Fosforilados Smad2 en estadio avanzado gástrico Carcinoma

fosforilados Smad2 en estadio avanzado carcinoma gástrico
Resumen Antecedentes

señalización del receptor de factor de crecimiento transformante β (TGF) está estrechamente relacionada con la capacidad de invasión de células de cáncer gástrico. Aunque la señal Smad es un integrador de sistemas de transducción crítica de señalización del receptor de TGF, no se sabe mucho sobre el papel de Smad2 expresión en el carcinoma gástrico. El objetivo del presente estudio es aclarar el papel de Smad2 fosforilados (p-Smad2) en los adenocarcinomas gástricos en etapas avanzadas.
Métodos
La tinción inmunohistoquímica con anticuerpos anti-p-Smad2 se realizó en muestras incluidas en parafina de 135 pacientes con adenocarcinomas gástricos avanzados. También se evaluó la relación entre los niveles de expresión de p-Smad2 y las características clínico-patológicas de los pacientes con adenocarcinomas gástricos.
Resultados
El nivel de expresión de p-Smad2 fue alta en 63 (47%) de 135 carcinomas gástricos. El nivel de expresión de p-Smad2 fue significativamente mayor en el carcinoma de tipo difuso (p = 0,007), los tumores con metástasis peritoneal (p = 0,017), y los tumores con metástasis en los ganglios linfáticos (p = 0,047). El pronóstico para los pacientes de p-Smad2 de alto fue significativamente (p = 0,035, log-rank) más pobre que la de los pacientes de p-Smad2-bajos, mientras que un análisis multivariado reveló que la expresión de p-Smad2 no era un factor pronóstico independencia.
Conclusión
La expresión de p-Smad2 se asocia con el fenotipo maligno y de mal pronóstico en pacientes con carcinoma gástrico avanzado.
Antecedentes
la transformación del factor de crecimiento β (TGF) es una citoquina multifuncional y una de las vías más importantes para las células del cáncer [1, 2]. TGF se une a dos receptores de serina /treonina quinasa (diferentes TβR), tipo denominado I y tipo II. El tipo I quinasa activada TβR fosforila Smad2 y Smad3. Fosforilada Smad2 (p-Smad2) y p-Smad3 se oligomerizados con Smad4, migran al núcleo y regulan la transcripción [1, 3]. En las células epiteliales normales, TGF es un potente inhibidor de la proliferación, y se ha considerado un supresor de tumor. Aunque TGF actúa como un supresor de tumor en los tumores en fase inicial, durante la progresión tumoral se pierde la función antiproliferativa TGF, y en ciertos casos TGF convierte en un factor oncogénico inducción de la proliferación celular, la invasión, la angiogénesis y la supresión inmune [4, 5]. Se ha informado de que TGF puede indicar no sólo a través de Smad-dependiente, sino también las vías de Smad-independientes [6]. Debido a los aspectos duales de TGFß en la oncogénesis, la señal Smad podría ser un integrador crítica de sistemas de transducción de señalización del receptor de TGF, aunque el significado de la expresión Smad sigue siendo controvertido. Bruna et al. 2007 demostraron que la actividad TGF-Smad alta está presente en los gliomas agresivos, altamente proliferativas y confiere un mal pronóstico en pacientes con glioma [7], mientras que la falta de expresión de Smad parece estar correlacionada con el desarrollo tumoral y mal pronóstico en pacientes con células escamosas de esófago carcinoma [8] cáncer de mama [9] y el cáncer de colon [10]. No se sabe mucho sobre el valor pronóstico de la expresión Smad2 en el carcinoma gástrico, mientras que varios informes de los niveles séricos de TGF [11, 12] sugiere que TGF puede inducir la invasión y la metástasis del carcinoma gástrico. La comprensión de la importancia de Smad2 podría ser útil en el cáncer gástrico. En este estudio, por lo tanto, se determinó la expresión de p-Smad2 del carcinoma gástrico para aclarar el papel de p-Smad2 en los adenocarcinomas gástricos avanzados.
Métodos Los pacientes

