Fosforilada Smad2 em estágio avançado gástrica Carcinoma

Fosforilada Smad2 em estágio avançado gástrica Carcinoma da arte abstracta
Fundo
sinalização do receptor de fator de crescimento transformador β (TGF) está intimamente associada com a capacidade de invasão das células cancerosas gástricas. Embora sinal de Smad é uma integradora crítica de sistemas de transdução receptor TGF sinalização, não se sabe muito sobre o papel da expressão Smad2 no carcinoma gástrico. O objetivo do estudo é o de esclarecer o papel do Smad2 fosforilada (p-Smad2) em adenocarcinomas gástricos em estágios avançados.
Métodos
coloração imuno-histoquímica com anti-p-Smad2 foi realizada em espécimes embebidos em parafina de 135 pacientes com adenocarcinoma gástrico avançado. Avaliamos também a relação entre os níveis de p-Smad2 e características clínico-patológicas de pacientes com adenocarcinoma gástrico expressão.
Resultados
O nível de expressão de p-Smad2 foi elevada em 63 (47%) de 135 carcinomas gástricos. O nível de expressão de p-Smad2 foi significativamente mais elevada no carcinoma tipo difuso (p = 0,007), tumores com metástases peritoneais (p = 0,017), e tumores com metástases nos linfonodos (p = 0,047). O prognóstico para pacientes p-Smad2-alta foi significativamente (p = 0,035, log-rank) mais pobre do que a de pacientes p-Smad2-baixas, enquanto uma análise multivariada revelou que a expressão p-Smad2 não foi um fator prognóstico independência.
Conclusão
A expressão de p-Smad2 está associada com o fenótipo maligno e mau prognóstico em pacientes com carcinoma gástrico avançado.
Fundo
Transformando β do fator de crescimento (TGF) é uma citocina multifuncional e uma das vias mais importantes para as células cancerosas [1, 2]. TGF liga-se a dois receptores diferentes de serina /treonina-cinase (TβR), denominado tipo I e tipo II. O tipo TβR activado I quinase fosforila Smad2 e Smad3. Smad2 fosforilado (p-Smad2) e p-Smad3 são oligomerizados com Smad4, migre para o núcleo e regular a transcrição [1, 3]. Nas células epiteliais normais, o TGF-p é um inibidor potente da proliferação, e tem sido considerado um supressor de tumor. Embora o TGF-p actua como um supressor tumoral em tumores em fase precoce, durante a progressão do tumor a função antiproliferativa TGFp é perdida, e em certos casos, torna-se um factor de TGF-p induzir a proliferação celular oncogénica, invasão, angiogénese e imunossupressão [4, 5]. Tem sido relatado que o TGF-p pode sinalizar não só através de Smad-dependente, mas também as vias independentes de Smad-[6]. Devido aos aspectos duais de TGFp em oncogénese, sinal de Smad pode ser um integrador crítico dos sistemas de transdução de sinalização do receptor de TGF-p, embora o significado da expressão de Smad é ainda controversa. Bruna et ai. 2007 demonstraram que a actividade elevada de TGFp-Smad está presente em gliomas agressivos, altamente proliferativas e confere mau prognóstico em pacientes com glioma de [7], enquanto a falta de expressão de Smad parece estar correlacionada com o desenvolvimento do tumor e mau prognóstico em pacientes com células escamosas do esôfago carcinoma [8] câncer de mama [9] e cancro colorectal [10]. Não se sabe muito sobre o valor prognóstico da expressão Smad2 no carcinoma gástrico, enquanto vários relatórios de níveis séricos de TGF [11, 12] sugeriu que o TGF-p pode induzir a invasão e metástase do carcinoma gástrico. Compreender o significado da Smad2 pode ser útil no câncer gástrico. Neste estudo, portanto, foi investigada a expressão de p-Smad2 do carcinoma gástrico para esclarecer o papel de p-Smad2 em adenocarcinomas gástricos avançados.
Métodos
Pacientes
Nós examinadas amostras cirúrgicas de pacientes na cidade de Osaka Hospital universitário, Osaka, Japão. Um total de 135 pacientes que se submeteram a ressecção de tumores gástricos primários e foram confirmados histologicamente ter câncer gástrico avançado, foram incluídos neste estudo. "O câncer avançado" indica invasão do cancro da muscular própria ou serosa. Nenhum dos pacientes tinham sido submetidos a radioterapia pré-operatória ou quimioterapia. diagnósticos patológicos e classificações seguiu a classificação japonesa de carcinoma gástrico [13]. metástases hepáticas e metástase peritoneal foram examinados na laparotomia. Peritoneal citologia