Il coinvolgimento del fattore di necrosi tumorale-α nel upregulation di espressione CXCR4 nel carcinoma gastrico indotto da Helicobacter pylori

coinvolgimento di fattore di necrosi tumorale-α nel upregulation di espressione CXCR4 nel carcinoma gastrico indotto da Helicobacter pylori
Abstract
sfondo
H. pylori, il cui contagio aumenta invasività tumorale e metastasi, è generalmente etichettato come il forte fattore di rischio per lo sviluppo del cancro gastrico. Sembra di non essere una coincidenza che ci sia anche una sovraespressione di CXCR4 e un coinvolgimento evidente nella metastasi del cancro gastrico. Lo scopo di questo studio tenta di indagare e promuovere per stabilire un collegamento tra di loro. Da H. pylori essere un potente induttore del TNF-α, se TNF-α, un promotore del tumore, è coinvolto nella induzione di espressione CXCR4 da H. pylori è stato anche in fase di ricerca in questo studio.
Metodi
Expression di CXCR4, TNF-α, IL-6 e IL-1β mRNA è stata determinata mediante PCR in tempo reale. espressione della proteina CXCR4 è stato rilevato mediante Western blotting. Le concentrazioni di TNF-α, IL-6 e IL-1β in surnatanti di colture cellulari sono stati misurati utilizzando il kit Quantikine Elisa. Di abrogare l'espressione del TNF-α in HGC27 cellule, TNF-alfa RNAi plasmide è stato utilizzato per transfect loro.
Risultati
livelli di CXCR4 e TNF-α mRNA erano significativamente più alti nei tumori gastrici H. pylori-positivi (n = 19) rispetto a quelli H. pylori-negativi (n = 15). test di correlazione rango A seguito di Spearman ha mostrato che vi era una correlazione positiva tra il livello di mRNA CXCR4 e che di TNF-α in 34 tumori gastrici primari. Altri risultati seguirono: espressione di CXCR4 e TNF-α è stato upregulated in cellule del cancro gastrico MKN45 e HGC27 dopo l'infezione da H. pylori 26695 (cag PAI +) o Tx30a (cag PAI -); L'induzione di CXCR4 espressione da H. pylori è stata inibita significativamente da un neutralizzante TNF-α anticorpi, infliximab; espressione CXCR4 è upregulated in MKN45 cellule dopo trattamento con esogeno TNF-α o co-coltura con macrofagi, ed è stato downregulated in HGC27 cellule dopo trasfezione con TNF-alfa RNAi plasmide. C'è stato un aumento significativo della migrazione delle cellule MKN45 trattate con H. pylori 26695, e una forte inibizione quando AMD 3100, un antagonista CXCR4, o infliximab, è stato aggiunto.
Conclusioni
I nostri risultati hanno dimostrato che H. pylori upregulates espressione CXCR4 nel carcinoma gastrico attraverso il TNF-α.
Sfondo
E 'ben noto che Helicobacter pylori (H. pylori) è un forte fattore di rischio per lo sviluppo di varie malattie gastriche, vale a dire gastrite cronica, ulcere peptiche, gastrica linfoma associato alla mucosa del tessuto linfatico e cancro gastrico, ed è riconosciuto che l'interazione tra H. pylori e cellule epiteliali contribuisce a tale sviluppo. Infatti, H. pylori induce infiammazione nel microambiente dello stomaco associata con l'induzione di citochine proinfiammatorie, come il tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleuchina-1β (IL-1β) e IL-6 [1-3 ], il che rende la carcinogenesi gastrica favorevole.
H. pylori aumenta anche l'invasività del tumore e metastasi [4-6], anche se il meccanismo non è ancora ben compreso. Il processo di metastasi del cancro non è casuale, e diversi tipi di cancro hanno i loro siti preferiti di homing. Proprio come il traffico dei leucociti, la migrazione delle cellule tumorali è criticamente regolata dal sistema recettore per chemochine /chemochine. Un altro centro della nostra attenzione è sparso sulla CXCR4, il recettore delle chemochine più comune sovraespresso in una serie di tumori (cancro gastrico inclusa) di gran lunga [7, 8]. dell'asse CXCL12 /CXCR4 Gli studi hanno indicato è coinvolto nella metastasi del cancro gastrico [9]. Pertanto, suscita grande interesse a trovare un legame tra l'infezione da H. pylori e CXCR4 sovraespressione di cancro gastrico.
