Fosforyleret Smad2 i Advanced Stage Gastric Carcinoma

Fosforyleret Smad2 i Advanced Stage Gastric Carcinoma
Abstract
Baggrund
transformerende vækstfaktor β (TGF) receptor signalering er tæt forbundet med invasionen evne gastriske cancerceller. Selvom Smad signal er et kritisk integrator af TGFp-receptor signaling transduktion systemer, er ikke meget kendt om den rolle, Smad2 ekspression i gastrisk karcinom. Formålet med den aktuelle undersøgelse er at afklare hvilken rolle fosforyleret Smad2 (p-Smad2) i gastrisk adenokarcinomer i fremskredne stadier.
Metoder
immunhistokemisk farvning med anti-p-Smad2 blev udført på paraffinindlejrede prøver fra 135 patienter med fremskredne gastriske adenokarcinomer. Vi evaluerede også forholdet mellem ekspressionsniveauerne af p-Smad2 og clinicopathologic karakteristika af patienter med gastrisk adenokarcinomer.
Resultater
p-Smad2 ekspressionsniveauet var høj i 63 (47%) af 135 gastriske carcinomer. P-Smad2 ekspressionsniveauet var signifikant højere i diffust typen carcinom (p = 0,007), tumorer med peritoneal metastase (p = 0,017), og tumorer med lymfeknudemetastaser (p = 0,047). Prognosen for p-Smad2-høje patienter var signifikant (p = 0,035, log-rank) dårligere end for p-Smad2-lave patienter, mens en multivariat analyse viste, at p-Smad2 udtryk ikke var en uafhængighed prognostisk faktor.
Konklusion
ekspressionen af p-Smad2 er associeret med malign fænotype og dårlig prognose hos patienter med fremskreden gastrisk carcinoma.
Baggrund
transformerende vækstfaktor β (TGFp) er en multifunktionel cytokin og en af de vigtigste veje for kræftceller [1, 2]. TGFp binder til to forskellige serin /threonin kinase receptorer (TβR), betegnet type I og type II. Den aktiverede TβR type I kinase phosphorylerer Smad2 og Smad3. Phosphoryleret Smad2 (p-Smad2) og p-Smad3 er oligomeriseret med Smad4, migrere ind nucleus og regulere transkription [1, 3]. I normale epitelceller, TGFp er en potent inhibitor af proliferation, og det er blevet betragtet som en tumorsuppressor. Selvom TGFP virker som en tumorsuppressor i den tidlige fase tumorer, under tumorudvikling den TGFp antiproliferative funktion går tabt, og i visse tilfælde TGFp bliver et onkogent faktor, der inducerer celleproliferation, invasion, angiogenese, og immunsuppression [4, 5]. Det er blevet rapporteret, at TGFp kan signalere ikke kun gennem Smad-afhængige, men også Smad-uafhængige pathways [6]. På grund af de dobbelte aspekter af TGFp i onkogenese, kan Smad signal være en kritisk integrator af TGFp-receptor signaling transduktion systemer, selv om betydningen af Smad ekspression er stadig kontroversiel. Bruna et al. 2007 viste, at høj TGFp-Smad aktivitet er til stede i aggressive, stærkt proliferative gliomer og giver dårlig prognose hos patienter med gliom [7], mens manglende Smad ekspression synes at være korreleret med tumorudvikling og dårlig prognose hos patienter med esophageal planocellulært karcinom [8] brystkræft [9] og kolorektal cancer [10]. Ikke meget er kendt om den prognostiske værdi af Smad2 udtryk i gastrisk karcinom, mens flere rapporter om serumniveauer af TGF [11, 12] foreslog, at TGFp kan fremkalde invasion og metastase i gastrisk karcinom. Forstå betydningen af Smad2 kunne være nyttigt i gastrisk cancer. I denne undersøgelse, derfor undersøgte vi p-Smad2 udtryk for gastrisk karcinom at klarlægge, hvilken rolle af p-Smad2 i avanceret gastrisk adenokarcinomer.
