PLOS ONE: Catepsina E é um marcador de gástrico Diferenciação e Signet-Ring Carcinoma de Estômago: Uma sugestão Novel em gástrica Tumorigenesis

Abstract

O câncer gástrico (CG), apresenta várias características histológicas, embora o mecanismo subjacente sua diversidade raramente é elucidado. Ele é principalmente classificados em adenocarcinoma bem diferenciado tubular (tub1), moderadamente diferenciado adenocarcinoma tubular (tub2), adenocarcinoma pouco diferenciado (POR), carcinoma de células em anel de sinete (SIG), adenocarcinoma mucinoso (MUC), e adenocarcinoma papilar (PAP). Pela triagem, encontramos catepsina E (CTCE)
expressa universalmente em sig-tipo, ocasionalmente, em por-tipo, e raramente em linhas celulares GC tub1 /tipo tub2. Nos espécimes cirurgicamente ressecados, CTCE foi imunocoradas em 50/51 sig-tipo (98,0%), 3/10 tub1-type (30,0%), 7/18 tub2-type (38,9%), 15/26 por-tipo ( 57,7%), 4/10 pap-tipo (40,0%), e 0/3 do tipo muc (0,0%) GC. Nos espécimes endoscopia-ressecados, 6/7 sig-type (85,7%), 7/52 tub1-type (13,7%), 5/12 tub2-type (41,7%), 2/7 pap-type (28,6%) GC e adenoma de 0/6 (0,0%) expressaram CTSE. Para tecidos não malignos, CTSE é universalmente expressa em fúndica normal, piloro e glândulas cardíacas de estômago, mas dificilmente em outros órgãos digestivos. No metaplasia intestinal pré-cancerosas do estômago, CTSE é principalmente observada em tipo-gástrica e intestinal misto e deficiente em tipo exclusivamente-intestinal. expressão CTCE é positivamente correlacionada com o marcador gástrica MUC5AC ( p Art < 0,0001) e negativamente correlacionada com o marcador intestinal MUC2 ( p
= 0,0019). Por tipo sig GC, em ambos os tumores e mucosa fundo, expressão de MUC5AC e CTCE é alta enquanto que a MUC2 é baixo, indicando que tipo sig GC reflete as características de mucosa de fundo. Para adenoma gástrica e tub1 /-tipo tub2 GC, tumores indiferenciados mais tendem a mostrar maior expressão de CTSE com MUC5AC e menor expressão de MUC2 em tumores, mas eles tendem a apresentar uma menor expressão de CTSE, MUC5AC e MUC2 na mucosa fundo. Estes sugerem que o adenocarcinoma gástrico mais maligno com gástrica mais fortes e mais fracas propriedades intestinais tendem a surgir a partir de mucosa fundo com diminuição ambos os recursos gástricos e intestinais. Em conclusão, CTSE é um marcador de ambos diferenciação gástrico e carcinoma de células em anel de sinete, que deve lançar luz sobre o mecanismo de desenvolvimento de neoplasias gástricas

Citation:. Konno-Shimizu M, Yamamichi N, Inada Ki, Kageyama- Yahara N, K Shiogama, Takahashi Y, et al. (2013) Catepsina E é um marcador de gástrico Diferenciação e Signet-Ring Carcinoma de Estômago: Uma sugestão Novel em gástrica Tumorigênese. PLoS ONE 8 (2): e56766. doi: 10.1371 /journal.pone.0056766

editor: Anthony Federação das Índias Ocidentais Lo, da Universidade Chinesa de Hong Kong, Hong Kong

