Participación de factor de necrosis tumoral-α en la regulación al alza de la expresión de CXCR4 en el cáncer gástrico inducida por Helicobacter Participación pylori

de factor de necrosis tumoral-α en la regulación al alza de la expresión de CXCR4 en el cáncer gástrico inducida por Helicobacter pylori
Abstract
Antecedentes
H. pylori, cuya infección aumenta la invasividad tumoral y la metástasis, generalmente se etiqueta como el factor de riesgo más importante para el desarrollo de cáncer gástrico. Parece no ser una coincidencia que también existe una sobreexpresión de CXCR4 y una implicación evidente en la metástasis del cáncer gástrico. El objetivo de este estudio trata de investigar y además establecer un vínculo entre ellos. Con H. pylori es un potente inductor de TNF-α, TNF-α sea, un promotor tumoral, está implicada en la inducción de la expresión de CXCR4 por H. pylori también estaba bajo investigación en este estudio.
Métodos
Expresión de CXCR4, TNF-α, IL-6 y IL-1β ARNm se determinó por PCR en tiempo real. expresión de la proteína CXCR4 no se detectó mediante transferencia Western. Las concentraciones de TNF-α, IL-6 y IL-1β en sobrenadantes de cultivo celular se midieron usando el kit Quantikine Elisa. Para anular la expresión de TNF-α en HGC27 células, se usó TNF-a plásmido RNAi para transfectar ellos.
Resultados
Los niveles de CXCR4 y TNF-α mRNA fueron significativamente mayores en los cánceres gástricos H. pylori-positivos (n = 19) en comparación con H. pylori los negativos (n = 15). Una prueba de correlación de rangos de Spearman mostró posteriormente hubo una correlación positiva entre el nivel de CXCR4 ARNm y que el TNF-α de 34 en los cánceres gástricos primarios. Otros resultados siguieron: La expresión de CXCR4 y TNF-α se reguló en el celular de cáncer gástrico MKN45 y HGC27 después de la infección con H. pylori 26695 (cagPAI +) o Tx30a (cagPAI -); La inducción de la expresión de CXCR4 por H. pylori fue significativamente inhibida por un anticuerpo neutralizante de TNF-α, infliximab; CXCR4 expresión se reguló en MKN45 células después del tratamiento con exógenos TNF-α o co-cultivo con macrófagos, y se downregulated en HGC27 células después de la transfección con el plásmido RNAi TNF-a. Hubo un aumento significativo en la migración de células MKN45 tratados con H. pylori 26695, y una inhibición fuerte cuando, se añadieron AMD 3100, un antagonista de CXCR4, o infliximab.
Conclusiones
Nuestros resultados demostraron que H. pylori upregulates expresión CXCR4 en el cáncer gástrico a través de TNF-α.
Antecedentes
es bien aceptado que la Helicobacter pylori (H. pylori) es un fuerte factor de riesgo para el desarrollo de diversas enfermedades gástricas, a saber, la gastritis crónica, úlceras pépticas, linfoma gástrico asociado a la mucosa de tejido linfoide y cáncer gástrico, y se reconoce que la interacción entre H. pylori y las células epiteliales contribuye a tal desarrollo. De hecho, la infección por H. pylori induce la inflamación en microambiente del estómago asociada a la inducción de citoquinas proinflamatorias, tales como factor de necrosis tumoral-α (TNF-α), la interleucina-1β (IL-1β) y IL-6 [1-3 ], lo que hace que la carcinogénesis gástrica propicio.
H. infección pylori también aumenta la invasividad tumoral y la metástasis [4-6], aunque el mecanismo todavía no se entiende bien. El proceso de la metástasis del cáncer no es aleatoria, y diferentes tipos de cáncer tienen sus sitios homing preferidas. Al igual que el tráfico de leucocitos, la migración de las células tumorales está regulado por la crítica por el sistema receptor de quimioquinas /quimioquinas. Otro foco de nuestra atención se derramó en CXCR4, el receptor de quimioquinas más común sobreexpresa en una serie de tipos de cáncer (cáncer gástrico incluido), de lejos, [7, 8]. Los estudios han indicado eje CXCL12 /CXCR4 está implicado en la metástasis del cáncer gástrico [9]. Por lo tanto, despierta gran interés para encontrar un vínculo entre la infección por H. pylori y la sobreexpresión de CXCR4 en el cáncer gástrico.