Uno dei mediatori chimici chiave implicati nei tumori associati all'infiammazione è TNF-α, e ci sono prove ormai sostanziale il suo coinvolgimento nella promozione e nella progressione dei tumori sperimentali e umani [10, 11]. Fedele al suo nome, alte dosi di TNF-α regionale può portare a necrosi emorragica tramite distruzione selettiva dei vasi sanguigni tumorali. Tuttavia, può inaspettatamente agire come un promotore tumorale endogena quando prodotta nel microambiente tumorale. Il nostro interesse è di conseguenza richiama il suo coinvolgimento nella induzione di espressione CXCR4 da H. pylori, un potente induttore del TNF-α, che è noto per upregulate una serie di citochine, chemochine, molecole di adesione e fattori di crescita nei tumori.
metodi
linee cellulari di cancro gastrico e campioni di tessuto
La cellula cancro gastrico umano MKN45 e HGC27 sono stati ottenuti da Keygen Biotech. Co. (Nanjing, Cina), e sono state coltivate in RPMI 1640 supplementato con 10% di siero bovino fetale, a 37 ° C in un incubatore umido con 5% di CO 2. 34 principali campioni di cancro gastrico sono stati acquisiti da pazienti in collaborazione con tutto il loro consenso informato a Shengjing ospedale, cinese Medical University, e sono stati congelati in azoto liquido immediatamente dopo la rimozione chirurgica. Haematoxylin- eosina-colorazione sezioni sono stati preparati per la valutazione della percentuale di cellule tumorali, e campioni solo con il > 70 cellule tumorali% sono stati selezionati per l'analisi. Questo studio è stato condotto con l'approvazione del comitato etico della China Medical University. Tutti gli esperimenti sono stati fatti almeno tre volte.
Linea cellulare di macrofagi RAW264.7
La cellula macrofagi RAW 264.7 è stata fornita dalla American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA), ed è stato mantenuto in modificata mezzo di Eagle Dulbecco , integrato con il 10% di siero fetale bovino, a 37 ° C in un incubatore umido con 5% di CO 2.
ceppi di H. pylori
H. pylori ceppo 26695 (ATCC 700.392, cag PAI +) e Tx30a (ATCC 51932, cag PAI -) sono stati offerti da ATCC (Rockville, MD, USA). Esse sono state coltivate su piastre di agar sangue di pecora a 37 ° C in condizioni microaerofili. I batteri sono stati trasferiti dopo 48 h in brodo Brucella contenente 5% di siero fetale bovino per 24 h. Una molteplicità di infezione di 100 è stato utilizzato in tutti gli studi. Real-time trascrizione inversa PCR
RNA totale è stato isolato dai tessuti e linee cellulari da Trizol (Takara, Dalian, Cina) secondo il protocollo fornito dal produttori. cDNA è stato sintetizzato con Takara RNA PCR 3.0 Kit (Takara, Dalian, Cina) in un volume totale di 10 ml, contenente AMV trascrittasi inversa, 0,5 ml; casuale 9 Primer, 0,5 ml; 25 mM MgCl 2, 2 ml; 10 × RT Buffer, 1 ml; miscela di dNTP (ogni 10 mM), 1 ml; inibitore RNasi, 0,25 ml; RNA 1 ml; dH 2O, 3,75 ml. Condizioni per RT erano: 