Phosphorylated Smad2 im fortgeschrittenen Stadium Magenkarzinom

Phosphorylated Smad2 im fortgeschrittenen Stadium Magenkarzinom
Zusammenfassung
Hintergrund
Transforming growth factor β (TGF) Rezeptor-Signal steht in engem Zusammenhang mit der Invasion Fähigkeit von Magenkrebszellen in Verbindung gebracht. Obwohl Smad Signal ein kritischer Integrator von TGFß Rezeptor-Signalübertragungssysteme ist, wird über die Rolle von Smad2 Expression in Magenkarzinom nicht viel bekannt. Das Ziel der vorliegenden Studie ist es, die Rolle von phosphorylierten Smad2 (p-Smad2) in Magen-Adenokarzinome im fortgeschrittenen Stadium zu klären.
Methods
Immunhistochemische Färbung mit anti-p-Smad2 auf Paraffin eingebettete Proben von 135 durchgeführt wurde, Patienten mit fortgeschrittenem Magen-Adenokarzinome. Wir untersuchten auch die Beziehung zwischen den Expressionsniveaus von p-Smad2 und klinisch-pathologische Merkmale von Patienten mit Magen-Adenokarzinome.
Ergebnisse
Der p-Smad2 Expressionsniveau war hoch in 63 (47%) von 135 Magenkarzinome. Der p-Smad2 Expressionsniveau war signifikant höher als bei diffusen Typ Karzinom (p = 0,007), Tumoren mit Peritonealdialyse Metastasen (p = 0,017) und Tumoren mit Lymphknotenmetastasen (p = 0,047). Die Prognose für die p-Smad2-Hoch Patienten war signifikant (p = 0,035, Log-Rank) schlechter als die von p-Smad2-Low-Patienten, während eine multivariate Analyse ergab, dass p-Smad2 Ausdruck keine Unabhängigkeit prognostischer Faktor war.
Fazit
Die Expression von p-Smad2 mit malignen Phänotyp und einer schlechten Prognose bei Patienten mit fortgeschrittenem Magenkarzinom assoziiert ist.
Hintergrund
Transforming growth factor β (TGF) ist ein multifunktionales Cytokin und einer der wichtigsten Wege für Krebszellen [1, 2]. TGF &bgr; bindet an zwei verschiedenen Serin /Threonin-Kinase-Rezeptoren (TβR), bezeichnet als Typ I und Typ II. Die aktivierte TβR Typ-I-Kinase phosphoryliert Smad2 und Smad3. Phosphoryliertes Smad2 (p-Smad2) und p-Smad3 mit Smad4 oligomerisiert, in Kern migrieren und die Transkription [1, 3] regulieren. In normalen Epithelzellen ist TGFß ein potenter Inhibitor der Proliferation, und es wurde ein Tumorsuppressor betrachtet. Obwohl TGFß Tumorsuppressor wirkt als in Tumoren im Frühstadium, während der Tumorprogression die TGFß antiproliferative Funktion verloren geht, und in bestimmten Fällen wird TGFß eine onkogene Faktor induzierenden Zellproliferation, Invasion, Angiogenese und Immunsuppression [4, 5]. Es wurde berichtet, dass TGF &bgr; kann nicht nur durch Smad abhängiges Signal, sondern auch Smad-unabhängige Wege [6]. Aufgrund der doppelten Aspekte TGFß in Onkogenese könnte Smad Signal ein kritischer Integrator von TGFß Rezeptor-Signalübertragungssystemen, obwohl die Bedeutung des Smad-Expression ist noch umstritten. Bruna et al. 2007 gezeigt, dass hohe TGFß-Smad Aktivität in aggressiven vorhanden ist, hochproliferative Gliome und verleiht einer schlechten Prognose bei Patienten mit Gliomen [7], während ein Mangel an Smad Ausdruck erscheint mit Tumorentwicklung und einer schlechten Prognose bei Patienten mit Plattenepithelkarzinomen des Ösophagus korreliert werden Karzinom [8] Brustkrebs [9] und Darmkrebs [10]. Es ist nicht viel bekannt über den prognostischen Wert der Smad2 Expression in Magenkarzinom, während mehrere Berichte über die Serumspiegel von TGFß [11, 12] vorgeschlagen, dass TGFß Invasion und Metastasierung in Magenkarzinom induzieren kann. die Bedeutung von Smad2 Verständnis könnte bei Magenkrebs nützlich sein. In dieser Studie untersuchten wir daher die p-Smad2 Expression von Magenkarzinom die Rolle von p-Smad2 in fortgeschrittenen Magen-Adenokarzinome zu klären.