Uno de los principales mediadores químicos implicados en los cánceres asociados con la inflamación es TNF-α, y hay pruebas de que tiene ya una su participación en la promoción y progresión de los cánceres experimentales y humanos [10, 11]. Fiel a su nombre, dosis elevadas de TNF-α regional pueden conducir a la necrosis hemorrágica mediante la destrucción selectiva de los vasos sanguíneos del tumor. Sin embargo, puede inesperadamente actuar como un promotor de tumores endógena cuando se produce en el microambiente tumoral. Nuestro interés está en consecuencia atraído por su implicación en la inducción de la expresión de CXCR4 por H. pylori, un potente inductor de TNF-α, que es conocido por regular positivamente una serie de citocinas, quimiocinas, moléculas de adhesión y factores de crecimiento en cánceres.
métodos
líneas celulares de cáncer gástrico y muestras de tejido comentario El celular de cáncer gástrico humano MKN45 y HGC27 se obtuvieron de Keygen Biotech. Co. (Nanjing, China), y se cultivaron en RPMI 1640 suplementado con suero bovino fetal al 10%, a 37 ° C en un incubador húmedo con 5% de CO 2. 34 especímenes de cáncer gástrico primarias fueron compradas a los pacientes en funcionamiento con toda su consentimiento informado en el hospital Shengjing, Universidad Médica de China, y se congelaron en nitrógeno líquido inmediatamente después de la extirpación quirúrgica. secciones Haematoxylin- y eosina-tinción se prepararon para la evaluación del porcentaje de células tumorales, y sólo las muestras con > Se seleccionaron 70 células tumorales% para su análisis. Este estudio se llevó a cabo con la aprobación del comité de ética de la Universidad de Medicina China. Todos los experimentos se realizaron al menos tres veces.
Línea celular de macrófagos RAW264.7 comentario El celular de macrófagos RAW 264.7 fue proporcionado por la American Type Culture Collection (Rockville, MD, EE.UU.), y se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco , suplementado con suero bovino fetal al 10%, a 37 ° C en una incubadora con humedad y 5% de CO 2.
cepas de H. pylori
H. pylori cepa 26695 (ATCC 700392, cag PAI +) y Tx30a (ATCC 51932, cag PAI -) fueron ofrecidos por la ATCC (Rockville, MD, EE.UU.). Ellos se cultivaron en placas de agar sangre de oveja a 37 ° C bajo condiciones microaerophilic. Las bacterias se transfirieron después de 48 h en caldo Brucella que contenía suero bovino fetal al 5% durante 24 h. Una multiplicidad de infección de 100 se utilizó en todos los estudios.