30 ° C per 10 minuti, 42 ° C per 25 minuti, 99 ° C per 5 minuti e 5 ° C per 5 minuti. Real-time PCR è stata effettuata utilizzando il sistema LightCycler insieme al LightCycler DNA Maestro SYBR Green I Kit (Roche Diagnostics). Il volume totale è di 20 ml, contenente 25 mM MgCl 2, 3 ml; 10 × Buffer, 5 ml; 10 micron Primer in avanti, 1 ml; 10 micron invertire Primer, 1 ml; LightCycler DNA Maestro SYBR Green I, 2 ml; cDNA, 2 ml; dH 2O, 6 ml. Condizioni di PCR erano: 50 ° C per 2 minuti, 95 ° C per 10 minuti e quindi 40 cicli di 5 secondi a 95 ° C e 20 secondi a 60 ° C. Il gene housekeeping deidrogenasi gliceraldeide-3-fosfato (GAPDH
) è stato utilizzato come controllo interno. L'espressione genica è stato quantificato con il metodo del CT comparativo, normalizzando i valori CT per GAPDH
e il calcolo dei valori di espressione relativi. sequenze primer sono stati forniti da Takala (Dalian, Cina) come segue: CXCR4
avanti, 5'-GAGGAAATGGGCTCAGGG-3 ', invertire, 5'-AGTCAGCAGGAGGGCAGGGA-3'; TNF-α
avanti, 5'-AGTGACAAGCCTGTAGCCC-3 ', reverse, 5'-GCAATGATCCCAAAGTAGACC-3'; IL-1β
avanti, 5'-CCACCACTACAGCAAGGG-3 ', invertire, 5'-GAACTGGGCAGACTCAAA-3'; IL-6
avanti, 5'-CCTTCGGTCCAGTTGCCTTCT-3 ', invertire, 5'-GCATTTGTGGTTGGGTCA-3'; GAPDH
avanti, 5'-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3 ', reverse, 5'-AAAGGTGGAGGAGTGGGT-3'.
Western blotting
lisati cellulari sono stati preparati con tampone [50 mmol /L Tris-HCl (pH 6.8 ), 100 mmol /L DTT, 2% SDS, 0,1% blu di bromofenolo e 10% glicerolo] e sono stati sottoposti ad un solfato 12% sodio dodecil (SDS) /gel di acrilammide. Le proteine ​​su gel di acrilammide sono stati trasferiti ad una membrana di nylon, che è stato bloccato durante la notte (4 ° C in PBS con 0,1% Tween e il 10% di latte in polvere). anticorpi policlonali per CXCR4 (Santa Cruz, CA, America), ed i corrispondenti anticorpi secondari (Santa Cruz, CA, America) sono stati applicati prima immunoblotting. Il
gene umano β-actina (Santa Cruz, CA, America) è stato utilizzato come controllo interno. Macchie sono state visualizzate con il sistema di FX Pro Plus (Bio-Rad) e quantificati utilizzando Scion Immagine software 4.03. Interferenza dell'RNA

TNF-RNAi plasmide e nonsilencing controllo RNAi plasmide sono stati acquistati da Takala (Dalian, Cina). Le cellule sono state seminate in una piastra da 24 pozzetti ad una densità di 2 × 10 5. Il giorno seguente, le cellule sono state trasfettate con TNF-alfa siRNA o di controllo siRNA usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Regno Unito) secondo le istruzioni del produttore.
Elisa per citochine nella cultura supernatanti cellulari
concentrazioni di TNF-α, iL-1β e iL-6 in surnatanti di colture cellulari sono stati misurati utilizzando il kit Quantikine Elisa (Boster, Wuhan, Cina) secondo le istruzioni del produttore. La sensibilità del test è stata di 2 pg /ml per il TNF-α, 4 pg /ml per IL-1β e 4 pg /ml di IL-6.
