Inddragelse af tumornekrosefaktor-α i opregulering af CXCR4 ekspression i gastrisk cancer fremkaldt af Helicobacter pylori

Inddragelse af tumornekrosefaktor-α i opregulering af CXCR4 ekspression i gastrisk cancer fremkaldt af Helicobacter pylori
Abstract
Baggrund
H. pylori, hvis infektion øger tumorindtrængen og metastase, er generelt mærket som den stærkeste risiko faktor for udviklingen af ​​mavekræft. Det synes ikke at være en tilfældighed, at der også er en overekspression af CXCR4 og en oplagt involvering i mavekræft metastaser. Formålet med denne undersøgelse forsøger at undersøge og yderligere at etablere en forbindelse mellem dem. Med H. pylori er en potent inducer af TNF-α, hvorvidt TNF-α, en tumor promotor, er involveret i induktionen af ​​CXCR4 ekspression af H. pylori var også under forskning i denne undersøgelse.
Metoder Salg Expression af CXCR4, TNF-α, IL-6 og IL-1β-mRNA blev bestemt ved real-time PCR. CXCR4-proteinekspression blev detekteret ved Western blotting. Koncentrationer af TNF-α, IL-6 og IL-1β i cellekultursupernatanter blev målt under anvendelse af Quantikine ELISA Kit. At ophæve TNF-α ekspression i HGC27 celler blev TNF-a RNAi plasmid anvendes til at transficere dem. Search Results Salg Niveauer af CXCR4 og TNF-α-mRNA signifikant højere i H. pylori-positive gastriske cancere (n = 19) sammenlignet med H. pylori-negative (n = 15). En efterfølgende Spearman rang korrelation test viste, at der var en positiv korrelation mellem niveauet af CXCR4 mRNA og at af TNF-α i 34 primære gastrisk kræft. Andre resultater følges: Ekspression af CXCR4 og TNF-α blev opreguleret i gastrisk cancercellelinie MKN45 og HGC27 efter infektion med H. pylori 26.695 (CAG PAI +) eller Tx30a (CAG PAI -); Induktionen af ​​CXCR4 ekspression af H. pylori blev inhiberet væsentligt af en neutraliserende TNF-α-antistof, infliximab; CXCR4 ekspression blev opreguleret i MKN45 celler efter behandling med exogent TNF-α eller co-kultur med makrofag, og blev nedreguleret i HGC27 celler efter transfektion med TNF-a RNAi plasmid. Der var en signifikant stigning i migration af MKN45 celler behandlet med H. pylori 26.695, og en stærk hæmning når AMD 3100, en CXCR4-antagonist eller infliximab, blev tilsat.
Konklusioner Salg Vores resultater viste, at H. pylori opregulerer CXCR4 ekspression i gastrisk cancer gennem TNF-α.
Baggrund
det er godt accepteret, at Helicobacter pylori (H. pylori) er en stærk risikofaktor for udvikling af forskellige mavesygdomme, nemlig kronisk gastritis, mavesår, maveslimhinden-associeret lymfevæv lymfom og mavecancer, og det er anerkendt, at interaktionen mellem H. pylori og epitelceller bidrager til denne udvikling. Faktisk H. pylori-infektion inducerer inflammation i mikromiljø i maven i forbindelse med induktion af proinflammatoriske cytokiner, såsom tumornekrosefaktor-α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β) og IL-6 [1-3 ], hvilket gør gastrisk carcinogenese befordrende.
H. pylori-infektion øger også tumorindtrængen og metastase [4-6], selvom mekanismen er stadig ikke godt forstået. Processen med cancermetastase er ikke tilfældig, og forskellige kræftformer har deres foretrukne homing sites. Ligesom leukocyt-trafik, er tumorcellemigration kritisk reguleret af chemokin /kemokinreceptor system. Et andet fokus for vores opmærksomhed udgydes på CXCR4, den mest almindelige kemokinreceptoren overudtrykt i en række af cancere (gastrisk cancer inkluderet) langt [7, 8]. Undersøgelser har indikeret CXCL12 /CXCR4 akse er involveret i gastrisk cancer metastase [9]. Derfor vækker stor interesse for at finde en forbindelse mellem H. pylori infektion og CXCR4 overekspression i mavekræft.
