Фосфорилированные Smad2 в продвинутой стадии Желудочный Carcinoma

фосфорилированных Smad2 в продвинутой стадии карциноме желудка
Аннотация
Справочная информация
сигнализации рецептора трансформирующий фактор роста β (TGF-beta) тесно связана с вторжением способности клеток рака желудка. Хотя Smad сигнал является критическим интегратором сигнализации рецептора TGF-beta систем трансдукции, не так много известно о роли экспрессии Smad2 в раке желудка. Целью данного исследования является выяснение роли фосфорилирования Smad2 (п-Smad2) в желудочном аденокарциномы на поздних стадиях.
Методы
Иммуногистохимическое окрашивание с анти-п-Smad2 проводили на парафиновых срезах образцов из 135 пациентов с прогрессирующим желудка аденокарциномы. Мы также оценили связь между уровнями экспрессии р-Smad2 и клиникопатологическими характеристики больных с желудочной аденокарциномы.
Результаты
р-Smad2 уровень экспрессии был высок в 63 (47%) из 135 желудочных карцином. Уровень экспрессии р-Smad2 была значительно выше при диффузной типа карциномы (р = 0,007), опухоли брюшины метастаз (р = 0,017), а также опухоли с метастазов в лимфатических узлах (р = 0,047). Прогноз для р-Smad2-высоких пациентов была достоверно (р = 0,035, лог-ранговый) беднее, чем у п-Smad2-низких пациентов, в то время как многомерный анализ показал, что выражение р-Smad2 не является независимость прогностическим фактором.
Вывод
выражение п-Smad2 связано с злокачественного фенотипа и неблагоприятным прогнозом у больных с распространенным раком желудка.
фон
трансформирующий фактор роста бета (TGF-beta) представляет собой многофункциональный цитокин и один из наиболее важных путей для раковых клеток [1, 2]. TGF-beta связывается с двумя различными серин /треонин киназы рецепторов (TβR), названного типа I и типа II. Активированный тип TβR I киназа фосфорилирует Smad2 и SMAD3. Фосфорилированные Smad2 (п-Smad2) и п-Smad3 являются олигомеризован с Smad4, мигрируют в ядро ​​и регулируют транскрипцию [1, 3]. В нормальных эпителиальных клетках, TGF-beta является мощным ингибитором пролиферации, и он был рассмотрен супрессоров опухолей. Хотя TGF-beta действует как подавитель опухоли в опухоли на ранней стадии, в ходе прогрессии опухоли антипролиферативное функция TGF-beta теряется, а в некоторых случаях становится TGF-beta онкогенного фактора, индуцирующий пролиферацию клеток, инвазию, ангиогенез и подавление иммунитета [4, 5]. Сообщалось, что TGF-beta может сигнализировать не только через Smad-зависимой, но и Smad-независимых путей [6]. Из-за двойных аспектов в онкогенеза TGF-beta, Smad сигнал может быть критическим интегратором сигнальных систем рецептора TGF-beta трансдукции, хотя значение выражения Smad остается спорным. Бруна и др. 2007 показал, что высокая TGF-beta-Smad активность присутствует в агрессивных, высоко пролиферативных глиом и дает плохой прогноз у пациентов с глиомы [7], в то время как отсутствие Smad выражения, как представляется, коррелируют с развитием опухоли и неблагоприятным прогнозом у пациентов с пищеводной плоскоклеточный рак рак [8] рак молочной железы [9] и рак толстой кишки [10]. Не так много известно о прогностической ценности выражения Smad2 в раке желудка, в то время как несколько сообщений о сывороточные уровни TGF-beta [11, 12] предположил, что TGF-beta может вызвать инвазию и метастазирование при раке желудка. Понимание значения Smad2 может быть полезным при раке желудка. В этом исследовании, поэтому мы исследовали р-Smad2 экспрессию рака желудка, чтобы выяснить роль р-Smad2 в передовых желудка аденокарциномы.
Методы
Пациенты
Мы исследовали образцы хирургических пациентов в городе Осака Университетская больница, Осака, Япония. В общей сложности 135 пациентов, перенесших резекцию первичной опухоли желудка и были подтверждены гистологически иметь поздних стадиях рака желудка, были включены в данное исследование. "Распространенный рак" указывает на вторжение раковых заболеваний мышечная или серозной. Ни один из пациентов не подверглись предоперационной лучевой или химиотерапии. Патологические диагнозы и классификации следуют японской классификации карциноме желудка [13]. Печени метастазирование и перитонеальные метастазы были исследованы при лапаротомии. Перитонеальный лаваж цитологии брюшной полости проводили при лапаротомии и расслоенные раковые клетки микроскопически. Глубина инвазии опухоли, дифференцировки, узел метастазирования лимфы, венозной и лимфатической вторжения вторжения были основаны на микроскопическом исследовании материалов, полученных с помощью хирургической резекции. Гистологическое классификация была основана на преобладающей структуре опухоли. Гистологические подтипы были: папиллярная аденокарцинома, хорошо