Envolvimento de fator de necrose tumoral-α na regulação positiva da expressão de CXCR4 no câncer gástrico induzida por Helicobacter pylori

Envolvimento de fator de necrose tumoral-α na regulação positiva da expressão de CXCR4 no câncer gástrico induzida por Helicobacter pylori da arte abstracta
Fundo
H. pylori, cuja infecção aumenta capacidade de invasão tumoral e metástase, é geralmente rotulado como o risco mais forte factor de desenvolvimento de cancro gástrico. Ele não parece ser uma coincidência que há também uma superexpressão de CXCR4 e um envolvimento óbvio em metástase do câncer gástrico. O objetivo deste estudo tenta investigar e promover a estabelecer uma ligação entre eles. Por H. pylori ser um potente indutor de TNF-α, se o TNF-α, um promotor tumoral, está envolvida na indução da expressão de CXCR4 por H. pylori também sob investigação neste estudo.
Métodos
Expressão de CXCR4, TNF-α, IL-6 e IL-1β ARNm foi determinada por PCR em tempo real. a expressão da proteína CXCR4 foi detectada por transferência Western. As concentrações de TNF-α, IL-6 e IL-1β em sobrenadantes de cultura de células foram medidos utilizando o kit Quantikine ELISA. Para anular a expressão do TNF-α em HGC27 células, utilizou-se TNF-a plasmídeo ARNi para transfectar-los.

Resultados Os níveis de CXCR4 e TNF-α ARNm foram significativamente maiores nos cancros gástricos H. pylori positivos (n = 19) em comparação com aqueles H. pylori negativos (n = 15). teste de correlação Uma posteriormente de Spearman mostrou que havia uma correlação positiva entre o nível de mRNA CXCR4 e que de TNF-α em 34 cancros gástricos primários. Outros resultados seguida: A expressão de CXCR4 e TNF-α foi regulada positivamente em células de cancro gástrico e MKN45 HGC27 após a infecção com H. pylori 26695 (CAG PAI +) ou Tx30a (CAG PAI -); A indução da expressão de CXCR4 por H. pylori foi significativamente inibida por um anticorpo neutralizante TNF-α, infliximab; expressão de CXCR4 foi regulada positivamente em células MKN45 após tratamento com TNF-α exógeno ou de co-cultura com macrófagos, e foi regulada negativamente em HGC27 células após a transfecção com plasmídeo de TNF-ct de RNAi. Houve um aumento significativo na migração de células MKN45 tratados com H. pylori 26695, e uma inibição forte quando a AMD 3100, um antagonista de CXCR4, ou infliximab, foi adicionado.

Conclusões Os nossos resultados demonstraram que a H. pylori aumenta a expressão CXCR4 no câncer gástrico através de TNF-α.
Fundo
é bem aceito que Helicobacter pylori (H. pylori) é um forte fator de risco para o desenvolvimento de várias doenças gástricas, ou seja, gastrite crônica, úlcera péptica, linfoma gástrico associado à mucosa do tecido linfóide e câncer gástrico, e reconhece-se que a interação entre H. pylori e células epiteliais contribui para esse desenvolvimento. De facto, a infecção por H. pylori induz inflamação no microambiente do estômago associado com a indução de citocinas pró-inflamatórias, tais como o factor de necrose tumoral-α (TNF-α), interleucina-1β (IL-1β) e IL-6 [1-3 ], o que torna carcinogênese gástrica propício.
H. pylori, também aumenta a capacidade de invasão tumoral e metástase [4-6], embora o mecanismo ainda não é bem compreendido. O processo de metástase do cancro não é aleatória, e cancros diferentes têm os seus sítios preferenciais homing. Assim como o tráfico de leucócitos, migração de células tumorais é criticamente reguladas pelo sistema receptor de quimiocinas /quimiocinas. Outro foco de nossa atenção é derramado em CXCR4, o receptor de quimiocinas mais comum sobre-expressos em uma série de tipos de câncer (câncer gástrico incluído), de longe [7, 8]. Estudos têm indicado eixo CXCL12 /CXCR4 está envolvida na metástase do cancro gástrico [9]. Por isso, desperta grande interesse para encontrar uma ligação entre a infecção pelo H. pylori e CXCR4 superexpressão no câncer gástrico.