Metoder
Patienter
Vi undersøgte kirurgiske prøver fra patienter på Osaka By Universitetshospital, Osaka, Japan. I alt 135 patienter, der havde gennemgået resektion af primær gastriske tumorer og blev bekræftet histologisk at have avanceret mavekræft, blev indrulleret i denne undersøgelse. "Avanceret cancer" angiver kræft invasion af muscularis propria eller serosa. Ingen af patienterne havde undergået præoperativ strålebehandling eller kemoterapi. Patologiske diagnoser og klassifikationer fulgte den japanske Klassificering af gastrisk karcinom [13]. Nedsat metastase og peritoneal metastaser blev undersøgt ved laparotomi. Peritoneal lavage cytologi af bughulen blev udført ved laparotomi, og eksfolierede cancerceller blev undersøgt mikroskopisk. Dybde af tumorinvasion, differentiering, lymfeknudemetastase, venøs invasion og lymfe invasion var baseret på mikroskopisk undersøgelse af materialer opnået ved kirurgisk resektion. Den histologiske klassificering var baseret på den fremherskende mønster af tumor. De histologiske undertyper var: papillær adenocarcinom, veldifferentieret rørformet adenocarcinom og moderat differentieret rørformet adenocarcinom, betragtes som tarm-type. Subtype var: solid dårligt differentieret adenocarcinom, ikke-faststof dårligt differentieret adenocarcinom, signet-ring cell carcinoma og mucinous carcinoma, betragtes som diffus-typen. Lymfeknudemetastase blev besluttet på den regionale lymfeknuder metastaser. De regionale lymfeknuder i maven er klassificeret i tre stationer nummererede som beskrevet i den japanske klassifikationen [13], at afhængigt af placeringen af den primære tumor. Da antallet af stigningen, det angivet, at spredning til fjerne lymfeknuder. Undersøgelsen protokol var i overensstemmelse med de etiske retningslinjer i Helsinki-deklarationen (1975). Denne undersøgelse blev godkendt af Osaka City University etiske komité. Informeret samtykke blev opnået fra alle patienter før indrejse
Immunohistokemiske teknikker
Alle H &. E-farvede lysbilleder af de kirurgiske enheder er anmeldt, og den repræsentativt udsnit af tumoren, der omfattede det sted dybeste invasion blev valgt for den immunhistokemiske undersøgelse
En kanin polyklonalt anti-humant P-Smad2-antistof (Chemicon International, Themecula, CA. 1: 2000). blev anvendt til at detektere p-Smad2. Fremgangsmåderne til immunhistokemisk farvning af p-Smad2 er blevet beskrevet i producentens instruktioner. Kort fortalt blev objektglassene deparaffineret, og blev opvarmet i 20 minutter ved 105 ° C ved autoklavering i Target Retrieval Solution (Dako, Carpinteria, CA). Snit blev derefter inkuberet med 3% hydrogenperoxid til at blokere endogen peroxidaseaktivitet. Prøverne blev inkuberet med p-Smad2 antistof (1: 2.000) natten over ved 4 ° C. Snittene blev inkuberet med biotinyleret gede-anti-kanin-immunoglobulin G i 30 minutter, efterfulgt af tre gange vask med PBS. Objektglassene blev behandlet med streptavidin-peroxidase-reagens, og blev inkuberet i PBS diaminobenzidin og 1% hydrogenperoxid v /v, efterfulgt af modfarvning med Mayers hematoxylin. Vi har tidligere rapporteret ekspressionsniveauet af p-Smad2 i gastriske cancercellelinier [14]. Udeladelsen af det primære antistof fungerede som negative kontroller.
Immunhistokemisk bestemmelse af p-Smad2
P-Smad2 farvning blev evalueret ved invasionen foran gastriske cancere. Både hæmatoxylin og eosin farvning blev brugt som reference slide for at vælge kræft områder på invaderende foran. Eksistensen af kræftceller blev kontinuerligt undersøgt fra serosa til slimhinden under et mikroskop. Den invaderende fronten blev bestemt ved læsionen, hvor kræftceller først blev fundet fra serøse side. P-Smad2-farvning var tydelig i kernerne i cancerceller. Procentdelen af p-Smad2 immunpositive celler blev bestemt ved tælling 3 områder tilfældigt valgte i vævet i alt 300 kerner af cancerceller. Evalueringen blev foretaget af to dobbelt-blindet uafhængige observatører, der var uvidende om kliniske data og histologiske diagnoser. Procentdelen af nucleus farvede celler for p-Smad2 blev også bestemt. Der var 15 (11%) tilfælde af en afvigende evaluering mellem de to uafhængige observatører. I de tilfælde, vi kontrolleres igen og diskuteret og det endelige resultat blev opnået ved konsensus.