En tiempo real de transcripción inversa-PCR
ARN total fue aislado de los tejidos y líneas celulares de Trizol (Takara, Dalian, China) de acuerdo con el protocolo suministrado por el fabricantes. cDNA se sintetizó usando Takara RNA PCR Kit 3.0 (Takara, Dalian, China) en un volumen total de 10 l, que contiene la transcriptasa inversa AMV, 0,5 l; azar 9 cebador, 0,5 l; MgCl 25 mM 2, 2 l; 10 × RT Buffer, 1 l; mezcla de dNTP (cada uno 10 mM), 1 l; inhibidor de RNasa, 0,25 l; RNA 1 l; dH 2O, 3,75 l. Condiciones para la RT fueron: 30 ° C durante 10 minutos, 42 ° C durante 25 minutos, 99 ° C durante 5 minutos, y 5 ° C durante 5 minutos. PCR en tiempo real se realizó utilizando el sistema LightCycler junto con el LightCycler DNA Maestro SYBR Green I Kit (Roche Diagnostics). El volumen total es de 20 l, que contiene 25 mM de MgCl 2, 3 l; 10 × Buffer, 5 l; 10 M de cebador directo, 1 l; 10 M cebador inverso, 1 l; LightCycler principal DNA SYBR Green I, 2 l; cDNA, 2 l; dH 2O, 6 l. Las condiciones para la PCR fueron: 50 ° C durante 2 minutos, 95 ° C durante 10 minutos, y luego 40 ciclos de 5 segundos a 95 ° C y 20 segundos a 60 ° C. La deshidrogenasa de gliceraldehído-3-fosfato limpieza de genes (GAPDH
) se utilizó como control interno. La expresión génica se cuantificó por el método comparativo CT, la normalización de los valores de CT a GAPDH
y el cálculo de los valores relativos de expresión. Primer secuencias fueron proporcionados por Takala (Dalian, China) de la siguiente manera: CXCR4
adelante, 5'-GAGGAAATGGGCTCAGGG-3 ', inversa, 5'-AGTCAGCAGGAGGGCAGGGA-3'; TNF-α
adelante, 5'-AGTGACAAGCCTGTAGCCC-3 ', inversa, 5'-GCAATGATCCCAAAGTAGACC-3'; IL-1β
adelante, 5'-CCACCACTACAGCAAGGG-3 ', inversa, 5'-GAACTGGGCAGACTCAAA-3'; IL-6
adelante, 5'-CCTTCGGTCCAGTTGCCTTCT-3 ', inversa, 5'-GCATTTGTGGTTGGGTCA-3'; GAPDH
adelante, 5'-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3 ', inversa, 5'-AAAGGTGGAGGAGTGGGT-3'.
Western blotting
lisados ​​celulares se prepararon con tampón de muestra [/L Tris-HCl 50 mmol (pH 6,8 ), 100 mmol /L de DTT, 2% SDS, 0,1% de azul de bromofenol, y 10% de glicerol], y se sometieron a un sulfato de 12% de dodecil de sodio (SDS) /gel de acrilamida. Las proteínas en gel de acrilamida se transfirieron a una membrana de nylon, que fue bloqueada durante la noche (4 ° C en PBS con 0,1% de Tween 10 y% de leche en polvo). Los anticuerpos policlonales para CXCR4 (Santa Cruz, CA, Estados Unidos), y los correspondientes anticuerpos secundarios (Santa Cruz, CA, Estados Unidos) se aplicaron antes de inmunotransferencia. El gen humano β-actina de
(Santa Cruz, CA, Estados Unidos) se utilizó como control interno. Las transferencias se visualizaron con sistema de FX Pro Plus (Bio-Rad) y se cuantificaron utilizando el software Scion Image 4,03.
Interferencia de ARN
control de RNAi plásmido TNF-a RNAi plásmido y nonsilencing se adquirieron de Takala (Dalian, China). Las células se sembraron en una placa de 24 pocillos a una densidad de 2 × 10 5. En el día siguiente, las células fueron transfectadas con TNF-a siRNA o Control siRNA usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Reino Unido) según las instrucciones del fabricante.
Elisa para citoquinas en sobrenadantes de cultivo de células
Las concentraciones de TNF-α, IL-1β y IL-6 en los sobrenadantes de cultivo celular se midieron usando el kit Quantikine Elisa (Boster, Wuhan, china) según las instrucciones del fabricante. La sensibilidad del ensayo fue de 2 pg /ml para el TNF-α, 4 pg /ml para IL-1β y 4 pg /ml de IL-6. Ensayos de migración
La migración de las células cultivadas fue ensayada mediante Matrigel invasión de cámara (formato de 24 pocillos, 8 micras de poro; BD Pharmingen). Las células (5 × 10 5) se añadieron a la cámara superior y el medio suplementado con CXCL12 se añadió (100 ng /ml, Sigma) a la cámara inferior. Migración ensayos se incubaron durante 18 horas a 37 ° C y 5% de CO 2. Las células migradas en la superficie inferior se tiñeron utilizando 1% de azul después de la fijación con metanol al 100% de toluidina. Para cada transwell, el número de células que migraron en 10 campos de potencia media (× 20) se contó. El análisis estadístico
de Mann-Whitney U-test
se utilizó para comparar la expresión de ARNm entre H. pylori positivo y tumores H. pylori-negativos. Correlación entre la expresión de CXCR4 y la expresión de TNF-α en las muestras de cáncer gástrico se analizó mediante la prueba de correlación de Spearman. La expresión de ARNm en las líneas celulares gástricas se comparó el uso de la t de Student
-test o ANOVA de una vía. El análisis estadístico se realizó con el programa SPSS versión 11.0 (SPSS, Chicago, IL, EE.UU.). Diferencia se consideró significativa cuando p-valor
fue < 0.05.