дифференцированной трубчатые аденокарциномы и умеренно дифференцированной аденокарциномы трубчатая, рассматривается как кишечная типа. Подтипы были: твердый слабо дифференцированной аденокарциномы, нетвердой слабо дифференцированной аденокарциномы, перстень-кольцо-клеточный рак и коллоидный рак, рассматривается как диффузного типа. Лимфоузлов метастаз было принято решение о регионарных лимфатических узлах метастазов. Региональные лимфатические узлы желудка подразделяются на три станции пронумерованными, как описано в японской классификации [13], что в зависимости от расположения первичной опухоли. По мере роста числа увеличения, он указал, что распространение в отдаленные лимфатические узлы. Протокол исследования соответствовали этическим руководящим принципам Хельсинкской декларации (1975 г.). Это исследование было одобрено комитетом по этике Osaka City University. Информированное согласие было получено от всех пациентов до вступления
иммуногистохимических методов
Все H &. Были рассмотрены E-тонированный горок хирургических образцов, а также представитель часть опухоли, которая включала участок глубочайшей вторжения был выбран для иммуногистохимического исследования
кроличьей поликлональной анти-человеческого антитела, Р-SMAD2 (Chemicon International, Themecula, CA. 1: 2000). использовали для обнаружения п-Smad2. Методы для иммуногистохимического окрашивания р-Smad2 были описаны в инструкции изготовителя. Короче говоря, слайды были депарафинировали, и нагревали в течение 20 мин при 105 ° С в автоклаве в целевых Retrieval Solution (Dako, Carpinteria, CA). Затем срезы инкубировали с 3% перекиси водорода, чтобы блокировать эндогенную активность пероксидазы. Образцы инкубировали с п-Smad2 антитела (1: 2000) в течение ночи при 4 ° С. Срезы инкубировали с биотинилированным козьим анти-кроличьим иммуноглобулином G в течение 30 мин, а затем три промывок PBS. Срезы обрабатывали стрептавидин-пероксидаза реагента и инкубировали в PBS диаминобензидина и 1% перекиси водорода об /об, с последующим counterstaining гематоксилином Майера. Ранее мы сообщали уровень экспрессии р-Smad2 в желудочном линиях раковых клеток [14]. Упущение первичного антитела служили в качестве отрицательного контроля.
Иммуногистохимическое определение п-SMAD2
P-Smad2 окрашивания оценивали при инвазии перед раком желудка. Оба гематоксилином и эозином, использовали в качестве эталонного слайда, чтобы выбрать области рака в вторгающегося фронте. Существование раковых клеток непрерывно исследовали с серозной на слизистую оболочку под микроскопом. Вторгшийся фронт определяли при поражении, где раковые клетки впервые были обнаружены с серозной стороны. P-Smad2 окрашивание было видно в ядрах раковых клеток. Процент р-Smad2 иммуноположительных клеток определяли путем подсчета 3 области случайно выбранных в ткани, в общей сложности 300 ядер раковых клеток. Оценка была сделана двумя двойном слепом независимых наблюдателей, которые не знали о клинических данных и гистологических диагнозов. Также определяли процент ядра окрашенных клеток для р-Smad2. Были 15 (11%) случаи противоречивой оценки между двумя независимыми наблюдателями. В этих случаях мы перепроверили и обсудили и окончательный счет был получен
консенсуса. Окрашивание был забит с использованием балльной системы Оллред, как описано ранее [15]. Для полуколичественного анализа п-Smad2 иммунореактивности, интенсивность окрашивания и процент опухолевых окрашенных клеток оценивали в репрезентативной высокой мощности (× 400) и маломощные поля (× 200) с помощью оптической микроскопии: интенсивность оценивали 0-3 (0 = нет иммунореактивности, 1 = слабое, 2 = умеренное и 3 = интенсивная иммунореактивность) и пропорции не был забит 0-5 (0 = 0%; 1 = 1-20%; 2 = 21-40%; 3 = 41-60%; 4 = 61-80%; 5 = 81-100%). Две оценки были затем добавляли для получения конечного результата 0-8. Средний балл всех случаев был 6,07. Тогда точка отсечения была определена 6; выражение р-Smad2 считался высокий уровень экспрессии, когда оценки были ≥7 и низкая экспрессия, когда показатели были &л; 7.
Статистический анализ
сравнительный анализ данных проводили с использованием критерия хи-квадрат или точного критерия Фишера. Длительности выживаемости были рассчитаны с использованием метода Каплана-Мейера и анализировали с помощью теста лог-ранга для сравнения кумулятивного продолжительности выживаемости в группах пациентов. Кокс пропорционального риска регрессия была использована для вычисления одномерных и многомерных соотношений опасностей для исследуемых параметров. Р-значение менее 0,05 определялось как статистически значимое. SPSS 10.0 Программное обеспечение (SPSS Япония, Токио, Япония) был использован для анализа.