Methoden
Patienten kaufen Wir chirurgischen Proben von Patienten an der Osaka City geprüft University Hospital, Osaka, Japan. Insgesamt 135 Patienten, die Resektion von primären Tumoren des Magens unterzogen hatten und wurden histologisch zu haben fortgeschrittenem Magenkrebs bestätigt, wurden in die Studie eingeschlossen. "Advanced Krebs" zeigt an Krebs Invasion der Muscularis propria oder Serosa. Keiner der Patienten hatte eine präoperative Bestrahlung oder Chemotherapie unterzogen. Pathologische Diagnosen und Klassifikationen folgte der japanischen Klassifikation von Magenkarzinom [13]. Lebermetastasen und peritonealer Metastasierung wurden bei Laparotomie untersucht. Peritoneale Lavage Zytologie der Bauchhöhle wurde bei Laparotomie durchgeführt und exfolierten Krebszellen wurden mikroskopisch untersucht. Tiefe der Tumorinvasion, Differenzierung, Lymphknotenmetastasen, venöse Invasion und lymphatische Invasion wurden auf der Grundlage der mikroskopischen Untersuchung von Materialien, die durch chirurgische Resektion erhalten. Die histologische Klassifizierung wurde auf die vorherrschende Muster des Tumors basiert. Die histologischen Subtypen waren: papilläres Adenokarzinom, gut differenzierte Rohr Adenokarzinom und mäßig differenzierten Rohr Adenokarzinom, der als Darm-Typ. Die Subtypen waren: solid schlecht differenzierten Adenokarzinom, nicht festen schlecht differenzierten Adenokarzinom, Siegelringzellkarzinom und muzinöse Karzinom, gilt als diffus-Typ. Lymphknotenmetastasen wurde auf der regionalen Lymphknoten-Metastasen entschieden. Die regionalen Lymphknoten des Magens sind in drei Stationen klassifiziert numeriert, wie in der japanischen Klassifizierung beschrieben [13], die von dem Ort des Primärtumors abhängig. Da die Zahl der Zunahme zeigte es, dass die Ausbreitung in entfernte Lymphknoten. Das Studienprotokoll angepasst an die ethischen Richtlinien der Deklaration von Helsinki (1975). Diese Studie wurde von der Osaka City University Ethikkommission genehmigt. Eine Einverständniserklärung wurde von allen Patienten vor dem Eintritt erhalten
immunhistochemischen Techniken
Alle H &. E-gefärbten Folien der chirurgischen Proben wurden überprüft, und die repräsentativen Abschnitt des Tumors, die den Ort der tiefsten Invasion aufgenommen wurde ausgewählt für die immunhistochemischen Studie TÜV polyklonalen Kaninchen-Anti-Human-P-Smad2-Antikörper (Chemicon international, Themecula, CA. 1: 2000). wurde verwendet, p-Smad2 zu erkennen. Die Methoden für immunhistochemische Färbung von p-Smad2 wurden in den Anweisungen des Herstellers beschrieben ist. Kurz gesagt, wurden die Objektträger entparaffiniert, und wurden für 20 min bei 105 ° C im Autoklaven in Target Retrieval Solution (Dako, Carpinteria, CA) erhitzt. Die Schnitte wurden dann mit 3% Wasserstoffperoxid inkubiert endogene Peroxidase-Aktivität zu blockieren. über Nacht bei 4 ° C: Die Proben wurden mit p-Smad2 Antikörper (2,000 1) inkubiert. Die Schnitte wurden mit biotinyliertem Ziege-anti-Kaninchen-Immunglobulin G für 30 min, gefolgt von drei Waschungen mit PBS inkubiert. Die Objektträger wurden mit Streptavidin-Peroxidase-Reagens behandelt und wurden in PBS 1% Diaminobenzidin und Wasserstoffperoxid v /v, gefolgt von einer Gegenfärbung mit Hämatoxylin Mayers inkubiert. Wir bereits berichtet, das Expressionsniveau von p-Smad2 in Magenkrebs-Zelllinien [14]. Das Weglassen der primären Antikörper dienten als negative Kontrollen.