Farvning blev scoret med den Allred pointsystemet som tidligere [15] beskrevet. For semikvantitativ analyse af p-Smad2 immunreaktivitet blev intensiteten af farvning og procentdelen af tumor farvede celler evalueret i repræsentative høj effekt (× 400) og energibesparende felter (× 200) ved anvendelse af optisk mikroskopi: intensitet blev scoret 0-3 (0 = ingen immunreaktivitet, 1 = svag, 2 = moderat og 3 = intens immunreaktivitet) og andelen blev scoret 0-5 (0 = 0%, 1 = 1-20%, 2 = 21-40%; 3 = 41-60%, 4 = 61-80%, 5 = 81-100%). De to scoringer blev derefter tilsat for at opnå det endelige resultat af 0-8. Den mediane score af alle tilfælde var 6,07. Så cut-off point blev bestemt 6; p-Smad2 udtryk blev anset høj ekspression når scoringer var ≥7 og lav udtryk, når scoringer var. < 7
Statistisk analyse
Sammenlignende analyser af dataene blev udført ved hjælp af Chi-square test eller Fishers eksakte test. De overlevelse varigheder blev beregnet ved hjælp af Kaplan-Meier-metoden og analyseret ved log-rank test til at sammenligne de kumulative overlevelse varigheder i patientgrupper. Cox proportionel-farer regression blev anvendt til at beregne univariate og multivariate farer nøgletal for undersøgelsen parametre. En p-værdi på mindre end 0,05 blev defineret som værende statistisk signifikant. SPSS 10,0 software (SPSS Japan, Tokyo, Japan) blev anvendt til analyserne.
Resultater
Forholdet mellem klinisk-patologiske funktioner og phospho-Smad2 udtryk
Phospho-Smad2 var primært immunolocalized i kerner af kræftceller (figur 1A). Intensiteten af farvningen og procentdelen af farvede tumorceller var variabel. Med hensyn til intensitet, score 0 blev fundet i ingen tilfælde (0%), score 1 i 55 tilfælde (41%), score 2 i 33 tilfælde (24%), og score 3 i 47 (35%) tilfælde. Ved vurdering af positive celle procenter, score 0 blev fundet i ingen tilfælde (0%), score 1 i 2 tilfælde (1%), score 2 i 11 tilfælde (8%), score 3 i 16 tilfælde (12%), score 4 i 43 tilfælde (32%) og score 5 i 63 tilfælde (47%). De samlede Allred scorer varierede fra 2 til 8. Det høje ekspressionsniveau af p-Smad2 blev fundet i 63 (47%) af 135 gastriske carcinomer. Det indbyrdes forhold mellem p-Smad2 ekspression og klinisk-patologiske træk ved tumorerne er vist i tabel 1. P-Smad2 ekspressionsniveauet var signifikant høj i diffust typen carcinom (p = 0,011) og signifikant korreleret med peritoneal metastase (p = 0,017), lymfekirtel metastase af japansk klassifikation [13] eller UICC klassifikationen [16] (p = 0,047, p = 0,004) og peritoneal cytologi (p = 0,026). "Peritoneal cytologi" forstås peritoneal lavage cytologi ved laparotomi som en standard metode til påvisning af frie tumorceller og en nyttig indikator for peritoneal tilbagefald i mavekræft. I 12 tilfælde blev peritoneal cytologi ikke udført. Så det samlede antal peritoneal cytologi var 123 sager. Der var ingen statistisk signifikant sammenhæng mellem phospho-Smad2 ekspression og enten hepatisk metastase, venøs invasion eller lymfatisk invasion. Antallet af metastatiske lymfeknuder i høj ekspression gruppe (median = 12,3) var signifikant (p = 0,002) højere end i lav-ekspression gruppe (median = 5.77), mens ingen forskel i antallet af påvirkede lymfeknuder blev vist mellem lav-p-Smad2 grupper (median = 41,1) og høj-p-Smad2 grupper (median = 44,4). Figur 1 (A), Immunhistokemisk bestemmelse af p-Smad2. P-Smad2 blev fundet i kernerne i cancerceller. Det immunoreaktive intensitet score p-Smad2 farvning i tumorceller blev evalueret under anvendelse af de positive og negative kontroller. Score 3 betyder høj intensitet som samme som den positive kontrol. Immunreaktivitet, score 1 = svag, score 2 = moderat, og score 3 = intens. (× 400). (B), Den samlede overlevelse af patienter baseret på p-Smad2 udtryk. Kaplan-Meier overlevelse kurve viser samlet overlevelse i forhold til p-Smad2 ekspression i 135 patienter med gastrisk karcinom. Der blev observeret en statistisk signifikant forskel i overlevelse mellem de høje p-Smad2 grupper og lave p-Smad2 grupperne (p = 0,035; log-rank,).