Hemos examinado muestras de pacientes quirúrgicos en la ciudad de Osaka hospital de la Universidad de Osaka, Japón. Un total de 135 pacientes que habían sido sometidos a resección de tumores gástricos primarios y fueron confirmados histológicamente a tener cáncer gástrico avanzado, se inscribieron en este estudio. "El cáncer avanzado" indica el cáncer de invasión de la muscular propia o serosa. Ninguno de los pacientes había sufrido la radiación o la quimioterapia preoperatoria. diagnósticos patológicos y clasificaciones siguieron la clasificación japonesa de carcinoma gástrico [13]. metástasis hepática y la metástasis peritoneal se examinaron en la laparotomía. Peritoneal citología de lavado de la cavidad abdominal se realizó en la laparotomía, y se examinaron microscópicamente las células cancerosas exfoliadas. La profundidad de la invasión tumoral, la diferenciación, la metástasis en los ganglios linfáticos, invasión venosa y linfática se basa en el examen microscópico de los materiales obtenidos mediante la resección quirúrgica. La clasificación histológica se basó en el patrón predominante de tumor. Los subtipos histológicos fueron: adenocarcinoma papilar, adenocarcinoma tubular bien diferenciado y el adenocarcinoma moderadamente diferenciado tubular-, considerado como de tipo intestinal. Los subtipos fueron: adenocarcinoma sólido pobremente diferenciado, adenocarcinoma no sólido pobremente diferenciado, carcinoma de células en anillo de sello y el carcinoma mucinoso, considerado como de tipo difuso. metástasis en ganglios linfáticos se decidió sobre la metástasis de los ganglios linfáticos regionales. Los ganglios linfáticos regionales del estómago se clasifican en tres estaciones numeradas como se describe en la clasificación japonesa [13] que, dependiendo de la localización del tumor primario. A medida que el número de aumento, indicó que la propagación a los ganglios linfáticos distantes. El protocolo de estudio se ajusta a las directrices éticas de la Declaración de Helsinki (1975). Este estudio fue aprobado por el comité de ética de la Universidad de Osaka City. El consentimiento informado se obtuvo de todos los pacientes antes de la entrada
técnicas inmunohistoquímicas
Todos los H &. Se revisaron las diapositivas E-manchado de las piezas quirúrgicas, y se seleccionó la sección representativa del tumor que incluye el sitio de la invasión más profunda para el estudio inmunohistoquímico
Un anticuerpo policlonal de conejo P-Smad2 anti-humano (Chemicon International, Themecula, CA. 1: 2000). se utilizó para detectar p-Smad2. Los métodos para tinción inmunohistoquímica de p-Smad2 se han descrito en las instrucciones del fabricante. En resumen, los portaobjetos se desparafinaron, y se calentaron durante 20 min a 105 ° C por autoclave en Target Retrieval Solution (Dako, Carpinteria, CA). Las secciones fueron incubadas con peróxido de hidrógeno al 3% para bloquear la actividad peroxidasa endógena. Las muestras se incubaron con anticuerpo de p-Smad2 (1: 2000) durante la noche a 4 ° C. Las secciones fueron incubadas con biotina de cabra anti-inmunoglobulina de conejo G durante 30 min, seguido de tres lavados con PBS. Los portaobjetos se tratan con reactivo de estreptavidina-peroxidasa, y se incubaron en PBS diaminobencidina y 1% de peróxido de hidrógeno v /v, seguido de contratinción con hematoxilina de Mayer. Hemos informado anteriormente el nivel de expresión de p-Smad2 en líneas celulares de cáncer gástrico [14]. La omisión del anticuerpo primario sirvieron como controles negativos.
Determinación inmunohistoquímica de p-Smad2
tinción P-Smad2 se evaluó en el frente de invasión de los cánceres gástricos. Tanto hematoxilina y eosina se utilizaron como un portaobjetos de referencia para seleccionar áreas cancerosas en la parte delantera invasor. La existencia de células cancerosas se examinó continuamente de la serosa a la mucosa con un microscopio. El frente invasor se determinó a la lesión en los que se encontraron por primera vez las células cancerosas de un lado de la serosa. P-Smad2 tinción era evidente en los núcleos de las células cancerosas. El porcentaje de células inmunopositivas p-Smad2 se determinó contando 3 áreas elegidas al azar en el tejido en un total de 300 núcleos de las células cancerosas. La evaluación se hizo por dos observadores independientes, doble ciego que no tenían conocimiento de los datos clínicos y diagnósticos histológicos. También se determinó el porcentaje de células teñidas núcleo de p-Smad2. Hubo 15 (11%) casos de una evaluación de discrepancia entre los dos observadores independientes. En esos casos, Revisamos y discutimos y la puntuación final se obtuvo por consenso.