Resultados
expresión de CXCR4 y TNF-α mRNA en los cánceres gástricos primarios
CXCR4 ARNm se determinó por el tiempo real de transcripción inversa-PCR en 34 cánceres gástricos, y su expresión en cada muestra se normalizó a GAPDH
expresión. Los resultados revelaron su nivel significativamente mayor en los cánceres gástricos H. pylori-positivos (n = 19) en comparación con H. pylori los negativos (n = 15) (7,2 veces, p
< 0,01, Figura 1 A). En la misma cohorte de tumores, la expresión de ARNm de TNF-α se detectó también por el tiempo real de transcripción inversa-PCR, y se encontró más fuerte en los cánceres gástricos H. pylori-positivos en comparación con H. pylori los negativos (4,3 veces, P
< 0,01, Figura 1B). prueba de correlación de Spearman se verifica, además, una correlación positiva de la expresión de CXCR4 con TNF-α en estos 34 cánceres gástricos (P Hotel < 0,01, Figura 1C). Figura 1 La expresión de CXCR4 y TNF-α mRNA en los cánceres gástricos primarios, por PCR en tiempo real. (A) y (B) cánceres gástricos H. pylori positivo (columnas grises, n = 19) expresadas mayor nivel de CXCR4 (A) y TNF-α mRNA (B) en comparación con H. pylori cánceres gástricos-negativos (columnas negras , n = 15), * P
< 0.01. Las líneas horizontales: medios de ARNm. (C) Nivel de CXCR4 mRNA se correlacionó positivamente con la de TNF-α mRNA en 34 cánceres gástricos, P
y lt; 0.01. rombo negro: los cánceres gástricos H. pylori-negativos; rombo gris:. cánceres gástricos H. pylori-positivos
Inducción de CXCR4 y la expresión de TNF-α por H. pylori en células de cáncer gástrico
Real-Time PCR y Western Blot se utilizaron para detectar la expresión de CXCR4 en MKN45 y HGC27 células (Figura 2A, B); y revelan que upregulated significativamente en ellos después de la infección con H. pylori 26695 durante 24 horas (P
< 0,01, respectivamente, la Figura 2A, B). Posteriormente fueron tratadas con una cag PAI-negativo H. pylori, Tx30a para determinar su implicación en la regulación al alza, y también se encontraron para inducir la expresión de CXCR4 en las células MKN45 y HGC27 (P
< 0,01, respectivamente, la Figura 2A , B). Figura 2 Expresión de CXCR4 y TNF-α en células MKN45 y HGC27 después de la infección con H. pylori. (A) y la expresión de CXCR4 (B) se upregulated en MKN45 y HGC27 células después de la infección con H. pylori 26695 (* P
< 0,01, respectivamente, vs
pylori H.) o Tx30a (* P
< 0,01, respectivamente, frente a H. pylori
). (C) y (D) la expresión de TNF-α se incrementó en MKN45 y HGC27 células después de la infección con H. pylori 26695 (* P
< 0,01, respectivamente, vs
pylori H.) o Tx30a (* P
< 0,01, respectivamente, vs
H. pylori). Los datos se expresan como media ± SD, n = 3. Francia El efecto de la infección por H. pylori en la expresión de TNF-α se investigó adicionalmente usando PCR en tiempo real y Elisa, y la detección revelaron que la infección con 26695 o Tx30a de 12 hora pueden haber conducido a la vez más la expresión de TNF-α mRNA (P
< 0,01, respectivamente) y más secreción de la proteína TNF-α en el sobrenadante de cultivo (P
< 0,01, respectivamente) en MKN45 y HGC27 células (Figura 2 C, D).