Um dos mediadores químicos principais implicados em cancros associadas à inflamação é TNF-α, e há evidências de agora substancial no seu envolvimento na promoção e progressão de cancros experimentais e humanos [10, 11]. Fiel ao seu nome, doses elevadas de TNF-α regionais pode conduzir a necrose hemorrágica através destruição selectiva dos vasos sanguíneos do tumor. No entanto, pode inesperadamente actuar como um promotor endógeno do tumor, quando produzido no microambiente tumoral. O nosso interesse é, por conseguinte, desenhada para o seu envolvimento na indução da expressão de CXCR4 por H. pylori, um potente indutor de TNF-α, que é conhecido por regular positivamente uma série de citocinas, quimiocinas, moléculas de adesão e factores de crescimento de cancros.
métodos
linhas celulares de cancro gástrico e amostras de tecido
A célula de câncer gástrico humano MKN45 e HGC27 foram obtidos a partir Keygen Biotech. Co. (Nanjing, China), e foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com soro fetal bovino a 10%, a 37 ° C numa incubadora húmida com 5% de CO 2. 34 espécimes de câncer gástrico primários foram adquiridos a partir de pacientes sob a operação de todo o seu consentimento informado no hospital Shengjing, Universidade Médica Chinesa, e foram congeladas em nitrogênio líquido imediatamente após a remoção cirúrgica. secções Haematoxylin- e eosina de coloração foram preparados para avaliação da percentagem de células tumorais, e apenas amostras com > 70 células tumorais% foram seleccionados para análise. Este estudo foi realizado com a aprovação do comitê de ética da China Medical University. Todas as experiências foram feitas pelo menos três vezes.
Linha celular de macrófagos RAW264.7
O celular de macrófagos RAW 264.7 foi fornecida pela American Type Culture Collection (Rockville, MD, EUA), e foi mantida em meio de Eagle modificado por Dulbecco , suplementado com soro fetal bovino a 10%, a 37 ° C numa incubadora húmida com 5% de CO 2.
estirpes de H. pylori
H. pylori estirpe 26695 (ATCC 700392, cag PAI +) e Tx30a (ATCC 51.932, cag PAI -) foram oferecidos pela ATCC (Rockville, MD, EUA). Elas foram cultivadas em placas de agar de sangue de ovelha a 37 ° C sob condições microaerófilas. As bactérias foram transferidas após 48 h em caldo de Brucella contendo 5% de soro fetal bovino durante 24 h. Uma multiplicidade de infecção de 100 foi usado em todos os estudos.
Real-time PCR de transcrição reversa-
O ARN total foi isolado a partir de tecidos e linhas celulares de Trizol (Takara, Dalian, China) de acordo com o protocolo fornecido pela fabricantes. O ADNc foi sintetizado utilizando Takara RNA PCR Kit 3.0 (Takara, Dalian, China) em um volume total de 10 uL, contendo transcriptase reversa de AMV, 0,5 ul; 9 aleatório do iniciador, 0,5 ul; MgCl 25 mM 2, 2 ul; 10 × tampão de RT, 1 ml; mistura de dNTP (10 mM cada), 1 ul; inibidor de ARNase, 0,25 uL; 1 ul de RNA; dH <> sub 2O, 3,75 ul. Condições para a RT foram: 30 ° C durante 10 minutos, 42 ° C durante 25 minutos, 99 ° C durante 5 minutos, e 5 ° C durante 5 minutos. PCR em tempo real foi realizado utilizando o sistema LightCycler em conjunto com o LightCycler ADN mestre SYBR Green I kit (Roche Diagnostics). O volume total é de 20 ul, contendo 25 mM MgCl 2, 3 uL; 10 × tampão de, 5 uL; 10 uM iniciador de sentido directo, 1 ml; 10 mM reverter Primer, 1 ml; LightCycler ADN mestre SYBR Green I, 2 ul; ADNc, 2 ul; dH 2O, 6 ul. As condições para PCR foram: 50 ° C durante 2 minutos, 95 ° C durante 10 minutos, e depois 40 ciclos de 5 segundos a 95 ° C e 20 segundos a 60 ° C. A desidrogenase do gliceraldeído-3-fosfato gene de manutenção (GAPDH