Et af de vigtigste kemiske mediatorer impliceret i inflammationsassocierede kræftformer er TNF-α, og der er nu betydelige beviser i sin involvering i fremme og progression af eksperimentelle og menneskelige kræftformer [10, 11]. True til sit navn, kan høje doser af regional TNF-α medføre hæmoragisk nekrose via selektiv destruktion af tumor blodkar. Det kan imidlertid uventet virke som en endogen tumorpromotoren når det produceres i tumormikromiljøet. Vores interesse er følgelig trækkes til sin deltagelse i induktionen af ​​CXCR4 ekspression af H. pylori, en potent inducer af TNF-α, som vides at opregulere en række cytokiner, kemokiner, adhæsionsmolekyler og vækstfaktorer i cancere.
Metoder
mavekræft cellelinjer og vævsprøver
humane mavekræft celle MKN45 og HGC27 blev opnået fra Keygen Biotech. Co (Nanjing, Kina), og blev dyrket i RPMI 1640 suppleret med 10% føtalt bovint serum ved 37 ° C i en fugtig inkubator med 5% CO 2. 34 primære mavekræft enheder er anskaffet fra patienter under operation med alle deres informerede samtykke ved Shengjing hospital, kinesisk Medical University, og blev frosset i flydende nitrogen umiddelbart efter kirurgisk fjernelse. Haematoxylin- og eosin-farvning sektioner blev forberedt til vurdering af den procentdel af tumorceller, og kun prøver med > 70% tumorceller blev udvalgt til analyse. Denne undersøgelse blev udført med godkendelse af den etiske komité i Kina Medical University. Alle forsøg blev udført mindst tre gange.
Makrofagcellelinie RAW264.7
makrofag celle RAW 264.7 blev leveret af American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA), og blev opretholdt i Dulbeccos modificerede Eagles medium suppleret med 10% føtalt bovint serum ved 37 ° C i en fugtig inkubator med 5% CO 2.
H. pylori stammer
H. pylori-stamme 26.695 (ATCC 700.392, cag PAI +) og Tx30a (ATCC 51.932, cag PAI -) blev tilbudt af ATCC (Rockville, MD, USA). De blev dyrket på fåreblodagarplader ved 37 ° C under mikroaerofile betingelser. Bakterier blev overført efter 48 timer i Brucella-bouillon indeholdende 5% føtalt bovint serum i 24 timer. En infektionsmultiplicitet på 100 blev anvendt i alle forsøg.
Realtid revers-transkription PCR
Totalt RNA blev isoleret fra væv og cellelinier af Trizol (Takara, Dalian, Kina) ifølge protokollen leveret af producenter. cDNA blev syntetiseret under anvendelse af Takara RNA PCR 3.0 Kit (Takara, Dalian, Kina) i et totalt volumen på 10 pi indeholdende AMV-revers transkriptase, 0,5 pi; tilfældig 9 primer, 0,5 pi; 25 mM MgCl 2, 2 pi; 10 × RT puffer, 1 pi; dNTP-blanding (hver 10 mM), 1 pi; RNase-inhibitor, 0,25 pi; RNA 1 pi; dH 2O, 3,75 pi. Betingelser for RT var: 30 ° C i 10 minutter, 42 ° C i 25 minutter, 99 ° C i 5 minutter, og 5 ° C i 5 minutter. Real-time PCR blev udført ved anvendelse af LightCycler systemet sammen med LightCycler DNA Master SYBR Green I Kit (Roche Diagnostics). Det samlede volumen er 20 pi, indeholdende 25 mM MgCl 2, 3 pi; 10 × buffer, 5 pi; 10 uM fremadrettet primer, 1 pi; 10 uM revers primer, 1 pi; LightCycler DNA Master SYBR Green I, 2 pi; cDNA, 2 pi; dH 2O, 6 pi. Betingelser for PCR var: 50 ° C i 2 minutter, 95 ° C i 10 minutter og derefter 40 cykler af 5 sekunder ved 95 ° C og 20 sekunder ved 60 ° C. Husholdning gen glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH
