Die Beteiligung von Tumor-Nekrose-Faktor-α in der Hochregulation von CXCR4-Expression in Magenkrebs durch Helicobacter pylori induziert

Beteiligung von Tumor-Nekrose-Faktor-α in der Hochregulation von CXCR4-Expression in Krebsmagen induziert durch Helicobacter pylori
Zusammenfassung
Hintergrund
H. pylori, deren Infektion erhöht Tumor Invasivität und Metastasierung, wird allgemein als die stärkste Risiko gekennzeichnet Faktor für die Entwicklung von Magenkrebs. Es scheint kein Zufall zu sein, dass es auch eine Überexpression von CXCR4 ist und eine offensichtliche Beteiligung an Magenkrebs Metastasen. Das Ziel dieser Studie versucht zu untersuchen und eine Verbindung zwischen ihnen herzustellen fördern. Mit H. ist ein potenter Induktor von TNF-α-pylori, ob TNF-α, ein Tumorpromotor, bei der Induktion von CXCR4-Expression von H. pylori beteiligt ist auch in dieser Studie unter Forschung war.
Methoden
Expression von CXCR4, TNF-α, IL-6 und IL-1β-mRNA wurde durch Echtzeit-PCR bestimmt. CXCR4-Protein-Expression wurde durch Western-Blot nachgewiesen. Konzentrationen von TNF-α, IL-6 und IL-1β in Zellkulturüberstände wurden unter Verwendung des Quantikine ELISA-Kit gemessen. Zu TNF-α-Expression in Zellen HGC27, TNF &agr; RNAi-Plasmid wurde verwendet, um sie zu transfizieren.
Ergebnisse
Levels von CXCR4 und TNF-α-mRNA waren signifikant höher bei H. pylori-positiven Magenkarzinome (n = abschaffen 19) gegenüber H. pylori-negativen (n = 15). Ein anschließend Spearman-Rangkorrelationstest zeigte eine positive Korrelation zwischen der Höhe der CXCR4-mRNA und der TNF-α in 34 primären Magenkrebs. Weitere Ergebnisse folgen: Expression von CXCR4 und TNF-α wurde in Magenkrebszelle MKN45 und HGC27 nach der Infektion upregulated mit H. pylori-26695 (cag PAI +) oder Tx30a (cag PAI -); Die Induktion von CXCR4-Expression von H. pylori wurde signifikant durch eine neutralisierende TNF-α-Antikörper Infliximab gehemmt; CXCR4-Expression wurde in MKN45-Zellen nach der Behandlung mit exogenem TNF-α oder Co-Kultur mit Makrophagen aufreguliert und wurde in HGC27 Zellen nach Transfektion mit TNF &agr; RNAi Plasmid abreguliert. Es war mit H. behandelt eine deutliche Zunahme bei der Migration von MKN45 Zellen pylori-26695, und eine starke Hemmung, wenn AMD 3100, ein CXCR4-Antagonisten oder Infliximab aufgenommen.
Schlussfolgerungen
Unsere Ergebnisse zeigten, dass H. pylori upregulates CXCR4-Expression in Magenkrebs durch TNF-α.
Hintergrund
es gut, dass Helicobacter pylori (H. pylori) akzeptiert wird, ein starker Risikofaktor für die Entwicklung der verschiedenen Magenerkrankungen, nämlich chronische Gastritis, Magengeschwüren, Magen Malt Lymphom und Magenkrebs, und es wird bestätigt, dass die Wechselwirkung zwischen H. pylori und Epithelzellen zu dieser Entwicklung bei. Tatsächlich induziert die H. pylori-Infektion Entzündung in Mikroumgebung des Magens mit der Induktion von proinflammatorischen Cytokinen verbunden sind, wie Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α), Interleukin-1β (IL-1β) und IL-6 [1-3 ], die Magen-Krebsentstehung förderlich macht.