Tinción fue calificado usando el sistema de puntuación Allred como se describe anteriormente [15]. Por semi-cuantitativa análisis de p-Smad2 inmuno-reactividad, la intensidad de la tinción y el porcentaje de células teñidas de tumor fueron evaluados en alta potencia representante (× 400) y los campos de baja potencia (× 200) mediante microscopía óptica: se obtuvo intensidad 0-3 (0 = no inmunoreactividad, 1 = débil, 2 = moderado y 3 = intensa inmunorreactividad) y la proporción se anotó 0-5 (0 = 0%; 1 = 1 a 20%; 2 = 21 a 40%; 3 = 41-60%; 4 = 61-80%; 5 = 81-100%). A continuación se añadieron las dos puntuaciones para obtener el resultado final de 0-8. La puntuación media de todos los casos fue de 6,07. A continuación, se determinó el punto de corte 6; la expresión de p-Smad2 se considera alta expresión cuando las puntuaciones fueron ≥7 y baja expresión cuando las puntuaciones fueron. < 7 El análisis estadístico comparativo
análisis de los datos se realizaron mediante la prueba de Chi-cuadrado o la prueba exacta de Fisher. Las duraciones de supervivencia se calcularon utilizando el método de Kaplan-Meier y se analizaron mediante la prueba de log-rank para comparar las duraciones de supervivencia acumulada en los grupos de pacientes. Cox de riesgos proporcionales de regresión se utilizó para calcular las razones de riesgos univariante y multivariante de los parámetros del estudio. Un valor de p de menos de 0,05 se definió como siendo estadísticamente significativa. Se utilizó el software SPSS 10.0 (SPSS Japón, Tokio, Japón) para los análisis.
Resultados
relación entre las características clínico-patológicos y la expresión de fosfato Smad2
fosfato Smad2 se immunolocalized principalmente en los núcleos de las células cancerosas (Figura 1A). La intensidad de la tinción y el porcentaje de células tumorales fueron teñidas variable. En cuanto a la intensidad, y marcó el 0 se encontró en ningún caso (0%), la puntuación de 1 en 55 casos (41%), la puntuación de 2 de cada 33 casos (24%), y la puntuación de 3 en 47 (35%) casos. Tras la evaluación de los porcentajes de células positivas, y marcó el 0 se encontró en ningún caso (0%), la puntuación de 1 en 2 casos (1%), la puntuación de 2 en 11 casos (8%), la puntuación de 3 en 16 casos (12%), la puntuación 4 en 43 casos (32%), y la puntuación de 5 en 63 casos (47%). Las puntuaciones totales Allred varió de 2 a 8. El alto nivel de expresión de p-Smad2 se encontró en 63 (47%) de 135 carcinomas gástricos. Las relaciones entre la expresión de p-Smad2 y características clinicopatológicas de los tumores se muestran en la Tabla 1. El nivel de expresión de P-Smad2 fue significativamente alta en el carcinoma de tipo difuso (p = 0,011) y una correlación significativa con la metástasis peritoneal (p = 0,017), los ganglios linfáticos metástasis por clasificación japonesa [13] o la clasificación de la UICC [16] (p = 0,047, p = 0,004) y la citología peritoneal (p = 0,026). "Citología peritoneal" significa la citología de lavado peritoneal en la laparotomía como método estándar para la detección de células tumorales libres y un predictor útil de recurrencia peritoneal en el cáncer gástrico. En 12 casos, no se realizó la citología peritoneal. Entonces el número total de citología peritoneal fue de 123 casos. No hubo asociación estadísticamente significativa entre la expresión fosfato Smad2 y, o bien la metástasis hepática, invasión venosa o linfática. El número de ganglios linfáticos metastásicos en el grupo de alta expresión (mediana = 12.3) fue significativamente (p = 0,002) mayor que en el grupo de baja expresión (mediana = 5,77), mientras que no hay diferencia en el número de ganglios linfáticos afectados se demostró entre bajo-p-Smad2 grupos (mediana = 41,1) y grupos de Smad2-alta-p (mediana = 44,4). Figura 1 (A), la determinación inmunohistoquímica de p-Smad2. P-Smad2 se encontró en los núcleos de las células cancerosas. La puntuación de la intensidad de la tinción inmunorreactiva p-Smad2 en las células tumorales se evaluó usando los controles positivos y negativos. La puntuación de 3 significa alta intensidad como lo mismo que el control positivo. Inmunoreactividad, la puntuación de 1 = débil, puntuación 2 = moderado, y la puntuación de 3 = intensa. (X400). (B), la supervivencia global de los pacientes en función de la expresión de p-Smad2. La curva de supervivencia de Kaplan-Meier muestra la supervivencia global en relación con la expresión de p-Smad2 en 135 pacientes con carcinoma gástrico. Se observó una diferencia estadísticamente significativa en la supervivencia entre los grupos de alto p-Smad2 y grupos bajos de p-Smad2 (p = 0,035; log-rank,).
Tabla 1 Relaciones entre p-Smad2 y características clínico en 135 cáncer gástrico casos.
Parámetro
P-Smad2
p
-Valor