efecto del infliximab, un anticuerpo neutralizante de TNF-α, en la inducción de la expresión de CXCR4 por H. Pylori comentario el hallazgo de la regulación positiva de la expresión de TNF-α en este caso presentado nosotros para más investigaciones sobre su implicación en la inducción de la expresión de CXCR4 por H. pylori. Un anticuerpo neutralizante de TNF-α, infliximab (4 g /ml, Sigma), se utilizaron a continuación para tratar las células MKN45 y HGC27 después de una infección por 26.695, y la inducción de CXCR4 se inhibió significativamente (P
< 0,01, respectivamente , la Figura 3A, B). Se observaron resultados similares cuando estas células se trataron con infliximab después de una infección por Tx30a (P
< 0,01, respectivamente, Figure3C, D). Figura 3 Efecto de infliximab en la inducción de la expresión de CXCR4 por H. Pylori. (A) y la regulación al alza (B) CXCR4 inducida por H. pylori 26695 se inhibió en las células MKN45 y HGC27 después del tratamiento con infliximab, * P
< 0,01, respectivamente, frente a
26695 + inf. (C) y la regulación al alza (D) CXCR4 inducida por H. pylori Tx30a también se inhibió en las células MKN45 y HGC27 después del tratamiento con infliximab, * P
< 0,01, respectivamente, frente a
Tx30a + inf. Los datos se expresan como media ± SD, n = 3. inf:. Infliximab
La regulación positiva de la expresión de CXCR4 en células de cáncer gástrico por el TNF-α
células MKN45, que secreta un menor nivel de proteína TNF-α, fueron tratados con 1, 10, o 50 ng /ml de TNF-α (Sigma) durante 6 horas en intento de explorar aún más el papel del TNF-α en la regulación positiva de la expresión de CXCR4, y el tiempo real-PCR y detección de Western blot reveló que se reguló de manera significativa de una manera dependiente de la dosis (P
< 0,01, Figura 4A, B), e incluso por 15,8 pliegues con 50 ng /tratamiento con TNF-α ml. Figura 4 upregulation expresión de CXCR4 en células de cáncer gástrico por TNF-α. (A) y la expresión de CXCR4 (B) se upregulated en células MKN45 por exógenos TNF-α en una forma dependiente de la dosis, * P
< 0.01. (C) y (D) El sistema de cocultivo de MKN45 y las células RAW264.7 expresaron más CXCR4, * P
< 0,001, frente a
M; ** P Hotel < 0,001, frente a
R. La regulación positiva de la expresión de CXCR4 se inhibió después del tratamiento con infliximab, P *** Hotel < 0,001, frente a
M + R + inf. M: MKN45; R: RAW264.7; inf: infliximab. (E) Expresión de TNF-α estaba ausente en HGC27 células después de la transfección con el plásmido RNAi TNF-a. expresión (F) CXCR4 ARNm se downregulated en HGC27 células después de transfección con TNF-a plamid ARNi, P * Hotel < 0,001, frente a
Sin RNAi; ** P Hotel < 0,001, frente a
control ARNi. Los datos se expresan como media ± SD, n = 3.