Test di migrazione
La migrazione delle cellule in coltura è stato analizzato utilizzando Matrigel camera di invasione (formato 24 pozzetti, 8 micron pori; BD Pharmingen). Le cellule (5 × 10 5) sono stati aggiunti nella camera superiore e mezzo integrato con CXCL12 (100 ng /ml, Sigma) è stato aggiunto alla camera inferiore. saggi di migrazione sono state incubate per 18 ore a 37 ° C e 5% CO 2. cellule migrate sulla superficie inferiore sono state colorate con 1% blu di toluidina dopo fissazione con il 100% di metanolo. Per ogni transwell, il numero di cellule migrate in 10 campi di media potenza (× 20) è stato contato. L'analisi statistica
Mann-Whitney U-test
stato utilizzato per confrontare l'espressione di mRNA tra H. pylori-positivi e tumori H. pylori-negativi. Correlazione tra l'espressione CXCR4 e l'espressione del TNF-α in campioni di cancro gastrico è stato analizzato utilizzando test di correlazione di Spearman. L'espressione di mRNA nelle linee di cellule gastriche è stato confrontato con t di Student
-test o un modo ANOVA. L'analisi statistica è stata effettuata utilizzando SPSS versione 11.0 (SPSS, Chicago, IL, USA). La differenza è stata considerata significativa se P
-value era < 0.05
. Risultati
espressione di CXCR4 e TNF-α mRNA in tumori gastrici primario
CXCR4 mRNA è stato determinato dal tempo reale trascrizione inversa PCR in 34 tumori gastrici, e la sua espressione in ogni campione è stato standardizzato GAPDH
espressione. I risultati hanno rivelato il suo livello significativamente più alto nei tumori gastrici H. pylori-positivi (n = 19) rispetto a quelli H. pylori-negativi (n = 15) (7,2 volte, P
< 0,01, figura 1A). Nella stessa coorte di tumori, espressione dell'mRNA del TNF-α è stato rilevato anche da tempo reale trascrizione inversa PCR, e si è trovato più forte nei tumori gastrici H. pylori-positivi rispetto a quelli H. pylori-negativi (4,3 volte, P
< 0.01, Figura 1B). test di correlazione di Spearman verificato inoltre una correlazione positiva di espressione CXCR4 con TNF-α in questi 34 tumori gastrici (P
< 0,01, Figura 1C). Figura 1 L'espressione di CXCR4 e TNF-α mRNA in tumori gastrici primario di real-time PCR. (A) e (B) H. pylori-positivi tumori gastrici (colonne grigie, n = 19) espressi elevato livello di CXCR4 (A) e TNF-α (B) rispetto al mRNA H. tumori gastrici pylori-negativi (colonne nere , n = 15), * P
< 0.01. Linee orizzontali: mezzi di livello di mRNA. (C) Livello di CXCR4 mRNA era positivamente correlata con quella del TNF-α mRNA in 34 tumori gastrici, P
< 0.01. Nero rombo: tumori gastrici H. pylori-negativi; rombi grigio:. tumori gastrici H. pylori-positivi
induzione di CXCR4 e di espressione del TNF-α da H. pylori in cellule di cancro gastrico Real time-PCR e Western blotting sono stati utilizzati per rilevare l'espressione CXCR4 in MKN45 e HGC27 cellule (Figura 2A, B); e rivelare che upregulated significativamente in loro dopo l'infezione da H. pylori 26695 per 24 ore (P
< 0,01, rispettivamente Figura 2A, B). Successivamente sono stati trattati con una cag PAI-negativo H. pylori, Tx30a per determinare il suo coinvolgimento nel upregulation, ed è anche trovato a indurre l'espressione CXCR4 nelle cellule MKN45 e HGC27 (P
< 0,01, rispettivamente figura 2A , B). Figura 2 L'espressione di CXCR4 e TNF-α nelle cellule MKN45 e HGC27 dopo l'infezione da H. pylori. (A) e l'espressione CXCR4 (B) è stato upregulated in MKN45 e HGC27 cellule dopo l'infezione da H. pylori 26695 (* P
< 0,01, rispettivamente vs
H. pylori) o Tx30a (* P
< 0,01, rispettivamente vs
H. pylori). (C) e (D) l'espressione del TNF-α è stata aumentata in MKN45 e HGC27 cellule dopo l'infezione da H. pylori 26695 (* P
< 0,01, rispettivamente vs
H. pylori) o Tx30a (* P
< 0,01, rispettivamente vs
H. pylori). I dati sono espressi come media ± SD, n = 3.
L'effetto di infezione da H. pylori sull'espressione del TNF-α è stato ulteriormente indagato mediante PCR in tempo reale ed Elisa, e la rilevazione ha rivelato che l'infezione da 26695 o Tx30a per 12 ore possono hanno permesso sia più espressione di TNF-α mRNA (P
< 0,01 rispettivamente) e più secrezione della proteina TNF-α nel supernatante della coltura (P
< 0.01, rispettivamente) e MKN45 cellule HGC27 (Figura 2C, D).