Tabel 1 Forholdet mellem p-Smad2 og klinisk-patologiske funktioner i 135 gastrisk kræft tilfælde.
Parameter
P-Smad2
p
-værdi

høj (n = 63)
Low (n = 72)

Køn
Mand
39 ( 41,9%)
54 (58,1%)
NS
Kvindelige
24 (57,1%)
18 (42,9%)
morfologiske træk +
Type 1
6 ( 37,5%)
10 (62,5%)
0,025
Type 2
14 (35,0%)
26 (65,0%)
Type 3
17 (45,9%)
20 (54,1%)
Type 4
26 (61,9%)
16 (38,1%)
T etape
2
7 (25,9%)
20 ( 74,1%)
0,031
3
52 (50,0%)
52 (50,0%)
4
4 (100,0%)
0 (0,00%)
Differentiering
Intestinal-typen
15 (31,2%)
33 (68,8%)
0,011
diffus-typen
48 (55,2%)
39 (44,8%)
lymfeknudemetastase + Hotel (japansk klassifikation)
n0 og N1
34 (40,5%)
50 (59,5%)
0,047
N2 og N3
29 (56,9 %)
22 (43,1%)
lymfeknudemetastase ++ Hotel (UICC klassifikation)
n0 og N1
31 (36,9%)
53 (63,1%)
0,004
N2 og N3
32 (62,7%)
19 (37,3%)
Nedsat metastaser
Negativ
62 (47,0%)
70 (53,0%)
NS
Positiv
1 (33,3%)
2 (66,7%)
Peritoneal metastaser
Negativ
48 (42,1%)
66 (57,9%)
0,017
Positiv
15 (71,4%)
6 (28,6%)
Peritoneal cytologi +++
Negativ
36 (40,4%)
53 (59,6%)
0,026
Positiv
22 (64,7%)
12 (35,3%)
lymfatisk invasion
Ly0 og Ly1
26 (40,6%)
38 (59,4%)
NS
Ly2 og ly3
37 (52,1%)
34 (47,9%)
Venøs invasion
Negativ
50 (45,5%)
60 (54,5%)
NS
Positiv
13 (52,0%)
12 (48,0%)
Klinisk fase
jeg
2 (22,2%)
7 (77,8%)
0,022
II
15 (39,5%)
23 (60,5%)
III
18 (40,0%)
27 (60,0%)
IV
28 (68,7% )
15 (31,3%)
+, Klassifikation i henhold til de generelle regler for mavekræft Undersøgelse af den japanske Research Society for gastrisk kræft [13]. Type 1 er defineret som en polypoid tumor; type 2 som polypoid tumor med sårdannelse og med skarpt afgrænsede marginer; type 3 som sår karcinom med kræft infiltration i den omgivende væg; type 4 så diffust infiltrerende flad karcinom, hvor ulceration er normalt ikke et markant træk.
++, blev Nodal fase vurderet af Union Internationale Contre le Cancer (UICC) tumor node metastase (TNM) klassifikation [16] og ved klassificering efter de almindelige regler for mavekræft undersøgelse af den japanske Research Society for mavekræft. I TNM klassifikation blev nodal stadium klassificeres efter antallet af involverede regionale LN som følger: PN0, ingen LN spredning; PN1, 1 til 6 syge LN; pN2, 7 til 15; og pN3, mere end 15. I den japanske klassificering blev nodal etape klassificeret efter omfanget af positive LN i n0, n1, n2, og n3 og anses for at afspejle den anatomiske vej af lymfatisk spredning. n1 er defineret som nærtliggende regional LN sygdom, og N2 og N3 defineres som fjernt.