Immunhistochemische Bestimmung von p-Smad2
P-Smad2 Färbung an der Invasionsfront von Magenkrebs wurde ausgewertet. Sowohl Hämatoxylin und Eosin-Färbung wurden als Referenz Folie auszuwählen Krebsbereiche an der Invasions Front eingesetzt. Das Vorhandensein von Krebszellen wurde kontinuierlich aus dem serosa auf die Schleimhaut unter einem Mikroskop untersucht. Die eindringenden Front wurde an der Läsion bestimmt, in denen Krebszellen wurden zuerst von Serosaseite gefunden. P-Smad2 Färbung war in den Zellkernen von Krebszellen offensichtlich. Der prozentuale Anteil der p-Smad2 immunopositive Zellen wurde zufällig in dem Gewebe in insgesamt 300 Kerne von Krebszellen, ausgewählt durch Zählen 3 Bereiche bestimmt. Die Auswertung erfolgte durch zwei doppelt verblindete unabhängige Beobachter gemacht, die nichts von klinischen Daten und histologische Diagnosen waren. Der Prozentsatz der Kern gefärbten Zellen für p-Smad2 wurde ebenfalls bestimmt. Es wurden 15 (11%) Fälle einer unstimmigen Auswertung zwischen den beiden unabhängigen Beobachtern. In diesen Fällen nachgeprüft wir und diskutiert und das Endergebnis wurde durch Konsens erzielt.
Färbung erzielt wurde das Allred Scoring-System verwendet, wie zuvor beschrieben [15]. Für semi-quantitative Analyse von p-Smad2 Immunreaktivität, die Intensität der Anfärbung und der Prozentsatz der Tumor gefärbten Zellen wurden in repräsentativen hoher Leistung (× 400) und Niederleistungsfeldern (× 200) unter Verwendung optischer Mikroskopie beurteilt: Intensität erzielt wurde 0-3 (0 = keine Immunreaktivität, 1 = schwach, 2 = mittel, 3 = starke Immunreaktivität) und Anteil wurde 0-5 (0 = 0% erzielt; 1 = 1-20%; 2 = 21-40%; 3 = 41-60%; 4 = 61-80%, 5 = 81-100%). Die beiden Werte wurden dann hinzugefügt, um das Endergebnis von 0-8 zu erhalten. Die mittlere Punktzahl aller Fälle war 6,07. Dann wurde der Cut-off-Punkt 6 bestimmt; p-Smad2 Expression wurde eine hohe Expression betrachtet, wenn Werte waren ≥7 und niedrige Expression, wenn Werte waren. < 7
statistische Analyse
Vergleichende Analysen der Daten wurden mit dem Chi-Quadrat-Test oder Fisher-Test durchgeführt. Die Überlebensdauern wurden berechnet, um die Kaplan-Meier-Methode und durch die Log-Rank-Test analysiert, um die Gesamtüberlebensdauer in den Patientengruppen zu vergleichen. Cox Proportional-Hazards-Regression wurde verwendet, eindimensionale und mehrdimensionale Gefahren-Verhältnisse für die Studienparameter zu berechnen. Ein p-Wert von weniger als 0,05 wurde als statistisch signifikant definiert. SPSS 10.0 Software (SPSS Japan, Tokyo, Japan) wurde für die Analysen verwendet.