effetto di infliximab, un anticorpo neutralizzante di TNF-α, sull'induzione di espressione CXCR4 da H. Pylori
il ritrovamento di up-regolazione dell'espressione del TNF-α in questo caso ha portato noi di ulteriori ricerche sul suo coinvolgimento nella induzione di espressione CXCR4 da H. pylori. Un anticorpo neutralizzante TNF-α, infliximab (4 mg /ml, Sigma), è stato poi utilizzato per il trattamento di cellule MKN45 e HGC27 dopo un'infezione da 26695, e l'induzione di CXCR4 è stata inibita significativamente (P
< 0,01, rispettivamente, , Figura 3A, B). sono stati osservati risultati simili quando queste cellule sono state trattate con infliximab dopo un'infezione da Tx30a (P
< 0,01, rispettivamente Figure3C, D). Figura 3 Effetto di infliximab sull'induzione di espressione CXCR4 da H. Pylori. (A) e (B) CXCR4 upregulation indotta da H. pylori 26695 è stata inibita in cellule MKN45 e HGC27 dopo il trattamento con infliximab, * P
< 0,01, rispettivamente vs
26695 + inf. (C) e (D) CXCR4 upregulation indotta da H. pylori Tx30a è stata anche inibita in cellule MKN45 e HGC27 dopo il trattamento con infliximab, * P
< 0,01, rispettivamente vs
Tx30a + inf. I dati sono espressi come media ± SD, n = 3. inf. Infliximab
upregulation di espressione CXCR4 in cellule di cancro gastrico dal TNF-α
cellule MKN45, che segreto più basso livello di proteina TNF-α, sono stati trattati con 1, 10, o 50 ng /ml TNF-α (Sigma) per 6 ore in tentativo di esplorare ulteriormente il ruolo del TNF-α nel upregulation di espressione CXCR4, e real time-PCR e rilevazione Western blotting hanno rivelato è stato upregulated significativamente in modo dose-dipendente (P
< 0.01, Figura 4A, B), ed anche da 15,8 pieghe con 50 ng /ml TNF-α. Figura 4 upregulation di espressione CXCR4 in cellule di cancro gastrico dal TNF-α. (A) e l'espressione CXCR4 (B) è stato upregulated in MKN45 cellule mediante esogeno TNF-α in modo dose-dipendente, * P
< 0.01. (C) e (D) Il sistema di co-coltura di cellule e MKN45 RAW264.7 espresso più CXCR4, * P
< 0.001, vs
M; ** P
< 0.001, vs
R. La up-regolazione di espressione CXCR4 è stato inibito dopo il trattamento con infliximab, *** P
< 0.001, vs
M + R + inf. M: MKN45; R: RAW264.7; inf: infliximab. (E) L'espressione di TNF-α era assente in cellule HGC27 dopo trasfezione con TNF-alfa RNAi plasmide. espressione (F) CXCR4 mRNA era downregulated in HGC27 cellule dopo trasfezione con TNF-alfa RNAi plamid, * P
< 0.001, vs
No RNAi; ** P
< 0.001, vs
controllo RNAi. I dati sono espressi come media ± SD, n = 3.
Successivamente, l'espressione CXCR4 in un sistema di co-coltura è stato esaminato, poiché macrofagi associati al tumore servono anche come fonte di TNF-α nel microambiente cancro gastrico. Un co-coltura di cellule MKN45 con le cellule RAW264.7 per 24 ore indicato è espresso molto più CXCR4 mRNA e di proteine ​​(P
< 0,001, figura 4C, D); tale incremento, tuttavia, è stata significativamente inibita da infliximab (P
< 0,001, figura 4C, D)
Infine, endogena TNF-α è stata mirata a valutare il suo regolamento relativo espressione CXCR4 in HGC27 cellule, che segreti più alti. livello di proteina TNF-α. TNF-alfa RNAi plasmide è stato usato per trasfezione HGC27 cellule, e di conseguenza nonsilencing RNAi plasmide è stato impiegato nella controparte come controllo. È stato osservato che l'espressione di TNF-α era assente in HGC27 cellule dopo trasfezione con TNF-alfa RNAi plasmide (Figura 4E). Poi l'espressione di CXCR4 è stato rilevato dal PCR in tempo reale, ed è stato osservato nella rilevazione che, dopo trasfezione con TNF-alfa RNAi plasmide, espressione di CXCR4 mRNA era downregulated significativamente nelle cellule HGC27, rispetto alle cellule con controllo di RNAi o cellule senza RNAi (P
< 0.001 rispettivamente, Figura 4F).