) foi usada como um controlo interno. a expressão do gene foi quantificada pelo método CT comparativo, normalizando valores CT para GAPDH Comprar e calcular os valores de expressão relativa. As sequências dos iniciadores foram fornecidas pela Takala (Dalian, China) como se segue:
CXCR4 para a frente, 5'-GAGGAAATGGGCTCAGGG-3 ', reverso, 5'-AGTCAGCAGGAGGGCAGGGA-3'; TNF-α
para a frente, 5'-AGTGACAAGCCTGTAGCCC-3 ', reverso, 5'-GCAATGATCCCAAAGTAGACC-3'; IL-1β
para a frente, 5'-CCACCACTACAGCAAGGG-3 ', reverso, 5'-GAACTGGGCAGACTCAAA-3'; IL-6
para a frente, 5'-CCTTCGGTCCAGTTGCCTTCT-3 ', reverso, 5'-GCATTTGTGGTTGGGTCA-3'; GAPDH
para a frente, 5'-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3 ', reverso, 5'-AAAGGTGGAGGAGTGGGT-3'.
Western blotting de lisados ​​celulares foram preparados
com tampão de amostra [50 mmol /L de Tris-HCl (pH 6,8 ), 100 mmol /l de DTT, 2% de SDS, 0,1% de azul de bromofenol e glicerol a 10%] e foram submetidos a um 12% de sulfato de dodecilo de sódio (SDS) /gel de acrilamida. As proteínas no gel de acrilamida foram transferidas para uma membrana de nylon, que foi bloqueada durante a noite (4 ° C em PBS com 0,1% de Tween e 10% de leite em pó). Os anticorpos policlonais para o CXCR4 (Santa Cruz, CA, Estados Unidos), e os anticorpos secundários correspondentes (Santa Cruz, CA, Estados Unidos) foram aplicados antes de imunotransferência. A β-actina do gene humano
(Santa Cruz, CA, Estados Unidos) foi utilizado como um controlo interno. As manchas foram visualizadas com o sistema de FX Pro Plus (Bio-Rad) e quantificada utilizando o software Scion Imagem 4,03. Interferência
ARN
controlo plasmídeo ARNi plasmídeo RNAi e nonsilencing-TNFa foram comprados a partir de Takala (Dalian, China). As células foram semeadas numa placa de 24 poços a uma densidade de 2 × 10 5. No dia seguinte, as células foram transfectadas com TNF-alfa ou ARNsi de controlo utilizando Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Reino Unido) de acordo com as instruções do fabricante.
ELISA para as citocinas nos sobrenadantes de cultura de células
concentrações de TNF-α, IL-1β e IL-6 nos sobrenadantes de cultura de células foram medidos utilizando o kit Quantikine Elisa (Boster, Wuhan, China) de acordo com as instruções do fabricante. A sensibilidade do ensaio foi de 2 pg /ml de TNF-α, 4 pg /ml para IL-1β e 4 pg /ml para IL-6. Os ensaios de migração
A migração de células de cultura foi analisado utilizando Matrigel câmara de invasão (formato de 24 poços, 8 de poro; BD Pharmingen). As células (5 × 10 5) foram adicionadas à câmara superior e meio suplementado com CXCL12 (100 ng /ml, Sigma) foi adicionada à câmara inferior. Os ensaios de migração foram incubadas durante 18 horas a 37 ° C e 5% de CO 2. células que migraram na superfície inferior foram corados utilizando 1% de azul após a fixação com metanol a 100% de toluidina. Para cada transwell, o número de células migradas em 10 campos de potência média (x 20) foi contado. A análise estatística
de Mann-Whitney U
-test foi utilizado para comparar a expressão de ARNm entre o H. pylori positiva e tumores negativos a H. pylori. Correlação entre a expressão CXCR4 e expressão de TNF-α em amostras de câncer gástrico foi analisada por meio do teste de correlação de Spearman. A expressão de mRNA em linhas celulares gástricas foi comparada usando t de Student
-teste ou one way ANOVA. A análise estatística foi realizada usando SPSS versão 11.0 (SPSS, Chicago, IL, EUA). Diferença foi considerada significativa quando P
-valor foi < 0,05.