) blev anvendt som en intern kontrol. Genekspression blev kvantificeret ved den sammenlignende CT metode, normalisering CT værdier til GAPDH
og beregning relative ekspressionsniveauer værdier. Primer sekvenser blev leveret af Takala (Dalian, Kina) som følger: CXCR4
fremad, 5'-GAGGAAATGGGCTCAGGG-3 ', omvendt, 5'-AGTCAGCAGGAGGGCAGGGA-3'; TNF-α
fremad, 5'-AGTGACAAGCCTGTAGCCC-3 ', reverse, 5'-GCAATGATCCCAAAGTAGACC-3'; IL-1β
fremad, 5'-CCACCACTACAGCAAGGG-3 ', reverse, 5'-GAACTGGGCAGACTCAAA-3'; IL-6
fremad, 5'-CCTTCGGTCCAGTTGCCTTCT-3 ', reverse, 5'-GCATTTGTGGTTGGGTCA-3'; GAPDH
fremad, 5'-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3 ', reverse, 5'-AAAGGTGGAGGAGTGGGT-3'. Salg Western blotting Salg Cellelysater blev fremstillet med prøvepuffer [50 mmol /L Tris-HCI (pH 6,8 ), 100 mmol /l DTT, 2% SDS, 0,1% bromphenolblåt og 10% glycerol] og blev udsat for en 12% natriumdodecylsulfat (SDS) /acrylamidgel. Proteinerne på acrylamidgel blev overført til en nylonmembran, som blev blokeret natten (4 ° C i PBS med 0,1% Tween og 10% mælkepulver). Polyklonale antistoffer for CXCR4 (Santa Cruz, CA, USA), og de tilsvarende sekundære antistoffer (Santa Cruz, CA, USA) blev anvendt før immunblotting. Det humane gen β-actin
(Santa Cruz, CA, USA) blev anvendt som en intern kontrol. Blots blev visualiseret med FX Pro Plus-systemet (Bio-Rad) og kvantificeret under anvendelse Scion Billede 4.03 software.
RNA-interferens
TNF-a RNAi plasmid og nonsilencing kontrol RNAi plasmid blev indkøbt fra Takala (Dalian, Kina). Celler blev podet i en 24-brønds plade med en tæthed på 2 x 10 5. Den følgende dag blev celler transficeret med TNF-a siRNA eller kontrol siRNA anvendelse af lipofectamin 2000 (Invitrogen, Storbritannien) i overensstemmelse med producentens anvisninger.
Elisa for cytokiner i cellekultursupernatanter Salg Koncentrationer af TNF-α, IL-1β og IL-6 i cellekultursupernatanter blev målt under anvendelse af Quantikine ELISA kit (Boster, Wuhan, Kina) ifølge producentens instruktioner. Følsomheden af ​​assayet var 2 pg /ml for TNF-α, 4 pg /ml for IL-1β og 4 pg /ml for IL-6.
Migration assays Salg Migrationen af ​​dyrkede celler blev analyseret under anvendelse Matrigel invasion kammer (24-brønds format, 8 um pore, BD Pharmingen). Celler (5 x 10 5) blev tilsat til det øvre kammer og medium tilsat CXCL12 (100 ng /ml, Sigma) blev tilsat til det nederste kammer. Migration assays blev inkuberet i 18 timer ved 37 ° C og 5% CO 2. Migrerede celler på den nedre overflade blev farvet under anvendelse af 1% toluidinblåt efter fiksering med 100% methanol. For hver transwell, antallet af migrerede celler i 10 medium power felter (× 20) blev talt.
Statistisk analyse
Mann-Whitney U
-test blev anvendt til at sammenligne mRNA-ekspression mellem H. pylori-positiv og H. pylori-negative tumorer. Korrelation mellem CXCR4 ekspression og TNF-α ekspression i gastrisk cancer prøver blev analyseret ved anvendelse Spearman rang korrelation test. Ekspression af mRNA i gastriske cellelinier blev sammenlignet ved anvendelse af Students t-test
eller envejs-ANOVA. Statistisk analyse blev udført under anvendelse af SPSS-version 11.0 (SPSS, Chicago, IL, USA). Forskel blev betragtet som signifikant, når P
-værdi var < 0.05.