Результаты Взаимосвязь между клинико-патологическими особенностями и фосфорно-Smad2 выражение
фосфо-Smad2 основном immunolocalized в ядрах раковых клеток (рис 1А). Интенсивность окраски и процент окрашенных клеток опухоли были переменными. Что касается интенсивности, оценка 0 было обнаружено ни в одном случае (0%), 1 балл в 55 случаях (41%), 2 балла в 33 случаях (24%), и 3 балла в 47 (35%) случаях. При оценке положительных процентных клеток, оценка 0 было обнаружено ни в одном случае (0%), оценка 1 в 2-х случаях (1%), 2 балла в 11 случаях (8%), 3 балла в 16 случаях (12%), оценка 4 в 43 случаях (32%), а также оценка 5 в 63 случаях (47%). Общий балл Олред варьировались от 2 до 8. высокий уровень экспрессии р-Smad2 было обнаружено у 63 (47%) из 135 желудочных карцином. Соотношения между р-Smad2 выражения и клинико-патологическими особенностями опухолей приведены в таблице 1. Уровень экспрессии Р-Smad2 был значительно выше при диффузном типа карциномы (р = 0,011) и достоверно коррелирует с перитонеальным метастаз (р = 0,017), лимфатических узлов метастазирование по японской классификации [13] или UICC классификации [16] (р = 0,047, р = 0,004) и перитонеального цитологического (р = 0,026). "Перитонеального цитологического" означает перитонеального лаважа цитологии лапаротомии в качестве стандартного метода для обнаружения свободных опухолевых клеток и полезный предсказатель перитонеального рецидива рака желудка. В 12 случаях, перитонеальный цитологии не была выполнена. Тогда общее число перитонеального цитологического было 123 случая. Там не было выявлено статистически значимой связи между фосфорно-Smad2 экспрессии и либо печеночной метастаз, венозного вторжения или лимфатическую вторжения. Число метастатических лимфатических узлов в высокой экспрессии группе (средний показатель = 12,3), было значительно выше (р = 0,002) выше, чем в странах с низким выражение группы (медиана = 5,77), в то время как никакой разницы от количества пораженных лимфатических узлов не было показано, между низким р-SMAD2 группы (медиана = 41,1) и высокой р-SMAD2 группах (медиана = 44,4). Рисунок 1 (А), иммуногистохимическое определение п-Smad2. P-Smad2 был обнаружен в ядрах раковых клеток. Иммунореактивного интенсивность баллов р-Smad2 окрашивания в опухолевых клетках оценивали с использованием положительного и отрицательного контроля. Оценка 3 означает высокую интенсивность, такой же, как положительного контроля. Иммунореактивности, 1 балл = слабый, 2 балла = умеренное, и оценка 3 = интенсивные. (× 400). (В), общей выживаемости пациентов, основанные на р-Smad2 выражении. Кривая выживаемости Каплана-Мейера показывает общую выживаемость по отношению к п-Smad2 экспрессии в 135 пациентов с раком желудка. Статистически значимая разница в выживаемости наблюдалось между группами высокого р-Smad2 и низких групп р-Smad2 (р = 0,035; лог-ранговый,).
Таблица 1 Отношения между п-Smad2 и клинико-патологическими особенностями в 135 рака желудка случаи.
Параметр

