MOESM5_ESM.tiff Autorių originalaus failo 5 paveiksle 12885_2009_2218_MOESM6_ESM.tiff autorių originalus failas 6 pav konkuruojančių interesų Viesbutis The autoriai deklaruoja, kad jie neturi jokių konkuruojančių interesų.

• Interleukino-23A yra susijęs su naviko augimo Helicobacter pylori--susijusių žmogaus skrandžio vėžio
• Dažniausiai Robotų Bariatric procedūros: apžvalga ir techniniai aspektai