induzione di citochine nei macrofagi da H. Pylori Real-time PCR ed Elisa sono stati impiegati per valutare l'effetto di H. pylori 26695 sull'espressione delle citochine in cellule RAW264.7, poiché è generalmente riconosciuto che le citochine sono coinvolte nei processi infiammatori cronici causati da H. Pylori. Il rilevamento real-time PCR ha mostrato espressione di TNF-α, IL-1β e IL-6 mRNA è stato upregulated in 26695 trattati con cellule rispetto alle cellule non trattate 26695-(TNF-alfa, P
< 0,001; IL-1β , P
< 0,001 e IL-6, P
< 0,001, Figura 5A). E i risultati hanno indicato Elisa più proteine ​​di TNF-α, IL-1β e IL-6 sono stati secreto nella cultura surnatante in 26695 trattati con cellule rispetto al 26695-trattati cellule (TNF-alfa, P
< 0,001; IL-1β , P
< 0,001 e IL-6, P
< 0,001, Figura 5B). Figura 5 induzione di citochine nei macrofagi di H. Pylori. (A) e (B) Espressione di TNF-α, IL-1β e IL-6 è stata upregulated in 26695-trattati cellule RAW264.7, * P
< 0.001, VS
cellule non trattate. (C) e (D) Né IL-1β, né IL-6 possono aumentare l'espressione CXCR4 in MKN45 cellule. I dati sono espressi come media ± SD, n = 3.
Infine MKN45 cellule sono state trattate con IL-1β esogena (50 ng /ml) e IL-6 (50 ng /ml), rispettivamente, per escludere la possibilità che IL -1β e IL-6 possono upregulate espressione CXCR4 come TNF-α. Né IL-1β, né IL-6 è stato trovato per aumentare l'espressione CXCR4 significativamente (Figura 5C, D). Analisi
migrazione
analisi migrazione è stata effettuata utilizzando la camera di invasione Matrigel nel tentativo di verificare se il CXCR4 upregulated era funzionale . Nella fase iniziale dell'esperimento con 100 ng /ml di CXCL12 nella camera inferiore, c'è stato un aumento significativo (fino a 4,5 pieghe) nella migrazione di cellule MKN45 con 26695 trattamento nella camera superiore, rispetto alle cellule di controllo senza 26695 trattamento (P
< 0,001, figura 6A). In seguito, tuttavia, la crescita è stata inibita notevolmente quando AMD 3100 (1 mg /ml, Sigma), un antagonista CXCR4, o infliximab, è stato aggiunto (P
< 0.01 rispettivamente, Figura 6A). Figura 6 studio migrazione. (A) MKN45 cellule mostravano un significativo aumento della loro migrazione dopo trattamento con 26695, * P
< 0.001, vs
controllo. L'aumento della migrazione delle cellule MKN45 indotte da 26695 è stata inibita quando AMD 3100 (** P
< 0,01, vs
26695 + AMD), o infliximab (*** P
< 0,01, vs è stato aggiunto
26695 + inf). AMD: AMD3100; inf: infliximab. (B) TNF-α aumenta la migrazione delle cellule MKN45, * P
< 0.001, vs
controllo. Né IL-1β né IL-6 possono aumentare in modo significativo la migrazione delle cellule MKN45. I dati sono espressi come media ± SD, n = 3.