Resultados Expressão de CXCR4 e TNF-α ARNm em cancros gástricos primários
ARNm CXCR4 foi determinada por PCR em tempo real de transcrição reversa em 34 cancros gástricos, e a sua expressão em cada amostra foi normalizada para expressão GAPDH
. Os resultados revelaram o seu nível significativamente mais elevado em cancros gástricos H. pylori positivos (n = 19) em comparação com aqueles H. pylori negativos (n = 15) (7,2 vezes P,
< 0,01, Figura 1A). No mesmo grupo de tumores, a expressão de ARNm TNF-α também foi detectado em tempo real por transcrição reversa-PCR e verificou-se mais forte em cancros gástricos H. pylori positivos em comparação com aqueles H. pylori negativos (4,3 vezes, P
< 0,01, Figura 1B). teste de correlação de Spearman verificou ainda uma correlação positiva de expressão CXCR4 com TNF-α nestes 34 cânceres gástricos (P Art < 0,01, Figura 1C). Figura 1 A expressão de CXCR4 e TNF-α ARNm em cancros gástricos primárias por PCR em tempo real. (A) e (B) cancros gástricos H. pylori positivos (colunas cinzentas, n = 19), expressa um nível mais elevado de CXCR4 (A) e TNF-α (B) em comparação com o ARNm H. cancros gástricos pylori negativos (colunas pretas , n = 15), * P <
; 0,01. As linhas horizontais: meios de nível de mRNA. (C) Nível de ARNm CXCR4 foi positivamente correlacionada com a de ARNm de TNF-α em 34 cancros gástricos, P
< 0,01. losango preto: cancros gástricos H. pylori negativos; losango cinzento:. cancros gástricos H. pylori positivos
Indução de CXCR4 e a expressão do TNF-α por H. pylori em células de cancro gástrico
Real-Time PCR e transferência de Western foram usadas para detectar a expressão de CXCR4 em MKN45 e HGC27 células (Figura 2A, B); e revelam que regulada positivamente de forma significativa neles após a infecção com H. pylori 26695 durante 24 horas (P
< 0,01, respectivamente, Figura 2A, B). Subsequentemente, eles foram tratados com um CAG PAI-negativos a H. pylori, Tx30a para determinar o seu envolvimento na regulação alta, e é também encontrada para induzir a expressão de CXCR4 em células MKN45 e HGC27 (P
< 0,01, respectivamente, Figura 2A , B). Figura 2 Expressão de CXCR4 e TNF-α em células MKN45 e HGC27 após a infecção por H. pylori. (A) e (B) a expressão de CXCR4 foi regulada positivamente em células MKN45 e HGC27 após a infecção com H. pylori 26695 (* P
< 0,01, respectivamente, vs
H. pylori) ou Tx30a (* P
< 0,01, respectivamente, vs
H. pylori). (C) e (D) a expressão do TNF-α foi aumentada em células MKN45 e HGC27 após a infecção com H. pylori 26695 (* P
< 0,01, respectivamente, vs
H. pylori) ou Tx30a (* P Art < 0,01, respectivamente, vs
H. pylori). Os dados são expressos como média ± DP, n = 3.
O efeito de infecção por H. pylori sobre a expressão do TNF-α foi adicionalmente investigada utilizando PCR em tempo real e Elisa, e a detecção revelou que a infecção com 26695 ou Tx30a para 12 horas pode ter levado a tanto mais a expressão de ARNm TNF-α (P
< 0,01, respectivamente) e mais secreção da proteína TNF-α para o sobrenadante da cultura (P
< 0,01, respectivamente) em MKN45 e HGC27 células (Figura 2c, d).