P-SMAD2

р
-Value

<й>
<й>
High (п = 63)

Low (п = 72)

<й>
Гендер
Мужской
39 ( 41,9%)
54 (58,1%)
NS
Женский
24 (57,1%)
18 (42,9%)
морфологическая особенность +
Тип 1
6 ( 37,5%)
10 (62,5%)
0.025
Тип 2
14 (35,0%)
26 (65,0%)
Тип 3
17 (45,9%)
20 (54,1%)
Тип 4
26 (61,9%)
16 (38,1%)
T стадии страница 2 из 7 (25,9%)
20 ( 74,1%)
0,031 страница 3 из 52 (50,0%)
52 (50,0%) 4
4 (100,0%)
0 (0.00%)
Дифференциация
кишечно-типа
15 (31,2%)
33 (68,8%)
0,011
диффузного типа
48 (55,2%)
39 (44,8%)
лимфоузлов метастаз +
(японская классификация)
n0 и N1
34 (40,5%)
50 (59,5%)
0,047
N2 и N3
29 (56,9 %)
22 (43,1%)
лимфатического узла метастаз ++
(UICC классификация)
N0 и N1
31 (36,9%)
53 (63,1%)
0,004
N2 и N3
32 (62,7%)
19 (37,3%)
печеночных метастаз
отрицательный
62 (47,0%)
70 (53,0%)
NS
Положительный
1 (33,3%)
2 (66,7%)
перитонеального метастазирования
отрицательный
48 (42,1%)
66 (57,9%)
0,017
Положительный
15 (71,4%)
6 (28,6%)
перитонеального цитологического +++
Отрицательный
36 (40,4%)
53 (59,6%)
0,026 <бр> позитиве
22 (64,7%)
12 (35,3%)
лимфатической инвазии
Ly0 и ly1
26 (40,6%)
38 (59,4%)
NS
LY2 и ly3
37 (52,1%)
34 (47,9%)
венозная инвазия
Отрицательный
50 (45,5%)
60 (54,5%)
NS
позитиве
13 (52,0%)
12 (48,0%)
клинической стадии
I
2 (22,2%)
7 (77,8%)
0,022
II
15 (39,5%)
23 (60,5%)
III
18 (40,0%)
27 (60,0%)
IV
28 (68,7% )
15 (31,3%)
+, Классификация в соответствии с общими правилами рака желудка изучению японского общества исследований рака желудка [13]. Тип 1 определяется как полипоидные опухоли; типа 2, как полипоидные опухоль с изъязвлением и с резко очерченных краями; 3-го типа, как изъязвляется рак с инфильтрацией рака в окружающую стену; тип 4, как диффузно инфильтрации плоский рак, в котором изъязвления, как правило, не является характерной чертой.
++, Узловой этап оценивали с помощью (UICC) опухолевого узла метастазирования Union Internationale Contre ле Рак (TNM) классификации [16], а по классификации в соответствии с общими правилами для желудка исследования рака исследовательского общества японского рака желудка. В классификации TNM, узловая стадия была классифицирована в соответствии с количеством вовлеченных региональных лимфоузлов следующим образом: Pn0, нет LN распространения; pN1, от 1 до 6 больных LNs; PN2, от 7 до 15; и pN3, более 15. В японской классификации, узловая стадия была классифицирована по степени положительного LN в n0, n1, n2 и n3 и считается, чтобы отразить анатомическое пути лимфатического распространения. n1 определяется как уточненного регионального заболевания LN и n2 или n3 определяются как отдаленная.
+++, в 12 случаях, перитонеальный цитологии не было выполнено (Всего 123 случаев).
фосфо-Smad2 относится с плохим прогнозом в желудочном
рака в этой серии поздних стадий рака желудка, выживаемость больных высокий уровень экспрессии фосфо-Smad2 был значительно беднее, чем у фосфо-Smad2 низкого уровня экспрессии пациентов (р = 0,035, рис 1B). В одномерном анализе, высокая фосфо-Smad2 выражение (р = 0,048), морфологический тип 4 (р &л; 0,001), диффузного типа опухоли (р &л; 0,001), метастазов в лимфатических узлах (р &л; 0,001), перитонеальный метастаз (р ≪ 0,001), перитонеальные свободные раковые клетки (р &л; 0,001), лимфатической инвазии (р = 0,006) и клинической стадии IV (р &л; 0,001) были связаны с плохой выживаемости пациентов (таблица 2). В многомерном анализе, морфологического типа 4, опухолей диффузного типа и клинической стадии IV были статистически независимыми прогностическими факторами, но фосфо-Smad2 не было (таблица 3) .table 2 анализ Одномерный относительно общей выживаемости (п = 135).
Параметры