H. pylori-Infektion erhöht auch Tumor Invasivität und Metastasierung [4-6], obwohl der Mechanismus noch nicht gut verstanden. Der Prozess der Metastasierung von Krebs ist nicht zufällig, und verschiedene Krebsarten haben ihre bevorzugte Homing-Sites. Genau wie Leukozyten Handel, Migration von Tumorzellen wird kritisch von Chemokin /Chemokin-Rezeptor-System geregelt. Ein weiterer Schwerpunkt unserer Aufmerksamkeit wird Schuppen auf CXCR4, der häufigsten Chemokin-Rezeptor überexprimiert in einer Reihe von Krebserkrankungen (Magenkrebs enthalten) bei weitem [7, 8]. Studien haben gezeigt, CXCL12 /CXCR4-Achse wird bei Magenkrebs Metastasen beteiligt [9]. Deshalb weckt sie großes Interesse, eine Verbindung zwischen H.-pylori-Infektion und CXCR4-Überexpression bei Magenkrebs zu finden. Einer der wichtigsten chemischen Mediatoren der Entzündung-assoziierten Krebserkrankungen
TNF-α ist, und es gibt jetzt wesentliche Beweise in seiner Beteiligung in Promotion und Progression von experimenteller und Krebserkrankungen des Menschen [10, 11]. Getreu seinem Namen, hohe Dosen von regionalen TNF-α kann über eine selektive Zerstörung von Tumorblutgefäßen zu hämorrhagischen Nekrose führen. Es kann jedoch unerwartet als endogene Tumorpromotor wirken, wenn in der Tumor-Mikroumgebung erzeugt. Unser Interesse ist folglich auf seine Beteiligung an der Induktion von CXCR4-Expression durch H. pylori, ein potenter Induktor von TNF-α gezogen, die eine Reihe von Cytokinen hochzuregulieren bekannt ist, Chemokine, Adhäsionsmoleküle und Wachstumsfaktoren in Krebserkrankungen.
Methoden
Magenkrebszelllinien und Gewebeproben
der menschlichen Magenkrebszelle MKN45 und HGC27 von Keygen Biotech erhalten. Co. (Nanjing, China), und wurden in RPMI 1640 kultiviert, das mit 10% fötalem Rinderserum ergänzt war, bei 37 ° C in einem feuchten Inkubator mit 5% CO 2. 34 primären Magenkrebs Proben wurden von Patienten unter Betrieb mit all ihren informierte Einwilligung Shengjing Krankenhaus, Chinese Medical University, erworben und wurden in flüssigem Stickstoff unmittelbar nach der operativen Entfernung eingefroren. Haematoxylin- und Eosin-Anfärbung wurden die Schnitte für die Bewertung des prozentualen Anteils der Tumorzellen hergestellt und Proben nur mit > 70% Tumorzellen wurden für die Analyse ausgewählt. Diese Studie wurde mit Zustimmung des Ethikkommission der China Medical University durchgeführt. Alle Experimente wurden mindestens dreimal durchgeführt.
Makrophagen-Zellinie RAW264.7
Die Makrophagen-Zell RAW 264.7 von der American Type Culture Collection bereitgestellt wurde (Rockville, MD, USA), und wurde in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium gehalten, mit 10% fötalem Rinderserum, bei 37 ° C in einem feuchten Inkubator mit 5% CO 2.
H. pylori-Stämme
H. Stamm 26695 (ATCC 700.392, cag PAI pylori +) und Tx30a (ATCC 51932, cag PAI -) wurden von ATCC (Rockville, MD, USA) angeboten. Sie wurden bei 37 ° C auf Schafblut-Agarplatten unter mikroaerophilen Bedingungen. Die Bakterien wurden nach 48 h in Brucella-Brühe, enthaltend 5% fötales Rinderserum, für 24 h überführt. Eine Vielzahl der Infektion von 100 wurde in allen Studien verwendet.
Echtzeit-Reverse-Transkriptase-PCR
Gesamt-RNA aus Geweben und Zelllinien von Trizol (Takara, Dalian, China) gemäß dem Protokoll, das von der mitgelieferten isoliert Hersteller. cDNA wurde unter Verwendung von Takara RNA PCR 3.0 Kit (Takara, Dalian, China) in einem Gesamtvolumen von 10 ul synthetisiert, mit AMV-reverser Transkriptase, 0,5 &mgr; l; Zufalls 9 Primer, 0,5 ul; 25 mM MgCl 2, 2 &mgr; l; 10 × RT-Puffer, 1 &mgr; l; dNTP-Mischung (jeweils 10 mM), 1 &mgr; l; RNase Inhibitor, 0,25 &mgr; l; RNA 1 &mgr; l; dH 2 O, 3,75 ul. Bedingungen für die RT waren: 30 ° C für 10 Minuten, 42 ° C für 25 Minuten, 99 ° C für 5 Minuten und 5 ° C für 5 Minuten. Echtzeit-PCR wurde unter Verwendung des LightCycler-System zusammen mit dem LightCycler DNA Master SYBR Green I Kit (Roche Diagnostics) durchgeführt. Das Gesamtvolumen beträgt 20 &mgr; l, enthaltend 25 mM MgCl 2, 3 &mgr; l; 10 × Puffer, 5 ul; 10 &mgr; M vorwärts Primer, 1 &mgr; l; 10 &mgr; M Reverse-Primer, 1 &mgr; l; LightCycler DNA Master SYBR Green I, 2 &mgr; l; cDNA, 2 &mgr; l; dH 2 O, 6 ul. Bedingungen für die PCR waren: 50 ° C für 2 Minuten, 95 ° C für 10 Minuten und dann 40 Zyklen von 5 Sekunden bei 95 ° C und 20 Sekunden bei 60 ° C. Das Housekeeping-Gen Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH
) wurde als interne Kontrolle verwendet. Die Genexpression wurde durch die vergleichende CT-Verfahren quantifiziert, CT-Werte zu GAPDH
zu normalisieren und relativen Expressionswerte zu berechnen. Die Primersequenzen wurden von Takala (Dalian, China) zur Verfügung gestellt, wie folgt: CXCR4
vorwärts, 5'-GAGGAAATGGGCTCAGGG-3 ', Reverse, 5'-AGTCAGCAGGAGGGCAGGGA-3'; TNF-α
vorwärts, 5'-AGTGACAAGCCTGTAGCCC-3 ', Reverse, 5'-GCAATGATCCCAAAGTAGACC-3'; IL-1β
vorwärts, 5'-CCACCACTACAGCAAGGG-3 ', Reverse, 5'-GAACTGGGCAGACTCAAA-3'; IL-6
vorwärts, 5'-CCTTCGGTCCAGTTGCCTTCT-3 ', Reverse, 5'-GCATTTGTGGTTGGGTCA-3'; GAPDH
vorwärts, 5'-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3 ', Rückwärts, 5'-AAAGGTGGAGGAGTGGGT-3'.