lavagem da cavidade abdominal foi realizada a laparotomia, e células cancerosas esfoliadas foram examinadas microscopicamente. Profundidade de invasão do tumor, diferenciação, metástase linfonodal, invasão venosa e invasão linfática foram baseados em exame microscópico dos materiais obtidos através de ressecção cirúrgica. A classificação histológica foi baseado no padrão predominante de tumor. Os subtipos histológicos foram: adenocarcinoma papilar, adenocarcinoma tubular bem diferenciado e adenocarcinoma tubular moderadamente diferenciado, considerado intestinal-tipo. Os subtipos foram: adenocarcinoma sólida mal diferenciadas, adenocarcinoma não sólida mal diferenciado, carcinoma de células em anel de sinete e carcinoma mucinoso, considerada difusa do tipo. metástase ganglionar foi decidida com linfonodos regionais metástase. Os gânglios linfáticos regionais do estômago são classificados em três estações numerados tal como descrito na classificação japonesa [13] que, dependendo da localização do tumor primário. Como o número de aumento, indicou que se espalhou para os gânglios linfáticos distantes. O protocolo do estudo conformado com as diretrizes éticas da Declaração de Helsinki (1975). Este estudo foi aprovado pelo comitê de ética Osaka City University. O consentimento informado foi obtido de todos os pacientes antes da entrada
técnicas de imuno-histoquímica
Todos os H &. diapositivos E-manchados dos espécimes cirúrgicos foram revisados, ea seção representante do tumor, que incluiu o local da mais profunda invasão foi selecionado para o estudo imunohistoquímico
Um anticorpo policlonal de coelho P-Smad2 anti-humano (Chemicon International, Themecula, cerca de 1: 2000). foi utilizado para a detecção de p-Smad2. Os métodos para a coloração imuno-histoquímica da P-Smad2 foram descritos nas instruções do fabricante. Resumidamente, as lâminas foram desparafinadas, e foram aquecidas durante 20 min a 105 ° C em autoclave no alvo Retrieval Solution (Dako, Carpinteria, CA). As secções foram então incubadas com peróxido de hidrogénio a 3% para bloquear a actividade da peroxidase endógena. As amostras foram incubadas com anticorpo P-Smad2 (1: 2000) durante a noite a 4 ° C. As secções foram incubadas com biotinilado de cabra anti-coelho, imunoglobulina G, durante 30 min, seguido de três lavagens com PBS. Os slides foram tratados com o reagente estreptavidina-peroxidase, e foram incubadas em PBS diaminobenzidina e 1% de peróxido de hidrogénio v /v, seguido de contracoloração com hematoxilina de Mayer. Nós relatado anteriormente o nível de expressão de p-Smad2 em linhas celulares de cancro gástrico [14]. A omissão do anticorpo primário serviram como controlos negativos.
Determinação imuno-histoquímica da P-Smad2
P-Smad2 de coloração foi avaliado na frente invasão de cancros gástricos. Ambos hematoxilina e eosina foram usados ​​como um slide de referência para selecionar áreas do cancro em frente ao invasor. A existência de células cancerosas foi continuamente examinada a partir da serosa à mucosa sob um microscópio. A frente invasora foi determinada a lesão onde as células cancerosas foram encontrados primeiramente do lado da serosa. P-Smad2 coloração era evidente nos núcleos das células cancerosas. A percentagem de células imunopositivas p-Smad2 foi determinada por contagem de 3 áreas escolhidas aleatoriamente no tecido em um total de 300 núcleos de células cancerosas. A avaliação foi feita por dois observadores independentes duplo-cego que desconheciam os dados clínicos e diagnósticos histológicos. Foi também determinada a percentagem de células coradas núcleo de p-Smad2. Houve 15 (11%) casos de uma avaliação discrepantes entre os dois observadores independentes. Nesses casos, nós reverificados e discutido e o resultado final foi obtido por consenso.
Coloração foi registados com o sistema de pontuação Allred, como descrito anteriormente [15]. Para a análise semi-quantitativa de p-Smad2 imuno-reactividade, a intensidade de coloração e a percentagem de células coradas de tumor foram avaliadas em alto poder representativo (x 400) e os campos de baixa potência (× 200) usando microscopia óptica: intensidade foi marcado 0-3 (0 = nenhuma imunorreactividade, 1 = fraco 2 = moderado e 3 = intensa imunorreactividade) e a proporção foi pontuado de 0-5 (0 = 0%; 1 = 1-20%; 2 = 21-40%; 3 = 41-60%; 4 = 61-80%; 5 = 81-100%). As duas pontuações foram então adicionados para obter o resultado final de 0-8. A pontuação média de todos os casos foi 6,07. Em seguida, o ponto de corte foi determinado 6; expressão p-Smad2 foi considerada alta expressão quando escores foram ≥7 e baixa expressão quando escores foram < 7.