соотношение риска

95% доверительный интервал

р
-Value

P-Smad2 выражение
1,650
1.005-2.710
0,048
низкий против
. высокая
Морфологические особенность
5.354
3.199-8.963
&ЛТ; 0,001
Тип 1, 2, и 3 против
. Тип 4
дифференциацию
3.883
2.020-7.463
&лт; 0,001
Кишечные типа против
. Диффузный типа
узел метастаз Лимфодренаж (японская классификация)
3,269
1.978-5.403
&л; 0,001
N0 и N1 против
. N2 и N3
перитонеальный распространение
5,534
3.056-8.738
&л; 0,001
Негативный против
. положительный
перитонеального цитологического
5.937
3.468-10.166
&ЛТ; 0,001
Негативный против
. положительный
лимфатической инвазии
2,055
1.234-3.421
0,006
Ly0 и ly1 против
. LY2 и ly3
клинической стадии
6.901
4.088-11.651
&ЛТ; 0,001
I, II, и III против
. IV
Таблица 3 многофакторного анализа относительно общей выживаемости (п = 135).
Параметры

Соотношение риска

95 % доверительный интервал

р
-Value

P-Smad2 выражение
0,627
0.347-1.133
0,122
Low против
. высокая
Морфологические особенность
2,325
1.221-4.388
0,010
Тип 1, 2, и 3 против
. Тип 4
Дифференциация
2.807
1.251-6.298
0,012
кишечно-типа против
. Диффузный типа
узел метастаз Лимфодренаж (японская классификация)
1.387
0.689-2.794
0,360
N0 и N1 против
. N2 и N3
перитонеальный распространение
1.097
0.549-2.193
0,793
Негативная
. положительный
лимфатической инвазии
1.394
0.805-2.413
0,235
Ly0 и ly1 против
. LY2 и ly3
клинической стадии
4.382
1.924-9.978
&ЛТ; 0,001
I, II, и III против
. IV
Обсуждение
P-Smads2 является основным шагом и внутриклеточная сигнализация эффектор для посредничества внутриклеточного сигнализации TGF-beta [1]. В опухолях ранней стадии TGF-beta действует как подавитель опухоли, в то время как в развитых опухолях она становится онкогенными фактором. Из-за двойной роли в онкогенеза TGF-beta, в зависимости от типа и стадии опухоли, мы сосредоточили наше исследование на п-Smad2 экспрессии на продвинутой стадии рака желудка. P-Smad2 уровни экспрессии раковых клеток были высокими в 63 (47%) из 135 желудочных карцином, предполагая, что некоторые виды желудочных карцином были сильно пострадавших от TGF-beta. В настоящем исследовании, п-Smad2 экспрессии в опухолевых клетках была достоверно выше в опухолях диффузного типа и в случаях с перитонеального метастазирования, свободных перитонеального раковых клеток и метастазов в лимфатических узлах. Кроме того, высокий уровень экспрессии р-Smad2 предсказал плохое выживание. Эти данные позволяют предположить, что р-Smad2 связан с злокачественного фенотипа и представляет собой молекулярный биомаркером исхода заболевания в поздних стадиях рака желудка.
Уровни экспрессии P-SMAD2 раковых клеток были высокими в диффузного типа рака желудка также известный как скиррозных типа , Есть два типа рака желудка: диффузные типа и кишечного типа, согласно классификации Lauren [17]. Характерные клинические признаки рака желудка диффузного типа, диффузно инфильтрации тип рака желудка, включают в себя высокую частоту метастазирования к LNs [18-20] и к брюшине [21-23]. Уровень экспрессии TGF-beta в скиррозных карциномы желудка была связана с плохим прогнозом [24]. Опухолевые клетки в скиррозных карциномы производят больше, чем не TGF-beta-скиррозных карциномы [25, 26]. TGF-beta сигналы могут играть важную роль для метастазирования раковых клеток, таких как миграция, и инвазии, как сообщалось ранее [2, 11, 27]. На самом деле, Сверхэкспрессия Smad2 был связан с метастазированием, и коррелирует с плохим прогнозом опухоли желудка особенно диффузного типа рака желудка. сигнализации TGF-beta-Smad2 может иметь важную роль в прогрессировании рака желудка диффузного типа. Активированный уровень Smad2 может быть связано с различными клиническими фенотипа злокачественности между диффузной типа и кишечника типа при раке желудка.