Resultater
Ekspression af CXCR4 og TNF-α mRNA i primære gastrisk kræft
CXCR4 mRNA blev bestemt ved real-time reverse transkription PCR i 34 gastrisk kræft, og dens udtryk i hver prøve blev standardiseret til GAPDH
udtryk. Resultaterne afslørede dens niveau betydeligt højere i H. pylori-positive gastriske cancere (n = 19) sammenlignet med H. pylori-negative (n = 15) (7.2 fold, P
< 0,01, figur 1A). I samme kohorte af tumorer, blev TNF-α-mRNA-ekspression også detekteret ved real-time revers-transkription-PCR, og det blev konstateret stærkere i H. pylori-positive gastriske cancere sammenlignet med H. pylori-negative (4,3 fold, P
< 0,01, figur 1B). Spearman rang korrelation test yderligere verificeret en positiv korrelation af CXCR4 udtryk med TNF-α i disse 34 gastrisk kræft (P
< 0,01, figur 1C). Figur 1 Ekspression af CXCR4 og TNF-α mRNA i primære gastrisk kræft ved real-time PCR. (A) og (B) H. pylori-positiv gastriske cancere (grå søjler, n = 19) er udtrykt højere CXCR4 (A) og TNF-α (B) mRNA sammenlignet med H. pylori-negative gastriske cancere (sorte søjler , n = 15), * P
< 0,01. Vandrette linjer: midler til mRNA-niveau. (C) Niveau af CXCR4 mRNA blev korreleret positivt med den af ​​TNF-α mRNA i 34 gastrisk kræft, P
< 0,01. Sort rombe: H. pylori-negative gastriske cancere; grå rhombus:. H. pylori-positive gastriske cancere
Induktion af CXCR4 og TNF-α ekspression af H. pylori i mavens cancerceller
Real time-PCR og Western blotting blev anvendt til at detektere CXCR4 ekspression i MKN45 og HGC27 celler (figur 2A, B); og afslører det opreguleres signifikant i dem efter infektion med H. pylori 26.695 i 24 timer (P
< 0,01 henholdsvis figur 2A, B). Efterfølgende blev de behandlet med en CAG PAI-negative H. pylori, Tx30a at bestemme dens engagement i opregulering, og det er også fundet at inducere CXCR4 udtryk i MKN45 og HGC27 celler (P
< 0,01, henholdsvis figur 2A , B). Figur 2 Ekspression af CXCR4 og TNF-α i MKN45 og HGC27 celler efter infektion med H. pylori. (A) og (B) CXCR4 ekspression blev opreguleret i MKN45 og HGC27 celler efter infektion med H. pylori 26.695 (* P