A continuación, la expresión de CXCR4 en un sistema de co-cultivo se examinó, ya que los macrófagos asociados a tumores también sirven como una fuente de TNF-α en el microambiente del cáncer gástrico. Un co-cultivo de células MKN45 con células RAW264.7 durante 24 horas indicó que expresó significativamente más CXCR4 ARNm y proteínas (P Hotel < 0,001, Figura 4C, D); Este aumento, sin embargo, se inhibió significativamente por infliximab (P Hotel < 0,001, Figura 4C, D): perfil Por último, endógena de TNF-α fue dirigido para evaluar su regulación en la expresión de CXCR4 en células, que HGC27 secretos más altos. nivel de proteína TNF-α. Se utilizó TNF-a RNAi plásmido para transfectar células HGC27, y fue empleado correspondientemente nonsilencing plásmido RNAi en la contraparte como control. Se observó que la expresión de TNF-α estaba ausente en HGC27 células después de la transfección con TNF-a RNAi plásmido (Figura 4E). A continuación, la expresión de CXCR4 fue detectado por PCR en tiempo real, y se observó en la detección de que, después de la transfección con el plásmido RNAi TNF-a, la expresión de CXCR4 ARNm se downregulated significativamente en células HGC27, en comparación con las células con el control de RNAi o células sin RNAi (P
< 0,001, respectivamente, la Figura 4F).
inducción de citoquinas en los macrófagos por H. Pylori
PCR en tiempo real y de ELISA se emplea para evaluar el efecto de H. pylori 26695 en la expresión de citoquinas en las células RAW264.7, ya que en general se reconoce que las citoquinas están implicadas en los procesos inflamatorios crónicos causados ​​por H. Pylori. La detección en tiempo real PCR mostró expresión de TNF-α, IL-1β y IL-6 mRNA se upregulated en 26695 células tratadas en comparación con las células no tratadas (26695-TNF-a, P
y lt; 0,001; IL-1β , P
< 0,001 y IL-6, P
< 0,001, Figura 5A). Y resultados de ELISA indicaron más proteínas de TNF-α, IL-1β y la IL-6 fueron secretada en el sobrenadante del cultivo en 26695 tratados con células en comparación con 26695-sin tratar células (TNF-a, P
< 0,001; IL-1β , P
< 0,001 y IL-6, P
< 0,001, Figura 5B). Figura 5 Inducción de citoquinas en los macrófagos por H. Pylori. (A) y (B) Expresión de TNF-α, IL-1β y IL-6 se upregulated en 26695 tratados con células RAW264.7, * P
< 0.001, frente a
células no tratadas. (C) y (D) Ni IL-1β ni IL-6 pueden regular al alza la expresión de CXCR4 en células MKN45. Los datos se expresan como media ± SD, n = 3. Por último
MKN45 células fueron tratadas con IL-1β exógena (50 ng /ml) e IL-6 (50 ng /ml), respectivamente, para descartar la posibilidad de que la IL -1β e IL-6 puede regular al alza la expresión de CXCR4 como el TNF-α. Ni IL-1β ni IL-6 fue encontrado para regular positivamente la expresión de CXCR4 significativamente (Figura 5 C, D). El análisis
Migración Migración
análisis se realizó a través de la cámara de invasión de Matrigel en un intento de investigar si el CXCR4 upregulated era funcional . En la fase inicial del experimento con 100 ng /ml de CXCL12 en la cámara inferior, hubo un aumento significativo (de hasta 4,5 pliegues) en la migración de células MKN45 con 26.695 tratamiento en la cámara superior, en comparación con las células de control sin 26695 tratamiento (P
< 0,001, Figura 6A). Más tarde, sin embargo, el aumento fue inhibido notablemente cuando AMD 3100 (1 mg /ml, Sigma), un antagonista de CXCR4, o infliximab, se añadió (P
< 0,01, respectivamente, la Figura 6A). Figura 6 estudio de migración. (A) células MKN45 mostraron un aumento significativo en su migración después del tratamiento con 26.695, * P
< 0,001, frente a
control. El aumento de la migración de las células MKN45 inducidos por 26695 fue inhibido cuando AMD 3100 (** P
< 0,01, vs
26695 + AMD), o infliximab (*** P
< 0,01, vs se añadió
26695 + inf). AMD: AMD3100; inf: infliximab. (B) TNF-α aumento de la migración de células MKN45, P * Hotel < 0,001, frente a
control. Ni IL-1β ni IL-6 pueden aumentar la migración de células MKN45 de manera significativa. Los datos se expresan como media ± SD, n = 3.