Inoltre, l'effetto delle citochine sulla migrazione cellulare MKN45 stato anche esaminato, e TNF-α (50 ng /ml) è stato trovato per aumentare significativamente la migrazione cellulare MKN45 (P
< 0,001, Figura 6B). Tuttavia, né IL-1β (50 ng /ml), né IL-6 (50 ng /ml) è stato dimostrato per promuovere la migrazione cellulare MKN45 notevolmente (Figura 6B).
Discussione
H. pylori è accusato di infettare circa il 50% della popolazione mondiale come cancerogeno gastrica definitiva per gli esseri umani [12]. Patogenesi della sua infezione spesso include infiammazione, danno della mucosa, o atrofia gastrica, e richiede una stretta interazione tra i batteri e le cellule epiteliali gastriche, l'attivazione di vie di segnalazione, modificando le funzioni cellulari di accoglienza, e che porta a risposte epiteliali cronici [13.14]. Ora ci sono considerevoli prove che collegano l'infiammazione cronica di tumori umani [15-17], e l'infiammazione cronica in particolare, H. pylori-indotta e citochine nel microambiente stomaco locali servono come contributori più comuni [18-20]. Questo studio mette in evidenza il risultato che il livello della mucosa del TNF-α mRNA era significativamente più alta nei pazienti H. pylori positivi rispetto ai pazienti negativi utilizzando quantitativa real-time PCR, e due cellule di cancro gastrico anche secreta proteina TNF-α in vitro. E ulteriori punti per l'ipotesi che il TNF-α può essere coinvolto nella H. pylori carcinogenesi gastrica positivo come un linker indispensabile e forte tra infiammazione e cancro [21].
Anche se il meccanismo di induzione di TNF-α da H. pylori rimane relativamente poco chiara, una famiglia di proteine ​​è stato descritto nell'ultimo decennio, compresi Helicobacter pylori membrana proteina-1 (HP-MP1) e TNF-α inducendo proteine ​​(Tipα) [22-24]. Tipα gene, identificato da H. pylori ceppo 26695, è omologa del gene HP-MP1 con 94,3% di omologia, ed entrambi mostrano una forte capacità di indurre l'espressione del gene del TNF-α. Nello studio, H. pylori 26695 è risultato upregulate espressione del TNF-α in modo significativo nelle cellule MKN45 e HGC27, e cag PAI ceppo negativo Tx30a anche stato notato per indurre ovviamente, che può essere in parte dovuto al fatto che HP-MP1 /famiglia Tipα non è in cag PAI regione. Tuttavia, è stato anche osservato che l'effetto di Tx30a sull'induzione TNF-α era più debole di quello del 26695 (2,3 pieghe vs
3,1 pieghe in cellule MKN45), che ha suggerito i prodotti da H. pylori in cag PAI può essere incluso anche in l'induzione. In realtà, era stato riferito che cagA di H. pylori potrebbe indurre TNF-α in campioni bioptici di cancro gastrico [25]. Inoltre, purificato da H. pylori ureasi è stato anche trovato per indurre MKN45 cellule per esprimere il TNF-α [26].
TNF-α, una citochina chiave in molte malattie infiammatorie croniche, è stato originariamente identificato come un fattore di siero per l'induzione di emorragica necrosi di tumori solidi trapiantati in topi. Tuttavia, attualmente è comunemente identificato come promotore tumorale nel microambiente locale del tumore, e quindi la delezione o l'inibizione di esso è supposto per ridurre l'incidenza di tumori sperimentali. /TNF-R1 abbattere topi TNF-alfa sono resistenti alla cancerogenesi chimica indotta [27, 28]. Si è spesso rilevato nelle biopsie provenienti da una varietà di tumori umani, prodotta sia dalle cellule tumorali epiteliali o cellule stromali. Inoltre, è anche trovato, anche se in bassa quantità, nella secrezione di molte linee tumorali in vitro senza stimoli infiammatori, anche se il meccanismo non è ancora del tutto chiaro.