alta (n = 63) guía empresas bajo (n = 72) guía empresas
Sexo Masculino

39 ( 41,9%)
54 (58,1%)
NS
Mujer
24 (57,1%)
18 (42,9%)
morfológica característica
+ Tipo 1 página 6 ( 37,5%)
10 (62,5%)
0,025
tipo 2 página 14 (35,0%)
26 (65,0%)
Tipo 3
17 (45,9%)
20 (54,1%)
Tipo 4
26 (61,9%)
16 (38,1%)
etapa
2 7 (25,9%) T
20 ( 74,1%)
0,031 página 3
52 (50,0%) guía 52 (50,0%)
4 de 4 (100,0%)
0 (0.00%)
diferenciación
intestinal de tipo
15 (31,2%)
33 (68,8%)
0,011
difuso de tipo
48 (55,2%)
39 (44,8%)
ganglios linfáticos metástasis + gratis (clasificación japonés)
N0 y N1
34 (40,5%)
50 (59,5%)
0,047
N2 y N3
29 (56,9 %)
22 (43,1%)
metástasis de ganglios linfáticos ++ gratis (clasificación UICC)
N0 y N1
31 (36,9%): perfil 53 (63,1%)
0,004
N2 y N3
32 (62,7%) página 19 (37,3%)
hepática metástasis
negativo
62 (47,0%): perfil 70 (53,0%) NS

positivo 1 (33,3%) página 2 (66,7%)
metástasis peritoneal
negativo
48 (42,1%): perfil 66 (57,9%)
0,017
positivo
15 (71,4%): perfil 6 (28,6%)
peritoneal citología negativa +++

36 (40,4%): perfil 53 (59,6%)
0,026
positivo
22 (64,7%) página 12 (35,3%)
linfático invasión
Ly0 y ly1
26 (40,6%)
38 (59,4%)
NS
Ly2 y LY3
37 (52,1%)
34 (47,9%)
invasión venosa
negativo
50 (45,5%)
60 (54,5%) NS

positiva página 13 (52,0%) página 12 (48,0%)
estadio clínico I
página 2 (22,2%) página 7 (77,8%)
0,022
Segunda
15 (39,5%): perfil 23 (60,5%)
III
18 (40,0%): perfil 27 (60,0%)
IV
28 (68,7% ): perfil 15 (31,3%)
+, Clasificación de acuerdo con las Reglas generales de Estudio de cáncer gástrico de la Sociedad japonesa de Investigación para el cáncer gástrico [13]. Tipo 1 se define como un tumor polipoide; tipo 2 tumor polipoide con ulceración y con márgenes bien delimitadas; Tipo 3 como carcinoma ulcerado con infiltración del cáncer en la pared circundante; Tipo 4 infiltrar difusamente como carcinoma plano en el que la ulceración por lo general no es una característica marcada.
++, etapa nodal fue evaluada por la Union Internationale Contre le Cáncer (UICC) metástasis en los ganglios tumoral (TNM) [16] y por clasificación de acuerdo con las reglas generales para el estudio del cáncer gástrico de la Sociedad japonesa de Investigación para el cáncer gástrico. En la clasificación TNM, el estadio nodal se clasificó de acuerdo con el número de los LN regionales involucradas como sigue: pN0, no LN propagación; pN1, 1 a 6 LN enfermas; pN2, 7-15; y pN3, más de 15. En la clasificación japonesa, etapa nodal se clasificó de acuerdo a la extensión de la LN en positivo N0, N1, N2 y N3 y se considera que refleja la vía anatómica de la extensión linfática. n1 se define como la enfermedad LN regional próximo, y N2 o N3 se definen como distante.
+++, En 12 casos, la citología peritoneal no se va a realizar (en total 123 casos).
fosfato Smad2 se relaciona con mal pronóstico en el cáncer gástrico
en esta serie de cáncer gástrico avanzado, la supervivencia de fosfato Smad2 alto nivel de expresión de los pacientes fue significativamente peor que el de fosfato Smad2 pacientes bajo nivel de expresión (p = 0,035, Figura 1B). En el análisis univariante, la alta expresión fosfato Smad2 (p = 0,048), morfológica de tipo 4 (p < 0,001), los tumores de tipo difuso (p < 0,001), metástasis a los ganglios linfáticos (p < 0,001), metástasis peritoneal (p < 0,001), las células cancerosas libres peritoneal (p < 0,001), invasión linfática (p = 0,006) y el estadio clínico IV (p < 0,001) se asociaron significativamente a la supervivencia de los pacientes pobres (Tabla 2). En el análisis multivariado, morfológica de tipo 4, tumores de tipo difuso y estadio clínico IV eran factores pronósticos estadísticamente independientes, pero fosfato Smad2 no era (Tabla 3) .Tabla 2 El análisis univariante con respecto a la supervivencia global (n = 135).
Parámetro
relación riesgo