< 0,01 henholdsvis vs
H. pylori) eller Tx30a (* P
< 0,01 henholdsvis vs
H. pylori). (C) og (D) TNF-α ekspression blev øget i MKN45 og HGC27 celler efter infektion med H. pylori 26.695 (* P
< 0,01 henholdsvis vs
H. pylori) eller Tx30a (* P
< 0,01 henholdsvis vs
H. pylori). Data er udtrykt som middelværdi ± SD, n = 3.
Virkningen af ​​H. pylori-infektion på TNF-α ekspression blev yderligere undersøgt ved hjælp af real-time PCR og Elisa, og påvisningen afslørede, at infektion med 26.695 eller Tx30a i 12 timer kan have ført til både mere udtryk af TNF-α mRNA (P
< 0,01, henholdsvis) og mere sekretion af TNF-α protein i kultursupernatanten (P
< 0,01, henholdsvis) i MKN45 og HGC27 celler (figur 2C, D). Salg Virkning af Infliximab, et neutraliserende antistof mod TNF-α, på induktionen af ​​CXCR4 ekspression af H. Pylori
konstatering af opregulering af TNF-α ekspression i dette tilfælde bragt os til yderligere forskning om sit engagement i induktion af CXCR4 udtryk af H. pylori. Et neutraliserende TNF-α-antistof, infliximab (4 pg /ml, Sigma), blev derefter anvendt til at behandle MKN45 og HGC27 celler efter en infektion med 26.695, og induktionen af ​​CXCR4 blev inhiberet signifikant (P
< 0,01, henholdsvis figur 3A, B). Der blev observeret lignende resultater, når disse celler blev behandlet med infliximab efter en infektion med Tx30a (P
< 0,01 henholdsvis Figure3C, D). Figur 3 Virkning af infliximab på induktionen af ​​CXCR4 ekspression af H. Pylori. (A) og (B) CXCR4 opregulering induceret af H. pylori 26.695 blev inhiberet i MKN45 og HGC27 celler efter behandling med infliximab, * P
< 0,01 henholdsvis vs
26.695 + inf. (C) og (D) CXCR4 opregulering fremkaldt af H. pylori Tx30a blev også hæmmet i MKN45 og HGC27 celler efter behandling med infliximab, * P
< 0,01 henholdsvis vs
Tx30a + inf. Data er udtrykt som middelværdi ± SD, n = 3. inf:. Infliximab
opregulering af CXCR4 ekspression i gastriske cancerceller af TNF-α
MKN45 celler, som hemmelig lavere niveau af TNF-α-protein, blev behandlet med 1, 10 eller 50 ng /ml TNF-α (Sigma) i 6 timer i forsøg på yderligere at undersøge den rolle, som TNF-α i opregulering af CXCR4 ekspression og realtid-PCR og Western blotting påvisning afslørede det blev opreguleret signifikant på en dosis-afhængig måde (P
< 0,01, figur 4A, B), og selv med 15,8 folder med 50 ng /ml TNF-α behandling. Figur 4 opregulering af CXCR4 ekspression i gastriske cancerceller af TNF-α. (A) og (B) CXCR4 ekspression blev opreguleret i MKN45 celler med exogent TNF-α i en dosis-afhængig måde, * P
< 0,01. (C) og (D) Det cokultur system MKN45 og RAW264.7 celler udtrykkes mere CXCR4, * P
< 0,001, vs
M; ** P
< 0,001, vs
R. opregulering af CXCR4 ekspression blev hæmmet efter behandling med infliximab, *** P
< 0,001, vs
M + R + inf. M: MKN45; R: RAW264.7; inf: infliximab. (E) Ekspression af TNF-α var til stede i HGC27 celler efter transfektion med TNF-a RNAi plasmid. (F) CXCR4 mRNA-ekspression nedreguleret i HGC27 celler efter transfektion med TNF-a RNAi plamid, * P
< 0,001, vs
Ingen RNAi; ** P
< 0,001, vs
Kontrol RNAi. Data er udtrykt som middelværdi ± SD, n = 3.
Dernæst CXCR4 ekspression i et co-kultursystem blev undersøgt, da tumorassocierede makrofager også tjene som en kilde til TNF-α i gastrisk cancer mikromiljø. En co-kultur af MKN45 celler med RAW264.7 celler i 24 timer, der gav udtryk for betydeligt mere CXCR4 mRNA og protein (P
< 0,001, figur 4C, D); denne stigning blev imidlertid væsentligt hæmmet af infliximab (P
< 0,001, figur 4C, D)