TNF-α è stato trovato non solo coinvolti nella trasformazione cellulare e proliferazione , ma anche in metastasi tumorali. Tale constatazione è stata inizialmente basata su un modello animale di cancro al colon, in cui l'iniezione di LPS migliorato lo sviluppo di metastasi polmonari dipendenti dalla produzione di TNF-α da cellule ospiti [29]. I risultati successivi hanno mostrato la maggiore metastasi tumorali inibita da anticorpi neutralizzanti il ​​TNF-α [30]. Questi hanno portato alla nostra speculazione che uno dei meccanismi alla base di TNF-α in metastasi tumorali possono essere correlati alla sovraregolazione delle chemochine recettori /chemochine. In primo luogo, c'è stata una significativa upregulation di CXCR4 in cellule di cancro gastrico dopo che sono stati trattati con esogeno TNF-α. Ci fu un altro upregulation evidente di espressione CXCR4 nelle cellule tumorali dopo che erano stati co-coltura con macrofagi, una fonte alternativa di TNF-α in gastrica microambiente cancro. Come ci si aspettava, questo upregulation potrebbe essere inibita dal TNF-α anticorpi neutralizzanti infliximab. C'era quindi una notevole riduzione della espressione di CXCR4 in HGC27 celle dopo RNAi è stato impiegato per abrogare l'espressione di TNF-α in queste cellule, che indicava endogena TNF-α possono anche aumentare l'espressione CXCR4. I risultati complessivi hanno portato alla nostra conclusione che il TNF-α, con se stesso coinvolto nella metastasi del cancro gastrico, fa aumentare l'espressione CXCR4.
Sovraespressione di CXCR4, il cui coinvolgimento in diversi tumori umani è noto, è stata frequentemente osservata nei tessuti di cancro gastrico per aumentare la metastasi del cancro gastrico. Alcune cellule di carcinoma gastrico umane esprimono anche CXCR4 mRNA e di proteine ​​ad alti livelli [7, 8]. Il nostro studio ha mostrato infezione da H. pylori aumenta la migrazione delle cellule MKN45 attraverso l'up-regolazione di espressione CXCR4. Il trattamento con un antagonista AMD3100 CXCR4 determinato una significativa soppressione della migrazione cellulare MKN45 in vitro. Un altro studio ha mostrato AMD3100 notevolmente soppressa sviluppo di carcinomatosi peritoneale in un modello murino di cancro gastrico, che è stato evidenziato dalla riduzione della crescita tumorale e formazione di fluido ascitico [9]. Le ricerche precedenti hanno portato alla nostra conclusione che CXCR4 sovraespressione a campione bioptico di cancro gastrico primaria può servire come valutazione preoperatoria dei rischi per la presenza di carcinosi peritoneale.
Coinvolgimento macrofagi 'nella carcinogenesi e tumore invasione e metastasi [31, 32 ] generalmente è accusato di motivare TAM (tumore associato macrofagi), una delle principali fonti di TNF-α nel microambiente tumorale, di rilasciare una serie di fattori di crescita, citochine e mediatori infiammatori. Lo studio ha rivelato c'è stata una significativa espressione di TNF-α indotta da H. pylori, e simultaneamente upregulation di IL-1beta e IL-6 in cellule RAW264.7, tuttavia, quest'ultima variante omesso di indurre l'espressione CXCR4 in cellule MKN45.
Gli studi hanno infine attribuito l'attivazione anormale di NF-kB in cellule tumorali per l'eccessiva secrezione di TNF-α, il cui ruolo nella CXCR4 up-regolazione viene successivamente assunto essere correlato alla vie mediate da NF-kB. Altre scoperte hanno rivelato antagonisti del TNF-α in grado di inibire l'up-regolazione di CXCR4 espressione da H. pylori, e sia essa e antagonisti CXCR4 possono sopprimere l'aumento della migrazione delle cellule di cancro gastrico in vitro. Questi risultati suggeriscono che solo questi antagonisti, o in combinazione con altre terapie, possono servire come terapie efficaci per i pazienti affetti da cancro gastrico.
Conclusioni
TNF-α è coinvolto nella up-regolazione di espressione CXCR4 nel carcinoma gastrico indotto da H. pylori.
Dichiarazioni
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione Divisione della Pubblica Istruzione, provincia di Liaoning, Cina (2009A751). fascicoli presentati originali
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Gli autori dichiarano di non avere interessi in gioco.

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