Ergebnisse
Beziehung zwischen klinisch-pathologischen Merkmale und Phospho-Smad2 Expression
Phospho-Smad2 hauptsächlich in den Kernen von Krebszellen immunolocalized wurde (Abbildung 1A). Die Intensität der Anfärbung und der Prozentsatz der gefärbten Tumorzellen waren variabel. In Bezug auf Intensität, wurde in keinem Fall (0%), erzielt 1 in 55 Fällen (41%), Note 2 in 33 Fällen (24%), und Note 3 in 47 (35%) Fällen Score 0 gefunden. Bei der Auswertung der positiven Zellprozent wurde Score 0 in keinem Fall gefunden (0%), erzielt 1 in 2 Fällen (1%), 2 in 11 Fällen ein Tor (8%), Note 3 in 16 Fällen (12%), Partitur 4 in 43 Fällen (32%), und Note 5 in 63 Fällen (47%). Die Gesamt Allred Noten von 2 bis 8. Die hohe Expression von p-Smad2 variiert wurde in 63 (47%) von 135 Magenkarzinome gefunden. Die Beziehungen zwischen p-Smad2 Expression und klinisch-pathologischen Eigenschaften der Tumore sind in Tabelle 1 P-Smad2 Expressionsniveau gezeigt war signifikant hoch in diffuser Art Karzinom (p = 0,011) und signifikant mit peritonealen Metastasierung (p = 0,017) korrelierten, Lymphknoten Metastasierung von japanischen Klassifikation [13] oder UICC Klassifikation [16] (p = 0,047, p = 0,004) und Peritonealdialyse Zytologie (p = 0,026). "Peritoneal Zytologie" bedeutet Peritonealspülung Zytologie bei Laparotomie als Standardmethode zum Nachweis von freien Tumorzellen und einen nützlichen Indikator für die Peritonealdialyse Wiederholung bei Magenkrebs. In 12 Fällen wurde die Peritonealdialyse Zytologie nicht durchgeführt. Dann wird die Gesamtzahl der peritonealen Zytologie betrug 123 Fälle. Es gab keinen statistisch signifikanten Zusammenhang zwischen dem Phospho-Smad2 Expression und entweder Lebermetastasen, venöse Invasion oder lymphatische Invasion. Die Zahl der metastatischen Lymphknoten in hoher Expressions Gruppe (Median = 12,3) war signifikant (p = 0,002) höher als die in Niederexpressions Gruppe (Median = 5,77), während kein Unterschied der Anzahl der betroffenen Lymphknoten zwischen wurde gezeigt, Low-p-Smad2 Gruppen (Median = 41,1) und High-p-Smad2 Gruppen (Median = 44,4). Figur 1 (A), Immunhistochemische Bestimmung von p-Smad2. P-Smad2 wurde in den Zellkernen von Krebszellen gefunden. Die Immunreaktive Intensitätsbilanz von p-Smad2 Färbung in Tumorzellen wurde unter Verwendung der positiven und negativen Kontrollen ausgewertet. Note 3 mit hoher Intensität die gleiche wie die positive Kontrolle bedeutet. Immunreaktivität, erzielt 1 = schwach, Note 2 = mittel, 3 = stark punkten. (X 400). (B) die Gesamtüberlebenszeit von Patienten, basierend auf p-Smad2 Expression. Die Kaplan-Meier-Überlebenskurve zeigt die Gesamtüberlebenszeit in bezug auf die p-Smad2 Expression in 135 Patienten mit Magenkarzinom. (; Log-rank, p = 0,035).
Tabelle 1 Die Beziehungen zwischen den p-Smad2 und klinisch-pathologischen Eigenschaften in 135 Magenkrebs Ein statistisch signifikanter Unterschied in der Überlebenszeit wurde zwischen den hohen p-Smad2 Gruppen und niedrige p-Smad2 Gruppen beobachtet Fälle.
Parameter
P-Smad2
p
-Value


hoch (n = 63)
Low (n = 72)

Geschlecht
männlich
39 ( 41,9%)
54 (58,1%)
NS
weiblich
24 (57,1%)
18 (42,9%)
Morphologische Feature +
Typ 1

• Die Beurteilung der Toll-like-Rezeptor 4 Asp299Gly, Thr399Ile und Interleukin-8 -251 Polymorphismen im Risiko für die Entwicklung von distalen Magen cancer
• Lösliche Fas könnte als diagnostisches Werkzeug dienen für Magen-adenocarcinoma