Además, el efecto de las citoquinas en la migración de células MKN45 también se examinó y se encontró (50 ng /ml) TNF-α para aumentar la migración de células MKN45 significativamente (P Hotel < 0,001, Figura 6B). Sin embargo, ni IL-1β (50 ng /ml), ni la IL-6 (50 ng /ml) fue
demostró para promover la migración de células MKN45 considerablemente (Figura 6B). Discusión
H. pylori se culpa de infectar a alrededor del 50% de la población del mundo como un carcinógeno gástrica definitiva para los seres humanos [12]. Patogénesis de la infección a menudo incluye la inflamación, daño de la mucosa, o atrofia gástrica, y requiere una estrecha interacción entre las bacterias y las células epiteliales gástricas, la activación de vías de señalización, modificar las funciones celulares del huésped, y que conduce a respuestas epiteliales crónicas [13,14]. En la actualidad hay evidencias que relacionan la inflamación crónica de los cánceres humanos [15-17], y específicamente la inflamación crónica, inducida por H. pylori y citoquinas en el estómago microambiente local de servir como los contribuyentes más comunes [18-20]. Este estudio destaca el resultado de que el nivel de la mucosa de TNF-α mRNA fue significativamente mayor en los pacientes H. pylori positivos que en los pacientes negativos utilizando cuantitativa en tiempo real PCR, y dos células de cáncer gástrico también secreta la proteína TNF-α in vitro. Es más puntos a la suposición de que el TNF-α puede estar implicado en H. pylori carcinogénesis gástrica positivo como un enlazador indispensable y fuerte entre la inflamación y el cáncer [21].
Aunque el mecanismo de inducción de TNF-α por H. pylori sigue siendo relativamente poco clara, una familia de proteínas se ha descrito en la última década, incluyendo Helicobacter pylori-membrana de proteína-1 (HP-MP1) y TNF-α inducción de proteína (Tipα) [22-24]. Tipα gen, identificado a partir de H. pylori cepa 26695, es homólogo al gen HP-MP1 con el 94,3% de homología, y ambos muestran una fuerte capacidad de inducir la expresión del gen TNF-α. En el estudio, H. pylori 26695 se encontró que era regular al alza la expresión de TNF-α significativamente en células MKN45 y HGC27, y cag PAI cepa negativa a Tx30a también se vio para inducir obviamente, que puede ser en parte debido al hecho de que HP-MP1 /Tipα familia no está en cag PAI región. Sin embargo, también se observó que el efecto de Tx30a en la inducción de TNF-α fue más débil que el de 26695 (2.3 pliegues vs
3.1 pliegues en las células MKN45), lo que sugiere productos de H. pylori en cag PAI puede ser también implicado en la inducción. De hecho, se ha informado de que cagA de H. pylori podría inducir TNF-α en las muestras de biopsia de cáncer gástrico [25]. Además, H. pylori purificado también se encontró ureasa para inducir células MKN45 de expresar TNF-α [26].