Recebido: 20 de novembro de 2012; Aceito: 14 de janeiro de 2013; Publicação: 22 de fevereiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Konno-Shimizu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte por uma concessão do Sato Memorial Foundation for Cancer Research, em parte por uma concessão de pesquisa do Instituto de pesquisa do Câncer Nakayama, em parte por uma bolsa de investigação da Fundação para a promoção da pesquisa do cancro, e também em parte por Grant-in- Aid para Jovens cientistas (B) do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia (MEXT). Mas todos os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer gástrico (CG) é o quarto câncer mais comum ea segunda causa de morte relacionada ao câncer em todo o mundo, apesar da diminuição gradual da sua incidência e mortalidade [1], [2]. É bem sabido que a malignidade gástrica apresenta várias características histológicas [3]. A classificação mais amplamente utilizado de câncer gástrico é a classificação Lauren que distingue intestinal (diferenciada) tipo GC e difusa (indiferenciado) tipo GC [4]. Lauren digitação é simples e fácil de entender, embora a sua simplificação, muitas vezes leva à incapacidade de refletir características precisas de malignidade gástrica [3]. Na classificação japonesa mais detalhada do cancro gástrico [5], que é semelhante a classificação da OMS [6], adenocarcinoma gástrico é classificada em seis categorias: adenocarcinoma tubular bem diferenciado (tub1), moderadamente diferenciadas adenocarcinoma tubular (tub2), fracamente diferenciado adenocarcinoma (POR), carcinoma de células em anel de sinete (SIG), adenocarcinoma mucinouse (MUC), e adenocarcinoma papilar (PAP). De um modo geral, difuso de Lauren (indiferenciado) tipo inclui porção, sig-, e do tipo muc GC, enquanto intestinal de Lauren (diferenciado) Tipo compreende tub1-, tub2- e pap do tipo GC [3].

Entre os vários tipos histológicos GC, nós nos concentramos em carcinoma de células em anel de sinete (SRCC) do estômago (tipo sig GC). SRCC é um adenocarcinoma que segregam mucina, na qual mucina intracitoplasmática comprime seus núcleos para dar as células aparência característica "anel de sinete" [7]. Enquanto SRCC foi relatado para ser originado a partir de vários tecidos, estômago é o órgão mais comum de origem [7], [8]. Apesar da prevalência frequente de SRCC entre neoplasias gástricas, características clinicopatológicas de tipo sig GC ainda são controversos; alguns estudos anteriores relataram que histologia celular anel de sinete apresenta um prognóstico melhor [9], [10], [11], enquanto outros estudos relataram que a histologia do SRCC é um sinal de vez pior prognóstico [8], [12], [ ,,,0],13], [14]. Sob esse pano de fundo, tentamos encontrar novos genes marcadores específicos para tipo sig GC. Na maioria dos estudos anteriores [15], [16], [17], do tipo sig GC foram analisados ​​em conjunto com por-tipo e do tipo muc, porque esses três tipos de GC são classificados em tipo difuso de Lauren. No entanto, muitos relatórios sugeriram que tipo SIG-GC é bastante diferente do do tipo MUC porção ou GC, a partir do ponto de vista de características moleculares ou potenciais malignos [3], [13], [18]. Portanto, analisamos o tipo sig GC independentemente do GC porção e do tipo muc.

Entre o grande número de genes, nós analisamos vários outros, tais como caderina
genes da família [19 ], [20], humanos mucina
genes [21], vimentina
[22], catepsina
genes familiares [23], [24], [25] , etc, cujas expressões têm sido referidos como sendo diferente entre intestinal e difuso tipo GC de Lauren. O principal objetivo do nosso estudo é encontrar uma pista para carcinogênese não resolvida de tipo sig GC através da identificação de seus genes marcadores específicos. Nós esperávamos que o nosso julgamento levaria a genes desconhecidos reguladores a montante (tais como fatores de transcrição específicos) que determinam as propriedades de tipo sig GC. Alguns fatores de transcrição relacionados com propriedades gastrointestinais foram esclarecidos, como genes da família CDX
[26], [27], gli
genes familiares [28], e sox2
[29], mas acreditamos que não poucos genes cruciais para a diferenciação gastrointestinal e oncogênese gástrica ainda permanecem desconhecidas. Outro objectivo do nosso estudo é analisar a fase muito precoce de tumorigénese gástrica com base na expressão de novos genes marcadores identificados. Não só focando-type sig GC, nós ainda desafiados a avaliar todos os tipos de casos GC início, analisando a expressão do gene marcador identificado tanto na lesão tumoral e mucosa adjacente. Estamos convencidos de nosso trabalho deve ser uma chave para aproximar-se as características controversas do tipo sig GC, e também deve ser uma pista para elucidar as várias propriedades histológicos de malignidade gástrica.