Endelig blev endogene TNF-α målrettet at vurdere dets forordning om CXCR4 udtryk i HGC27 celler, som hemmeligheder højere. niveau af TNF-α-proteinet. TNF-a RNAi plasmid blev anvendt til transfektion HGC27 celler, og tilsvarende nonsilencing RNAi plasmid blev ansat i modstykket som kontrol. Det blev observeret, at ekspression af TNF-α var til stede i HGC27 celler efter transfektion med TNF-a RNAi plasmid (figur 4E). Derefter ekspression af CXCR4 blev detekteret ved real-time PCR, og det blev bemærket i påvisningen, at efter transfektion med TNF-a RNAi plasmid blev CXCR4 mRNA-ekspression nedreguleres signifikant i HGC27 celler sammenlignet med celler med kontrol RNAi eller celler uden RNAi (P
< 0,001 henholdsvis Figur 4F). blev
Induktion af cytokiner i makrofager af H. pylori
Real-time PCR og Elisa anvendes til at evaluere effekten af ​​H. pylori 26.695 på cytokinekspression i RAW264.7-celler, da det er almindeligt anerkendt, at cytokiner er involveret i kroniske inflammatoriske processer forårsaget af H. pylori. Real-time PCR påvisning viste ekspression af TNF-α, IL-1β og IL-6-mRNA blev opreguleret i 26695-behandlede celler sammenlignet med 26.695-ubehandlede celler (TNF-a, P Salg < 0,001; IL-1β , P
< 0,001 og IL-6, P
< 0,001, figur 5A). Og ELISA-resultater er angivet flere proteiner af TNF-α, IL-1β og IL-6 blev udskilt i kultursupernatanten i 26695-behandlede celler sammenlignet med 26695-ubehandlede celler (TNF-a, P Salg < 0,001; IL-1β , P
< 0,001 og IL-6, P
< 0,001, figur 5B). Figur 5 Induktion af cytokiner i makrofager af H. Pylori. (A) og (B) Ekspression af TNF-α, IL-1β og IL-6 blev opreguleret i 26695-behandlede RAW264.7-celler, * P
< 0.001, vs
ubehandlede celler. (C) og (D) Hverken IL-1β eller IL-6 kan opregulere CXCR4 ekspression i MKN45 celler. Data er udtrykt som middelværdi ± SD, n = 3.
Endelig MKN45 celler blev behandlet med exogent IL-1β (50 ng /ml) og IL-6 (50 ng /ml) henholdsvis at udelukke, at IL -1β og IL-6 kan opregulere CXCR4 ekspression ligesom TNF-α. Hverken IL-1β eller IL-6 viste sig at opregulere CXCR4 ekspression markant (figur 5C, D).
Migrationsanalyse
Migration analyse blev udført under anvendelse af Matrigel invasion kammer i et forsøg på at undersøge, om opreguleret CXCR4 var funktionelle . I den indledende fase af forsøget med 100 ng /ml CXCL12 i det nedre kammer, var der en signifikant stigning (op til 4,5 folder) i migreringen af ​​MKN45 celler med 26.695 behandling i det øvre kammer, sammenlignet med kontrolceller uden 26.695 behandling (P
< 0,001, figur 6A). Senere blev imidlertid stigningen inhiberes bemærkelsesværdigt når AMD 3100 (1 ug /ml, Sigma), en CXCR4-antagonist eller infliximab, blev tilsat (P
< 0,01 henholdsvis figur 6A). Figur 6 Migration undersøgelse. (A) MKN45 celler viste en signifikant stigning i deres vandring efter behandling med 26.695, * P
< 0,001, vs
kontrol. Stigningen i migration af MKN45 celler induceret af 26.695 blev hæmmet, da AMD 3100 (** P
< 0,01, vs
26.695 + AMD), eller infliximab (*** P
< 0,01, vs
26.695 + inf) blev tilsat. AMD: AMD3100; inf: infliximab. (B) TNF-α øget MKN45 cellemigration, * P
< 0,001, vs
kontrol. Hverken IL-1β eller IL-6 kan øge MKN45 cellemigrering betydeligt. Data er udtrykt som middelværdi ± SD, n = 3.
Desuden blev virkningen af ​​cytokiner på MKN45 cellemigrering også undersøgt, og TNF-α (50 ng /ml) viste sig at øge MKN45 cellemigrering signifikant (P
< 0,001, figur 6B). Imidlertid blev hverken IL-1β (50 ng /ml) eller IL-6 (50 ng /ml) viste sig at fremme MKN45 cellemigrering betydeligt (figur 6B).