Иммуногистохимическое является хорошим методом выбора для оценки экспрессии белка в определенной ткани, так как она можно различать типы клеток окрашивали, а также количество клеток и интенсивность иммуногистохимического окрашенном. Оба анализа должны быть объединены, и это было сделано. Аллед бальная система оценивает сочетание интенсивности и пропорции, потенциально увеличивая прогностическую ценность анализа одной только интенсивности или только доли в данном исследовании. считались Аллед десятки 7-8 подходит для выявления агрессивных поздних стадий рака желудка. Аллед бальная система для экспрессии р-Smad2 может быть пригодным для точной оценки р-Smad2-экспрессирующие опухолевые клетки, и может быть адекватным для прогнозирования исхода у пациентов с раком желудка. P-Smad2 окрашивание оценивали при инвазии перед раком желудка. Р-Smad2 выражение в ядрах раковых клеток непрерывно исследовали с серозной на слизистую оболочку под микроскопом. Мало разность р-Smad2 окрашивания была обнаружена между инфильтративных передних и поверхностных поражений в одних и тех же случаях. И, опухолевые клетки в вторгшегося фронте могли бы сыграть важную роль для отдаленных метастазов. Таким образом, п-Smad2 экспрессию опухолевых клеток оценивали на вторгающейся фронте.
Так как активированный Smad2 ассоциировалось с злокачественного фенотипа рака желудка, то возможно, что ингибирование р-Smad2 сигнализации в раке желудка может дать полезным эффекты путем ингибирования инвазии и метастазирования рака. Несмотря на то, путь TGF-beta в настоящее время оценивается как терапевтической мишени при раке желудка [28, 29], сложные роли в TGF-beta прогрессии опухоли может сделать это трудно выбрать пациентов, которые выиграют от терапии анти-TGF-beta. Определение экспрессии р-Smad2 по балльной системе Оллред может улучшить отбор пациентов и развитие успешных целевых терапии, хотя это будет необходимо подтвердить, что счет р-Smad2 Оллред также обеспечивает значительную прогностическую силу для больных раком желудка в проспективном исследование.
Заключение
P-Smad2-видимому, играет решающую роль в поздних стадий рака желудка и может быть полезным прогностическим маркером плохого прогноза.
Заявления
Благодарности
Мы благодарим Масако Shinkawa (Osaka Городской университет Высшая школа медицины) для оказания технической помощи.
авторов оригинальные представленные файлы для изображений изображения Ниже приведены ссылки на авторов оригинала, представленных файлов для изображений. 'Исходный файл для фигурного 1 12885_2010_2451_MOESM2_ESM.jpeg Авторского 12885_2010_2451_MOESM1_ESM.pdf авторов исходного файла для фигуры 2 конкурирующими интересами
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

• Оценка платных-подобный рецептор 4 Asp299Gly, Thr399Ile и интерлейкина-8 -251 полиморфизмы в риске для развития дистально…
• Растворимый Fas может служить в качестве диагностического инструмента для аденокарциномы желудка