+++, I 12 tilfælde, peritoneal cytologi blev ikke udført (Total 123 tilfælde).
Phospho-Smad2 vedrører med dårlig prognose i gastrisk cancer
i denne serie af fremskreden mavekræft overlevelse phospho-Smad2 højniveauekspression patienter var markant dårligere end for phospho-Smad2 lavt niveau udtryk patienter (p = 0,035, figur 1B). I univariat analyse, høj phospho-Smad2 ekspression (p = 0,048), morfologisk type 4 (p < 0,001), diffus-type tumorer (p < 0,001), lymfeknudemetastase (p < 0,001), peritoneal metastase (p < 0,001), peritoneale frie cancerceller (p < 0,001), lymfatisk invasion (p = 0,006) og den kliniske fase IV (p < 0,001) var signifikant associeret til dårlig patient overlevelse (tabel 2). I multivariat analyse, morfologisk type 4, diffus-type tumorer og klinisk stadie IV var statistisk uafhængige prognostiske faktorer, men phospho-Smad2 var ikke (tabel 3) .table 2 univariat analyse med hensyn til den samlede overlevelse (n = 135).
Parameter
Risk forholdet
95% Konfidensinterval
p
-værdi
P-Smad2 udtryk
1.650
1,005-2,710
0,048
lav vs
. høj
morfologiske træk
5,354
3,199-8,963
< 0,001
Type 1, 2, og 3 vs
. type 4
Differentiering
3,883
2,020-7,463
< 0.001
Intestinal-typen vs
. Diffus-typen
lymfeknudemetastase (japansk klassifikation)
3,269
1,978-5,403
< 0,001
n0 og N1 vs
. N2 og N3
Peritoneal formidling
5,534
3,056-8,738
< 0,001
Negativ vs
. positiv
Peritoneal cytologi
5,937
3,468 til 10,166
< 0,001
Negativ vs
. positiv
lymfatisk invasion
2,055
1,234-3,421
0,006
Ly0 og Ly1 vs
. ly2 og ly3
Klinisk Stage
6,901
4,088 til 11,651
< 0,001
I, II, og III vs
. IV
Tabel 3 Multivariat analyse med hensyn til den samlede overlevelse (n = 135).
Parameter
Risk forholdet
95 % Konfidensinterval
p
-værdi
P-Smad2 udtryk
0,627
0,347-1,133
0,122
lav vs
. høj
morfologiske træk
2,325
1,221-4,388
0,010
Type 1, 2, og 3 vs
. type 4
Differentiering
2,807
1,251-6,298
0,012
Intestinal-typen vs
. Diffus-typen
lymfeknudemetastase (japansk klassifikation)
1,387
0,689-2,794
0,360
n0 og N1 vs
. N2 og N3
Peritoneal formidling
1,097
0,549-2,193
0,793
Negativ vs
. positiv
lymfatisk invasion
1,394
0,805-2,413
0,235
Ly0 og Ly1 vs
. ly2 og ly3
Klinisk Stage
4,382
1,924-9,978
< 0,001
I, II, og III vs
. IV
Diskussion
P-Smads2 er en primær skridt og intracellulær signalering effektor for mæglingen af intracellulær signalering af TGFp [1]. I den tidlige fase tumorer fungerer TGFP som tumorer suppressor, mens det i fremskredne tumorer det bliver en onkogen faktor. På grund af den dobbelte rolle TGF i onkogenese, afhængigt af den type og stadium af tumoren, vi fokuserede vores undersøgelse om p-Smad2 udtryk på fremskredent stadium af mavekræft. P-Smad2 ekspressionsniveauer af cancerceller var høj i 63 (47%) af 135 gastriske carcinomer, hvilket antyder, at nogle typer af gastriske carcinomer var stærkt berørt af TGFp. I den foreliggende undersøgelse, p-Smad2 ekspression i tumorceller var signifikant højere i diffust-type tumorer og i tilfælde med peritoneal metastase, gratis peritoneale cancerceller og lymfeknudemetastase. Endvidere p-Smad2 høj ekspression forudsagt ringe overlevelse. Disse resultater antyder, at p-Smad2 er forbundet til malign fænotype og er en molekylær biomarkør for sygdom resultat i fremskreden gastrisk cancer.