Diskussion
H. pylori er skylden til at inficere omkring 50% af verdens befolkning som en endelig gastrisk kræftfremkaldende for mennesker [12]. Patogenesen af ​​sin infektion ofte indbefatter inflammation, mucosal beskadigelse, eller gastrisk atrofi, og det kræver tæt interaktioner mellem bakterierne og gastriske epitelceller, aktivering signalveje, modificere værten cellulære funktioner, og som fører til kroniske epiteliale responser [13.14]. Der er nu opnået betydelige beviser forbinder kronisk inflammation til humane cancere [15-17] og specifikt H. pylori-induceret kronisk inflammation og cytokiner i lokal mave mikromiljø tjener som de mest almindelige bidragydere [18-20]. Denne undersøgelse fremhæver det resultat, at mucosale niveau af TNF-α-mRNA var signifikant højere hos H. pylori positive patienter end i negative patienter ved hjælp af kvantitativ real-time PCR, og to gastriske cancerceller secerneres også TNF-α-protein in vitro. Det yderligere peger på den antagelse, at TNF-α kan være involveret i H. pylori positiv gastrisk carcinogenese som et uundværligt og stærk linker mellem betændelse og kræft [21].
Selvom mekanismen for induktion af TNF-α af H. pylori stadig forholdsvis uklar, har en proteinfamilie blevet beskrevet i det sidste årti, herunder Helicobacter pylori-membranprotein-1 (HP-MP1) og TNF-α inducerende protein (Tipα) [22-24]. Tipα gen, der er konstateret fra H. pylori stamme 26.695, er homolog med HP-MP1 gen med 94,3% homologi, og begge viser stærk evne til at inducere TNF-α-genekspression. I undersøgelsen, H. pylori 26.695 fandtes at opregulere TNF-α ekspression betydeligt i MKN45 og HGC27 celler, og CAG PAI negativ stamme Tx30a også blev spottet at inducere det naturligvis, som kan være delvis skyldes, at HP-MP1 /Tipα familie er ikke i cag PAI region. Det blev imidlertid også bemærket, at virkningen af ​​Tx30a på TNF-α induktion var svagere end den for 26695 (2,3 folder vs
3.1 folder i MKN45 celler), som foreslået H. pylori produkter i cag PAI kan også involveret i induktion. Faktisk havde det været rapporteret, at CagA af H. pylori kunne fremkalde TNF-α i gastrisk cancer biopsi prøver [25]. Desuden oprenset H. pylori urease viste sig også at inducere MKN45 celler til at udtrykke TNF-α [26].
TNF-α, et centralt cytokin i mange kroniske inflammatoriske sygdomme, der oprindeligt var mærket som et serum faktor til induktion af hæmoragisk nekrose af transplanterede faste tumorer i mus. Men for tiden er det almindeligt identificeret som en tumor promotor i lokal tumor mikromiljø, og derfor deletion eller inhibering af det formodes for at reducere forekomsten af ​​eksperimentelle cancerformer. TNF-a /TNF-R1 vælte mus resistente over for kemisk induceret carcinogenese [27, 28]. Det er ofte fundet i biopsier fra en række forskellige humane cancere, fremstilles enten ved epiteliale tumorceller eller stromale celler. Desuden er det også fundet, men i lav mængde, i sekretionen af ​​mange cancerceller linjer in vitro uden inflammatoriske stimuli, selvom mekanismen er stadig ikke helt klar.
TNF-α viste sig ikke kun involveret i celletransformation og proliferation , men også i tumormetastase. Sådan konstatering var oprindeligt baseret på en dyremodel med coloncancer, hvori injektion af LPS forøgede udviklingen af ​​lunge metastase afhængig af TNF-α-produktion af værtsceller [29]. De efterfølgende resultater viste den øgede tumormetastase inhiberes ved at neutralisere TNF-α-antistof [30]. Disse førte til vores spekulationer om, at en af ​​de underliggende mekanismer af TNF-α i tumormetastase kan være relateret til opregulering af kemokiner /kemokinreceptorer. Først var der en signifikant opregulering af CXCR4 i gastriske cancerceller efter at de blev behandlet med eksogent TNF-α. Der var en anden indlysende opregulering af CXCR4-ekspression i cancerceller efter at de blev co-dyrket med makrofag, en alternativ kilde til TNF-α i gastrisk cancer mikromiljø. Som forventet kunne denne opregulering inhiberes af TNF-α neutraliserende antistof infliximab. Der var derfor en bemærkelsesværdig reduktion af ekspressionen af ​​CXCR4 i HGC27 celler efter RNAi blev anvendt til at ophæve TNF-α-ekspression i disse celler, hvilket indikerede endogen TNF-α kan også opregulere CXCR4 ekspression. De overordnede resultater førte til vores konklusion, at TNF-α, med sig selv er involveret i metastase af gastrisk cancer, opregulerer CXCR4 ekspression.