Efeito de infliximab, um anticorpo neutralizante para TNF-α, na indução da expressão de CXCR4 pela H. pylori
a descoberta de regulação positiva da expressão de TNF-α neste caso apresentado -nos para continuar a investigação sobre seu envolvimento na indução da expressão de CXCR4 por H. pylori. Um anticorpo neutralizante de TNF-α, infliximab (4 ug /ml, Sigma), foi então utilizado para tratar células MKN45 e HGC27 após uma infecção por 26695, e a indução do receptor CXCR4 foi inibida significativamente (P
< 0,01, respectivamente , Figura 3A, B). Resultados semelhantes foram observados quando estas células foram tratadas com infliximab após uma infecção por Tx30a (P
< 0,01, respectivamente, Figure3C, D). Figura 3 Efeito de infliximab na indução da expressão de CXCR4 por H. pylori. (A) e a regulação positiva (B) CXCR4 induzida por H. pylori 26695 foi inibido em células MKN45 e HGC27 após o tratamento com infliximab, * P <
; 0,01, respectivamente, vs
26695 + inf. (C) e a regulação positiva (D) CXCR4 induzida por H. pylori Tx30a foi também inibida em células MKN45 e HGC27 após o tratamento com infliximab, * P <
; 0,01, respectivamente, vs
Tx30a + inf. Os dados são expressos como média ± DP, n = 3. inf:. Infliximab
A sobre-regulação da expressão de CXCR4 em células de cancro gástrico por TNF-α
células MKN45, que secreta menor nível de proteína TNF-α, foram tratados com 1, 10, ou 50 ng /ml de TNF-α (Sigma) durante 6 horas na tentativa de explorar ainda mais o papel do TNF-α na supra-regulação da expressão de CXCR4, e em tempo real-PCR e a detecção de transferência de Western revelou que foi regulada positivamente de forma significativa de um modo dependente da dose (P
< 0,01, Figura 4A, B), e até 15,8 por dobras com 50 ml tratamento ng /TNF-α. Figura 4 A sobre-regulação da expressão de CXCR4 em células de cancro gástrico por TNF-α. (A) e (B) a expressão de CXCR4 foi regulada positivamente em células MKN45 exógeno por TNF-α de uma forma dependente da dose, * P <
; 0,01. (C) e o sistema de co-cultura de MKN45 e células RAW264.7 (D) expressaram mais CXCR4, * P Art < 0.001, vs
M; ** P Art < 0.001, vs
R. A regulação positiva da expressão de CXCR4 foi inibida após o tratamento com infliximab, *** P Art < 0.001, vs
M + R + inf. H: MKN45; R: RAW264.7; inf: infliximab. (E) Expressão de TNF-α estava ausente em células HGC27 após a transfecção com plasmídeo de TNF-ct de RNAi. expressão (F) CXCR4 ARNm foi regulada negativamente em HGC27 células após a transfecção com TNF-ct ARNi plamid, * P <
; 0.001, vs
Sem RNAi; ** P Art < 0.001, vs
Controle de RNAi. Os dados são expressos como média ± DP, n = 3.
Em seguida, a expressão de CXCR4 dentro de um sistema de co-cultura foi examinado, uma vez que os macrófagos associados a tumores também servir como uma fonte de TNF-α no microambiente do cancro gástrico. Um co-cultura de células com células MKN45 RAW264.7 de 24 horas indicou que expressa significativamente mais ARNm e proteína CXCR4 (P
< 0,001, Figura 4C, D); este aumento, no entanto, foi significativamente inibido por infliximab (P Art < 0,001, Figura 4C, D)
Finalmente, endógena TNF-α foi alvo para avaliar a sua regulação na expressão CXCR4 em HGC27 células, que os segredos mais elevados. nível de proteína TNF-α. TNF-a RNAi plasmídeo foi usado para transfectar células HGC27, e correspondentemente nonsilencing plasmídeo ARNi foi empregue na contraparte como controlo. Observou-se que a expressão de TNF-α estava ausente em células HGC27 após a transfecção com TNF-ct ARNi plasmídeo (Figura 4E). Em seguida, a expressão de CXCR4 foi detectado por PCR em tempo real, e notou-se na detecção de que, após a transfecção com-TNFa plasmídeo RNAi, a expressão de ARNm de CXCR4 foi regulada negativamente de forma significativa em células HGC27, em comparação com células com controlo de RNAi em células sem ARNi (P
< 0,001, respectivamente, Figura 4F).