P-Smad2 ekspressionsniveauer af cancerceller var høj i diffust-typen gastrisk karcinom også kendt som en scirrhous typen . Der er to typer af gastrisk cancer: diffuse type og intestinal type, ifølge Lauren klassifikationen [17]. De karakteristiske kliniske træk ved diffus-typen gastrisk carcinom, et diffust infiltrerende type gastrisk carcinom, omfatter en høj frekvens af metastase i LMS [18-20] og til peritoneum [21-23]. Ekspressionsniveauet af TGFp i scirrhous gastrisk carcinom blev relateret til dårlig prognose [24]. Tumor celler i scirrhous karcinom producere flere TGFp end ikke-scirrhous karcinom [25, 26]. TGFp signaler kan spille en vigtig rolle for metastatisk spredning af kræftceller som migration, og invasion, som tidligere rapporteret [2, 11, 27]. Faktisk blev Overekspression af Smad2 forbundet med metastase, og var korreleret med dårlig prognose af gastriske tumorer især diffus-typen gastrisk karcinom. TGFp-Smad2 signalering kan have en vigtig rolle i progressionen af diffuse type gastrisk carcinom. Den aktiverede Smad2 niveau kan være forbundet med de forskellige kliniske fænotype af malignitet mellem den diffuse-typen og intestinal-type gastrisk karcinom.
Immunohistokemisk er en god metode til valg til evaluering af proteinekspression i et bestemt væv, da det er muligt at skelne de celletyper farves, samt antallet af celler og intensiteten af den immunhistokemiske farves. Begge analyser skal kombineres og det blev gjort. Allred score system evaluerer en kombination af intensitet og andelen, potentielt øger prognostiske værdi af analysen ved alene intensiteten eller alene andel i denne undersøgelse. Allred snesevis af 7-8 blev anset egnet til identifikation af aggressive fremskreden gastrisk karcinom. Allred score system til p-Smad2 ekspression kan være egnet til nøjagtig vurdering p-Smad2-udtrykkende tumorceller, og kan være tilstrækkelig til at forudsige resultatet af patienter med gastrisk cancer. P-Smad2 farvning blev evalueret ved invasionen foran gastriske cancere. P-Smad2 ekspression i kerner af cancerceller blev kontinuert undersøgt fra serosa til slimhinden under et mikroskop. Par forskel på p-Smad2-farvning fandtes mellem infiltrative forreste og overflade læsioner i de samme tilfælde. Og kan tumorcellerne ved invaderende foran spille en vigtig rolle for fjernt metastase. Derfor blev p-Smad2 ekspression af tumorcellerne vurderet på invaderende foran.
Eftersom det aktiverede Smad2 var forbundet med den maligne fænotype af gastrisk cancer, er det muligt, at inhibering af p-Smad2 signalering i gastrisk karcinom kan give gavnlige virkninger gennem inhibering af invasion og metastase af cancer. Selv er TGFp-vejen, der vurderes som et terapeutisk mål i gastrisk cancer [28, 29], kan de komplekse roller TGFp i tumorudvikling gør det vanskeligt at udvælge de patienter, der vil drage fordel et anti-TGFp-terapi. Bestemmelsen af p-Smad2 ekspression af Allred score system kan forbedre patientens udvælgelse og udviklingen af vellykkede målrettede behandlinger, selv om det vil være nødvendigt at bekræfte, at p-Smad2 Allred score giver også betydelig prognostisk strøm til mavecancerpatienter i en prospektiv undersøgelse.
Konklusion
P-Smad2 synes at spille en afgørende rolle i avanceret gastrisk karcinom og kan være en nyttig prognostisk markør for dårlig prognose.
erklæringer
Taksigelser
vi takker Masako Shinkawa (Osaka city University Graduate School of Medicine) til teknisk bistand.
forfattere 'originale indsendte filer til Images of Nedenfor er links til forfatternes oprindelige indsendte filer til billeder. 12885_2010_2451_MOESM1_ESM.pdf Forfatternes oprindelige fil til figur 1 12885_2010_2451_MOESM2_ESM.jpeg Forfatternes oprindelige fil til figur 2 konkurrerende interesser
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende interesser.

Fosforyleret Smad2 i Advanced Stage Gastric Carcinoma

undersøgelser

undersøgelser

Other Languages