Western-Blotting
Zelllysate wurden mit Probenpuffer hergestellt [50 mmol /L Tris-HCl (pH 6,8 ), 100 mmol /l DTT, 2% SDS, 0,1% Bromphenolblau und 10% Glycerin] und wurden auf einem 12% Natriumdodecylsulfat (SDS) /Acrylamid-Gel unterzogen. Die Proteine ​​auf Acrylamid-Gel wurden auf eine Nylonmembran übertragen, die über Nacht (4 ° C in PBS mit 0,1% Tween und 10% Milchpulver) blockiert. Polyklonale Antikörper für CXCR4 (Santa Cruz, CA, USA), und die entsprechenden Sekundärantikörper (Santa Cruz, CA, USA) wurden vor Immunoblotting angewandt. Das humane Gen β-Actin
(Santa Cruz, CA, USA) wurde als interne Kontrolle verwendet. Die Blots wurden mit FX Pro Plus-System (Bio-Rad) sichtbar gemacht und quantifiziert Scion Bild 4.03-Software.
RNA-Interferenz
TNF-a RNAi-Plasmid und nonsilencing Kontrolle RNAi-Plasmid von Takala (Dalian, China) erworben wurden. Zellen, die in einer 24-Well-Platte mit einer Dichte von 2 × 10 5 ausgesät. Am folgenden Tag wurden die Zellen, die mit TNF-a siRNA oder Kontroll-siRNA unter Verwendung von Lipofectamin 2000 (Invitrogen, Vereinigtes Königreich) gemäß den Anweisungen des Herstellers.
Elisa für Zytokine in Zellkulturüberstand
Konzentrationen von TNF-α, IL-1β und IL-6 in Zellkulturüberstände wurden gemessen, um den Quantikine Elisa-Kit (Boster, Wuhan, China) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die Sensitivität des Tests betrug 2 pg /ml für TNF-α, 4 pg /ml für IL-1β und 4 pg /ml für IL-6.
Migration Assays
Die Migration von kultivierten Zellen wurde Matrigel getestet unter Verwendung von Invasion Kammer (24-Well-Format, 8 um Poren; BD Pharmingen). Zellen (5 × 10 5) wurden in die obere Kammer und Medium mit CXCL12 (100 ng /ml, Sigma) wurde in die untere Kammer gegeben ergänzt zugegeben. Migrationsassays wurden bei 37 ° C für 18 Stunden inkubiert und 5% CO 2. mit 1% Toluidinblau nach der Fixierung mit 100% Methanol migrierten Zellen auf der unteren Fläche wurden gefärbt. Für jede Transwell, die Anzahl der migrierten Zellen in 10 mittleren Leistungsfeldern (× 20) gezählt.
Statistische Analyse
Mann-Whitney-U
-Test verwendet wurde mRNA-Expression zwischen H. pylori-positiven zu vergleichen und H. pylori-negativen Tumoren. Die Korrelation zwischen CXCR4-Expression und TNF-α-Expression in Magenkrebs Proben wurde unter Verwendung von Spearman-Rangkorrelationstest analysiert. Die Expression von mRNA in Magen-Zelllinien wurde im Vergleich mit Student t
-test oder Einweg-ANOVA. Die statistische Analyse wurde unter Verwendung von SPSS Version 11.0 (SPSS, Chicago, IL, USA). Unterschied wurde als signifikant angesehen, wenn P
-Wertes war < 0.05.
Ergebnisse

• Interleukin-23A mit Tumorwachstum bei Helicobacter-pylori-related menschlichen Magen cancer
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