indução de citocinas em macrófagos pela H. pylori
-PCR em tempo real e de ELISA foram utilizados para avaliar o efeito de H. pylori 26695 na expressão de citocinas RAW264.7 em células, uma vez que é geralmente reconhecido que as citocinas estão envolvidas em processos inflamatórios crónicos causados ​​por H. pylori. A detecção por PCR em tempo real mostraram expressão de TNF-α, IL-1β e ARNm de IL-6 foi regulada positivamente em células tratadas-26695 em comparação com células não tratadas (26695-TNF-a, P
< 0,001; IL-1β , P
< 0,001 e IL-6, P
< 0,001, Figura 5A). E os resultados de ELISA indicam mais proteínas de TNF-α, IL-1β e IL-6 foram segregadas para o sobrenadante da cultura de 26695 células tratadas em comparação com as células não tratadas-26695 (TNF-a, P
< 0,001; IL-1β , P
< 0,001 e IL-6, P
< 0,001, Figura 5B). Figura 5 Indução de citocinas em macrófagos por H. pylori. (A) e (B) A expressão de TNF-α, IL-1β e IL-6 foi regulada positivamente em células tratadas 26695-RAW264.7, * P <
; 0,001,
vs células não tratadas. (C) e (D) Nem IL-1β nem a IL-6 pode regular a expressão de CXCR4 em células MKN45. Os dados são expressos como média ± DP, n = 3.
MKN45 Finalmente as células foram tratadas com IL-1β (50 ng /ml) e IL-6 (50 ng /ml), respectivamente, para excluir a possibilidade de que a IL -1β e IL-6 podem regular positivamente a expressão de CXCR4 como o TNF-α. Nem IL-1β nem a IL-6 foi encontrado para regular a expressão de CXCR4 significativamente (Figura 5C, D). A análise de migração

análise de migração foi realizada utilizando a câmara de invasão de Matrigel em uma tentativa para investigar se a CXCR4 foi regulada positivamente funcional . Na fase inicial da experiência, com 100 ng /ml de CXCL12 na câmara inferior, houve um aumento significativo (acima de 4,5 dobras) na migração de células MKN45 com 26695 tratamento na câmara superior, em comparação com células de controlo sem 26695 tratamento (P
< 0,001, Figura 6A). Mais tarde, no entanto, o aumento foi inibido notavelmente quando a AMD 3100 (1 ug /ml, Sigma), um antagonista do CXCR4, ou infliximab, foi adicionado (P
< 0,01, respectivamente, Figura 6A). Figura 6 estudo de Migração. (A) células MKN45 mostraram um aumento significativo na sua migração após tratamento com 26695, * P <
; 0.001, vs
controle. O aumento da migração de células MKN45 induzidas por 26695 foi inibido quando a AMD 3100 (** P
< 0,01, vs
26695 + AMD), ou infliximab (*** P
< 0,01, vs.
26695 + INF) foi adicionado. AMD: AMD3100; inf: infliximab. (B) TNF-α aumentou a migração de células MKN45, * P Art < 0.001, vs
controle. Nem IL-1β nem a IL-6 pode aumentar significativamente a migração de células MKN45. Os dados são expressos como média ± DP, n = 3.
Além disso, o efeito das citoquinas sobre a migração de células MKN45 também foi examinado, e TNF-α foi encontrada (50 ng /ml) para aumentar significativamente a migração celular MKN45 (P
< 0,001, Figura 6B). No entanto, nem a IL-1β (50 ng /ml) nem a IL-6 (50 ng /ml) foi provado para promover a migração de células MKN45 consideravelmente (Figura 6B).