intervalo de confianza del 95%
p
-Valor
P-Smad2 expresión
1.650
1,005-2,710 0,048

baja vs
. alta
característica morfológica
5.354
3,199-8,963 Hotel < 0,001
Tipo 1, 2 y 3 vs
. Tipo 4
Diferenciación
3.883
2,020-7,463 Hotel < 0,001
intestinal de tipo vs
. De tipo difuso
metástasis de ganglios linfáticos (clasificación japonés)
3.269
1,978-5,403 Hotel < 0,001
N0 y N1 vs
. diseminación peritoneal N2 y N3
5.534
3,056-8,738 Hotel < 0,001
negativo vs
. citología peritoneal positiva

5,937 3,468 a 10,166
Hotel < 0,001
negativo vs
. positivo
linfático invasión
2.055
1,234-3,421 0,006

Ly0 y ly1 vs
. LY2 y LY3
Estadio clínico
6.901
4,088 a 11,651 Hotel < 0,001
I, II, y III vs
. IV sobre Table 3 El análisis multivariado con respecto a la supervivencia global (n = 135).
Parámetro
Relación riesgo

95 % intervalo de confianza
p
-Valor
P-Smad2 expresión
0,627
0,347-1,133 0,122

baja vs
. alta
característica morfológica
2.325
1,221-4,388 0,010

Tipo 1, 2 y 3 vs
. Tipo 4
Diferenciación
2.807
1,251-6,298 0,012

intestinal de tipo vs
. Difusa de tipo
metástasis de ganglios linfáticos (clasificación japonés)
1.387
0,689-2,794 0,360