TNF-α, una citoquina clave en muchas enfermedades inflamatorias crónicas, se marcó originalmente como un factor de suero para la inducción de necrosis hemorrágica de tumores sólidos trasplantados en ratones. Sin embargo, actualmente se identifica comúnmente como un promotor de tumores en microambiente local del tumor, y por lo tanto la eliminación o inhibición de la que se supone que es reducir la incidencia de los cánceres experimentales. /TNF-R1 tumbar ratones TNF-a son resistentes a la carcinogénesis inducida químicamente [27, 28]. Se detecta con frecuencia en biopsias de una variedad de cánceres humanos, ya sea producida por las células tumorales epiteliales o células del estroma. Además, también se encuentra, aunque en baja cantidad, en la secreción de muchas líneas de cáncer in vitro sin estímulos inflamatorios, aunque el mecanismo todavía no está completamente claro. Se encontró
TNF-α no sólo participan en la transformación y proliferación celular , pero también en la metástasis tumoral. Tal conclusión se basó inicialmente en un modelo animal de cáncer de colon, en el que la inyección de LPS mejora el desarrollo de metástasis de pulmón dependiente de la producción de TNF-α por células huésped [29]. Los resultados posteriores mostraron que el aumento de la metástasis tumoral inhibida por anticuerpos neutralizantes de TNF-α [30]. Estos llevaron a nuestra especulación de que uno de los mecanismos subyacentes de TNF-α en la metástasis tumoral puede estar relacionada con la regulación positiva de los receptores de quimiocinas /quimioquinas. En primer lugar, hubo una regulación positiva significativa de CXCR4 en células de cáncer gástrico después de que fueron tratados con exógenos TNF-α. Había otro upregulation obvio de la expresión de CXCR4 en células de cáncer después de que se co-cultivaron con macrófagos, una fuente alternativa de TNF-α en microambiente del cáncer gástrico. Como era de esperar, esta regulación por incremento puede ser inhibida por TNF-α infliximab anticuerpo neutralizante. Hubo en consecuencia una notable reducción de la expresión de CXCR4 en células HGC27 después de RNAi se empleó para abrogar la expresión de TNF-α en estas células, lo que indica endógeno TNF-α también puede regular al alza la expresión de CXCR4. Los resultados generales llevaron a nuestra conclusión de que el TNF-α, con ella misma implicados en la metástasis de cáncer gástrico, regula al alza la expresión de CXCR4.
Sobreexpresión de CXCR4, cuya participación en diversos tumores humanos es bien conocido, se observa con frecuencia en tejidos de cáncer gástrico para aumentar la metástasis del cáncer gástrico. Algunas células de carcinoma gástrico humano también expresan CXCR4 ARNm y proteínas en niveles altos [7, 8]. Nuestro estudio demostró infección por H. pylori aumentó la migración de células MKN45 a través de la regulación positiva de la expresión de CXCR4. El tratamiento con un antagonista de CXCR4 AMD3100 dio lugar a una supresión significativa de la migración de células MKN45 in vitro. Otro estudio mostró AMD3100 suprimió significativamente el desarrollo de la carcinomatosis peritoneal en un modelo de ratón de cáncer gástrico, que se evidencia por la reducción del crecimiento del tumor y la formación de líquido ascítico [9]. Las investigaciones anteriores llevaron a nuestra conclusión de que la sobreexpresión de CXCR4 en la muestra de biopsia de cáncer gástrico primario puede servir como una evaluación preoperatoria de los riesgos para la ocurrencia de la carcinomatosis peritoneal.
Participación macrófagos 'en la carcinogénesis del tumor y la invasión y metástasis [31, 32 ] generalmente se culpa para motivar TAM (tumor macrófagos asociada), una fuente importante de TNF-α en microambiente tumoral, para liberar una variedad de factores de crecimiento, citoquinas y mediadores inflamatorios. El estudio reveló que había una expresión significativa de TNF-α inducida por H. pylori, y al mismo tiempo la regulación positiva de IL-1 beta y IL-6 en las células RAW264.7, Sin embargo, esta última variación no logró inducir la expresión de CXCR4 en las células MKN45.
los estudios han atribuido en última instancia, la activación anormal de NF-kB en las células cancerosas a la secreción excesiva de TNF-α, cuyo papel en la regulación positiva CXCR4 se asume posteriormente que estar relacionado con las vías mediadas por NF-kB. Otros resultados han puesto de manifiesto los antagonistas de TNF-α puede inhibir la regulación al alza de la expresión de CXCR4 por H. pylori, y tanto ella como antagonistas de CXCR4 pueden suprimir el aumento de la migración de células de cáncer gástrico in vitro. Estos resultados sugieren que estos antagonistas solos o en combinación con otras terapias, pueden servir como terapias eficaces para los pacientes con cáncer gástrico.
Conclusiones
TNF-α está implicada en la regulación positiva de la expresión de CXCR4 en el cáncer gástrico inducida por H. pylori.
Declaraciones
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por una beca de la División de Educación, provincia de Liaoning, china (2009A751). archivos originales presentados
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