Discussão
H. pylori é acusado de infectar cerca de 50% da população do mundo como um agente cancerígeno gástrica definitiva para os seres humanos [12]. Patogênese da sua infecção muitas vezes inclui inflamação, lesão da mucosa, ou atrofia gástrica, e requer interacções estreitas entre as bactérias e as células epiteliais gástricas, ativando vias de sinalização, modificar as funções celulares do hospedeiro, e levando a respostas epiteliais crônicas [13.14]. Há agora evidências consideráveis ​​que ligam a inflamação crônica de cancros humanos [15-17], e inflamação crônica, especificamente, induzida por H. pylori e citocinas no microambiente estômago locais servem como os contribuintes mais comuns [18-20]. Este estudo demonstra que o resultado da mucosa nível de TNF-α ARNm foi significativamente maior em pacientes H. pylori positivos do que em doentes negativos usando quantitativa PCR em tempo real, e duas células de cancro gástrico também segregada proteína TNF-α in vitro. É mais pontos ao pressuposto de que o TNF-α podem estar envolvidos na carcinogénese gástrica por H. pylori positiva como um ligante indispensável e forte entre a inflamação e cancro [21].
Embora o mecanismo de indução de TNF-α por H. pylori continua a ser relativamente pouco clara, uma família de proteínas tem sido descrito na última década, incluindo Helicobacter pylori membrana proteína-1 (HP-MP1) e TNF-α induzir proteína (Tipα) [22-24]. Tipα de genes, identificados a partir de H. pylori estirpe 26695, é homólogo ao gene HP-MP1 com 94,3% de homologia, e ambos mostram forte capacidade para induzir a expressão do gene TNF-α. No estudo, H. pylori 26695 foi encontrado para regular positivamente a expressão do TNF-α significativamente em células MKN45 e HGC27, e CAG PAI estirpe negativa Tx30a também foi descoberto para induzir, obviamente, que pode ser em parte devido ao facto de que o HP-MP1 /família Tipα não está na região PAI cag. No entanto, verificou-se também que o efeito de Tx30a sobre a indução de TNF-α foi mais fraca do que a de 26695 (2.3 dobras vs
3.1 dobras em células MKN45, o que sugeria) produtos de H. pylori em CAG PAI podem também ser envolvidas em a indução. De facto, tinha sido relatado que cag de H. pylori pode induzir o TNF-α em espécimes de biópsia do cancro gástrico [25]. Além disso, purificou-urease de H. pylori, também foi encontrada para induzir células MKN45 para expressar TNF-α [26].
TNF-α, uma citocina chave em muitas doenças inflamatórias crónicas, foi originalmente identificada como um factor de soro para a indução de necrose hemorrágica de tumores sólidos transplantados em ratinhos. No entanto, presentemente é vulgarmente identificado como um promotor do tumor em microambiente tumoral local, e, por conseguinte, a eliminação ou inibição da que é suposto reduzir a incidência de cancros experimentais. TNF-a /TNF-R1 derrubar os ratinhos são resistentes à carcinogénese induzida quimicamente [27, 28]. Ele é frequentemente detectada em biópsias de uma variedade de cancros humanos, produzido quer por células tumorais epiteliais ou células do estroma. Além disso, encontra-se também, embora em menor quantidade, na secreção de muitas linhas de cancro in vitro sem estímulos inflamatórios, embora o mecanismo ainda não é completamente claro.
TNF-α foi encontrada não só envolvida na transformação de células e proliferação , mas também na metástase tumoral. Tal conclusão baseou-se inicialmente um modelo animal com cancro do cólon, em que a injecção de LPS aumentou o desenvolvimento de metástases do pulmão dependente na produção de TNF-α por células hospedeiras [29]. Os resultados subsequentes mostraram o aumento da metástase do tumor inibida pelo anticorpo neutralizante TNF-α [30]. Estas levaram à nossa especulação de que um dos mecanismos subjacentes de TNF-α na metástase tumoral pode ser relacionado com o aumento de receptores de quimiocinas /quimioquinas. Em primeiro lugar, houve uma significativa supra-regulação de CXCR4 em células de cancro gástrico, após terem sido tratadas com TNF-α exógeno. Havia uma outra regulação positiva óbvia de expressão de CXCR4 em células de cancro após elas foram co-cultivados com macrófagos, uma fonte alternativa de TNF-α no microambiente do cancro gástrico. Como era de esperar, esta regulação positiva poderia ser inibida por TNF-α infliximab anticorpo neutralizante. Não era, consequentemente, uma redução notável da expressão de CXCR4 em HGC27 células após ARNi foi utilizado para anular a expressão de TNF-α nestas células, o que indica endógena de TNF-α também pode regular a expressão de CXCR4. Os resultados globais conduziu a nossa conclusão de que o TNF-α, com a própria envolvida na metástase do cancro gástrico, aumenta a expressão de CXCR4.