Overekspression af CXCR4, hvis deltagelse i forskellige humane tumorer er velkendt, blev ofte observeret i gastrisk cancer væv at øge gastrisk cancer metastase. Nogle humane gastriske carcinoma celler udtrykker også CXCR4 mRNA og protein i høje niveauer [7, 8]. Vores undersøgelse viste H. pylori infektion steg MKN45 cellemigrering gennem opregulering af CXCR4 ekspression. Behandlingen med en CXCR4-antagonist AMD3100 resulterede i en signifikant suppression af MKN45 cellemigrering in vitro. En anden undersøgelse viste AMD3100 undertrykte signifikant udviklingen af ​​peritoneal carcinomatose i en musemodel for gastrisk cancer, som blev vist ved reduktion af tumorvækst og ascitesvæske formation [9]. De tidligere undersøgelser førte til vores konklusion, at CXCR4 overekspression i biopsi eksemplar af primær mavekræft kan tjene som en præoperativ vurdering af risici for forekomsten af ​​peritoneal carcinomatose.
Makrofager inddragelse i carcinogenese og tumor invasion og metastase [31, 32 ] generelt skylden for at motivere TAM'er (tumorassocieret makrofager), en vigtig kilde til TNF-α i tumormikromiljøet, at frigive en række forskellige vækstfaktorer, cytokiner og inflammatoriske mediatorer. Undersøgelsen afslørede, at der var en betydelig ekspression af TNF-α induceret af H. pylori, og samtidigt opregulering af IL-1 beta og IL-6 i RAW264.7-celler, Denne sidstnævnte variation inducerede ikke CXCR4 ekspression i MKN45 celler.
Undersøgelser har i sidste ende tilskrives unormal aktivering af NF-KB i cancerceller til overdreven sekretion af TNF-α, hvis rolle i CXCR4 opregulering efterfølgende antages at være relateret til veje medieret af NF-KB. Andre fund har afsløret TNF-α-antagonister kan inhibere opreguleringen af ​​CXCR4 ekspression af H. pylori, og både det og CXCR4-antagonister kan undertrykke den forøgede migration af gastriske cancerceller in vitro. Disse resultater antyder, at disse antagonister alene eller i kombination med andre terapier, kan tjene som effektive terapier til mavecancerpatienter
Konklusioner
TNF-α er involveret i opregulering af CXCR4 ekspression i gastrisk cancer fremkaldt af H.. pylori.
erklæringer
Tak
Dette arbejde blev støttet af en bevilling fra Division of Education, Liaoning-provinsen, Kina (2009A751). originale filer indsendte
Forfattere "for Images of Nedenfor er de links til forfatternes oprindelige indsendte filer til billeder. 12885_2009_2218_MOESM1_ESM.tiff Forfatternes oprindelige fil til figur 1 12885_2009_2218_MOESM2_ESM.tiff Forfatternes oprindelige fil til figur 2 12885_2009_2218_MOESM3_ESM.tiff Forfatternes oprindelige fil til figur 3 12885_2009_2218_MOESM4_ESM.tiff Forfatternes oprindelige fil til figur 4 12885_2009_2218_MOESM5_ESM.tiff Forfatternes oprindelige fil til figur 5 12885_2009_2218_MOESM6_ESM.tiff forfatternes oprindelige fil til figur 6 konkurrerende interesser
forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende interesser.

• Interleukin-23A er forbundet med tumorvækst i Helicobacter-pylori-relaterede human gastrisk cancer
• Mest almindelige robot bariatriske procedurer: gennemgang og teknisk aspects