N0 y N1 vs
. diseminación peritoneal N2 y N3
1.097
0,549-2,193 0,793

negativo vs
. positivo
linfático invasión
1.394
0,805-2,413 0,235

Ly0 y ly1 vs
. LY2 y LY3
Estadio clínico
4.382
1,924-9,978 Hotel < 0,001
I, II, y III vs
. IV
Discusión
P-Smads2 es un paso principal y el efector de señalización intracelular para la mediación de la señalización intracelular de TGF [1]. En los tumores en fase inicial TGF actúa como un supresor de tumores, mientras que en los tumores avanzados se convierte en un factor oncogénico. Debido a la doble función de TGF en la oncogénesis, dependiendo del tipo y el estadio del tumor, nos hemos centrado nuestro estudio sobre la expresión de p-Smad2 en la etapa avanzada de cáncer gástrico. P-Smad2 niveles de expresión de células de cáncer fueron altas en 63 (47%) de 135 carcinomas gástricos, lo que sugiere que algunos tipos de carcinomas gástricos fueron fuertemente afectados por TGF. En el presente estudio, la expresión de p-Smad2 en las células tumorales fue significativamente mayor en tumores de tipo difuso y en los casos de metástasis peritoneal, las células de cáncer peritoneal libre y la metástasis de los ganglios linfáticos. Por otra parte, el p-Smad2 expresión elevada predice la supervivencia pobre. Estos hallazgos sugieren que p-Smad2 se asocia con el fenotipo maligno y es un biomarcador molecular de evolución de la enfermedad en el cáncer gástrico avanzado.
P-Smad2 niveles de expresión de las células cancerosas fueron altas en carcinoma gástrico de tipo difuso también conocido como un tipo escirro . Hay dos tipos de cáncer gástrico: difusas tipo y el tipo intestinal, según la clasificación de Laurén [17]. Las características clínicas de carcinoma gástrico de tipo difuso, un tipo de forma difusa la infiltración de carcinoma gástrico, incluyen una alta frecuencia de metástasis en el LNS [18-20] y al peritoneo [21-23]. El nivel de expresión de TGF en el carcinoma gástrico escirrosa estaba relacionada con un mal pronóstico [24]. Las células tumorales en el carcinoma escirrosa producen más TGF que el carcinoma no escirrosa [25, 26]. señales de TGF podrían desempeñar un papel importante para la diseminación metastásica de las células cancerosas tales como la migración y la invasión, como se informó anteriormente [2, 11, 27]. De hecho, la sobreexpresión de Smad2 se asoció con metástasis, y se correlaciona con mal pronóstico de los tumores gástricos especialmente de tipo difuso de carcinoma gástrico. la señalización de TGF-Smad2 puede tener un papel importante en la progresión del carcinoma gástrico de tipo difuso. El nivel de Smad2 activado podría estar asociado con el diferente fenotipo clínico de malignidad entre el tipo difuso y de tipo intestinal en el carcinoma gástrico.
Inmunohistoquímica es un buen método de elección para la evaluación de la expresión de la proteína dentro de un tejido particular, ya que es posible distinguir los tipos de células teñidas, así como el número de células y la intensidad de la inmunohistoquímica manchada. Ambos análisis se deben combinar y fue hecho. sistema de puntuación Allred evalúa una combinación de intensidad y proporción, aumentando potencialmente el valor pronóstico del análisis por la intensidad solo o la proporción sola en este estudio. Allred puntuaciones de 7-8 se consideraron adecuados para la identificación del carcinoma gástrico avanzado agresivo. Allred sistema de puntuación para la expresión de p-Smad2 podría ser adecuado para evaluar con precisión las células tumorales p-Smad2 que expresan, y podría ser adecuada para predecir el resultado de los pacientes con cáncer gástrico. tinción de P-Smad2 se evaluó en el frente de invasión de los cánceres gástricos. expresión de P-Smad2 en los núcleos de las células de cáncer se examinó continuamente de la serosa a la mucosa con un microscopio. Se encontró pocas diferencias de tinción p-Smad2 entre lesiones infiltrativas superficie frontal y en los mismos casos. Y, las células tumorales en la parte delantera invasor podrían desempeñar un papel importante para la metástasis distante. Por lo tanto, la expresión de p-Smad2 de las células tumorales se evaluó en la parte delantera invasor.
Desde el Smad2 activada se asocia con el fenotipo maligno del cáncer gástrico, es posible que la inhibición de p-Smad2 de señalización en el carcinoma gástrico puede producir beneficioso efectos a través de la inhibición de la invasión y metástasis de cáncer. Si bien, la vía TGF está siendo evaluado como diana terapéutica en el cáncer gástrico [28, 29], las complejas funciones de TGF en la progresión del tumor podrían hacer difícil la selección de los pacientes que se beneficiarán de una terapia anti-TGF. La determinación de la expresión de p-Smad2 por el sistema de puntuación de Allred podría mejorar la selección de los pacientes y el desarrollo de terapias dirigidas éxito, aunque será necesaria para confirmar que la puntuación de p-Smad2 Allred también proporciona poder pronóstico significativo para pacientes con cáncer gástrico en un estudio prospectivo estudio.
Conclusión
P-Smad2 parece desempeñar un papel crucial en el carcinoma gástrico avanzado y puede ser un marcador pronóstico útil de mal pronóstico.
Declaraciones
Agradecimientos agradecemos
Masako Shinkawa (Osaka City University Graduate School of Medicine) para la asistencia técnica.
los autores originales presentados archivos de imágenes
a continuación se presentan los enlaces a los archivos de los autores presentados original para imágenes. 'archivo original para la figura 1 12885_2010_2451_MOESM2_ESM.jpeg autores 12885_2010_2451_MOESM1_ESM.pdf Autores archivo original para la figura 2 Conflicto de intereses México La autores declaran que no tienen intereses en competencia.

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