análise estatística
Análises comparativas dos dados foram realizadas utilizando o teste do qui-quadrado ou teste exato de Fisher. As durações de sobrevivência foram calculadas pelo método de Kaplan-Meier e analisadas pelo teste de log-rank para comparar as durações de sobrevivência cumulativos nos grupos de pacientes. Cox de riscos proporcionais de regressão foi utilizada para calcular os rácios perigos uni e multivariada dos parâmetros estudados. Um valor de p inferior a 0,05 foi definida como sendo estatisticamente significativo. SPSS 10.0 (SPSS Japão, Tóquio, Japão) foi utilizado para as análises.
Resultados
Relação entre características clínicas e expressão de fosfo-Smad2
Phospho-Smad2 foi imunolocalizada principalmente nos núcleos das células cancerosas (Figura 1A). A intensidade de coloração e a percentagem de células de tumor coradas foram variável. Em relação à intensidade, marcar 0 foi encontrado em nenhum caso (0%), marcar 1 em 55 casos (41%), marcar 2 em 33 casos (24%), e marcar 3 em 47 (35%) casos. Após a avaliação das percentagens de células positivas, marcar 0 foi encontrado em nenhum caso (0%), escore 1 em 2 casos (1%), marcar 2 em 11 casos (8%), marcar 3 em 16 casos (12%), pontuação 4 em 43 casos (32%), e marcar 5 em 63 casos (47%). As contagens totais Allred variou de 2 a 8. O nível de expressão elevado de p-Smad2 foi encontrada em 63 (47%) de 135 carcinomas gástricos. As relações entre a expressão de P-Smad2 e características clinicopatológicas dos tumores são mostrados na Tabela 1. nível de expressão P-Smad2 foi significativamente elevada no carcinoma tipo difuso (p = 0,011) e significativamente correlacionada com a metástase peritoneal (p = 0,017), nódulo linfático metástase pela classificação japonesa [13] ou classificação UICC [16] (p = 0,047, p = 0,004) e citologia peritoneal (p = 0,026). "Citologia peritoneal" significa citologia lavagem peritoneal na laparotomia como um método padrão para a detecção de células tumorais livres e um bom preditor de recorrência peritoneal no cancro gástrico. Em 12 casos, a citologia peritoneal não foi realizada. Em seguida, o número total de citologia peritoneal foi de 123 casos. Não houve associação estatisticamente significativa entre a expressão de fosfo-Smad2 e ou metástase hepática, invasão venosa ou invasão linfática. O número de nodos linfáticos metastáticos no grupo de alto expressão (mediana = 12,3) foi significativamente (p = 0,002) maior do que no grupo de baixa expressão (mediana = 5,77), ao passo que não houve diferença no número de nódulos linfáticos afectados foi mostrado entre low-p-Smad2 grupos (mediana = 41,1) e grupos de Smad2 de alta p (mediana = 44,4). A Figura 1 (A), a determinação imuno-histoquímica da P-Smad2. P-Smad2 foi encontrado no núcleo das células cancerosas. A pontuação da intensidade de coloração imunorreactiva p-Smad2 em células de tumor foi avaliada usando os controlos positivos e negativos. Pontuação 3 significa alta intensidade como o mesmo que o controlo positivo. Imunoreatividade, marcar 1 = fraco, marcar 2 = moderado, e marcar 3 = intensa. (400x). (B), a sobrevivência global dos doentes, com base na expressão da P-Smad2. A curva de sobrevivência de Kaplan-Meier demonstra a sobrevivência geral, em relação à expressão de p-Smad2 em 135 pacientes com carcinoma gástrico. Observou-se uma diferença estatisticamente significativa na sobrevivência entre as altas grupos p-Smad2 e baixos grupos p-Smad2 (p = 0,035; log-rank,).
Tabela 1 Relações entre p-Smad2 e características clínico-patológicas em 135 o câncer gástrico casos.
Parâmetro
P-Smad2
p
-Value


alta (n = 63)
Low (n = 72)

Sexo Masculino

39 ( 41,9%)
54 (58,1%)
NS
Feminino
24 (57,1%)
18 (42,9%)
morfológica recurso +
Tipo 1

• A avaliação do receptor de tipo Toll 4 Asp299Gly, Thr399Ile e -251 polimorfismos no risco para o desenvolvimento de Avaliação distai cancer
• Fas solúvel pode servir como uma ferramenta de diagnóstico para adenocarcinoma