A sobre-expressão de CXCR4, cujo envolvimento em vários tumores humanos é bem conhecido, foi frequentemente observado em tecidos de cancro gástrico para aumentar a metástase do cancro gástrico. Algumas células de carcinoma gástrico humano também expressam mRNA e proteína CXCR4 em níveis elevados [7, 8]. Nosso estudo mostrou infecção por H. pylori aumentou a migração de células MKN45 através da regulação positiva da expressão de CXCR4. O tratamento com um antagonista de CXCR4 AMD3100 resultou numa supressão significativa da migração de células MKN45 in vitro. Um outro estudo mostrou AMD3100 suprimiu significativamente o desenvolvimento de carcinomatose peritoneal num modelo de ratinho de cancro gástrico, o que foi evidenciado pela redução do crescimento do tumor e formação de fluido ascítico [9]. As pesquisas anteriores levou a nossa conclusão de que CXCR4 superexpressão em biópsia de câncer gástrico primário pode servir como uma avaliação pré-operatória de riscos para a ocorrência de carcinomatose peritoneal. Envolvimento
'Os macrófagos na carcinogênese e invasão tumoral e metástase [31, 32 ] geralmente é responsabilizado para motivar TAM (tumor de macrófagos associados), a principal fonte de TNF-α no microambiente tumoral, para libertar uma variedade de factores de crescimento, citocinas e mediadores inflamatórios. O estudo revelou que havia uma expressão significativa de TNF-α induzida por H. pylori, e, simultaneamente, supra-regulação de IL-1 beta e IL-6 em células RAW264.7, No entanto, esta variação não conseguiu induzir a expressão de CXCR4 em células MKN45.
Estudos têm, em última análise atribuída a activação anormal de NF-kB em células de cancro para a secreção excessiva de TNF-α, cujo papel na regulação positiva é subsequentemente CXCR4 assumida para ser relacionada com vias mediadas por NF-kB. Outros resultados revelaram antagonistas de TNF-α pode inibir a regulação positiva da expressão de CXCR4 por H. pylori, e tanto um como antagonistas CXCR4 podem suprimir o aumento da migração de células de cancro gástrico in vitro. Estes resultados sugerem que estes antagonistas isoladamente, ou em combinação com outras terapias, podem servir como terapias eficazes para doentes com cancro gástrico.
Conclusões
TNF-α está envolvido na regulação positiva da expressão de CXCR4 em cancro gástrico induzida por H. pylori.
Declarações
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Divisão de Educação, Província de Liaoning, China (2009A751). arquivos enviados originais
dos autores para imagens
Abaixo estão os links aos arquivos submetidos originais dos autores para imagens. 'arquivo original para a figura 1 12885_2009_2218_MOESM2_ESM.tiff Autores' 12885_2009_2218_MOESM1_ESM.tiff Autores arquivo original para 'arquivo original para a figura 3 12885_2009_2218_MOESM4_ESM.tiff Autores' figura 2 12885_2009_2218_MOESM3_ESM.tiff Autores arquivo original para a figura 4 arquivo original 12885_2009_2218_MOESM5_ESM.tiff Autores 'para a figura 5 arquivo original '12885_2009_2218_MOESM6_ESM.tiff autores para a figura 6 Conflito de interesses
Os autores declaram que não têm interesses conflitantes.

• A interleucina-23A está associada com o crescimento do tumor em relacionadas com Helicobacter pylori humano cancer
• procedimentos mais comuns robóticos bariátrica: revisão e aspects