Materiais e Métodos

Cultura celular

Vinte gástrico, colorrectal dez, e duas linhas de células de cancro não-gastrointestinais foram mantidas em DMEM com soro de vitelo fetal a 10% (Gibco /Invitrogen, Carlsbad, CA) a 37 ° C [30], [31]. Todas as linhas celulares foram adquiridos a partir da American Type Culture Collection, RIKEN Cell Bank, ou célula Resource Center for Biomedical Research Institute do Desenvolvimento, Envelhecimento e Câncer, Universidade de Tohoku. Os nomes e os tipos histológicos de linhas celulares de cancro utilizados foram descritos minuciosamente no Documento de Apoio S1. Para o reagente de desmetilação de ADN e histona desacetilase inibidor (HDAC), 5-aza-2'-desoxicitidina (5-Aza-DC, Sigma-Aldrich) a 2 ug /mL ou tricostatina A (TSA, Sigma-Aldrich) a 100 ng /ml foram adicionados ao meio de cultura.

RT-PCR

os ARNs totais celulares foram preparados utilizando o isolamento de ARN reaent ISOGEN (Wako, Osaka, Japão) tal como descrito anteriormente [30]. Semi-quantitativo de RT-PCR foi realizada através do sobrescrito de reacção de um só passo utilizando o Taq Platinum (Gibco /Invitrogen). Os procedimentos pares de primers e RT-PCR utilizado para detectar os níveis de E-caderina (CDH-1)
, LI-caderina (CDH-17)
, MUC5AC expressão
, MUC6
, MUC2
, CTCE (Catepsina E)
, CTSD (Catepsina D)
, CTSB (Catepsina B)
, CTSL (Catepsina L)
, e GAPDH
são apresentados na Tabela S1.

Western Blotting

extractos de células inteiras (20 ug cada) foram lisadas e fervido com 1x tampão de amostra [30] foram separadas por electroforese em geles a 12,5% de SDS poliacrilamida, transferidas para membrana de nitrocelulose (Hybond-N, Amersham, Freiburg, Alemanha), e imunocoradas com anticorpo anti-humano catepsina e anticorpo (# AF1294, R & D Systems, Minneapolis, MN), anticorpo anti-humano β-Actina (C4) (# sc-47778, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) ou. Para segundos anticorpos, peroxidase de rábano (HRP) -conjugated anti-IgG de cabra (H + L) anticorpo de burro (ˁ-035-003, Jackson, Baltimore, PA) e peroxidase de rábano (HRP) -conjugated anti-IgG de ratinho (H G + anticorpo de cabra) (# A90-216P, Bethyl, Montgomery, TX) foram usados, respectivamente. bandas específicas foram detectadas com Immunostar LD (Wako, Osaka, Japão) e LAS-4000 (Fuji Film, Tóquio, Japão).

Imunohistoquímica

desparafinização e inativação da peroxidase endógena de tecidos clínicos foram realizados tal como descrito anteriormente [3]. Para CTSE, a imunocoloração com anticorpo policlonal primário CTSE de cabra anti-humano (# AF1294, R & D Systems) a uma diluição 1:100 foi realizada durante 16 horas a temperatura ambiente. Após lavagem em PBS, três vezes, a imunocoloração secundário (fosfato tamponado com-sais) com Histofine simples mancha MAX-PO (L) (Nichirei, Tóquio, Japão) foi realizada durante 30 min à temperatura ambiente. Após lavagem em PBS três vezes, os produtos de reacção foram visualizados em solução tetracloridrato de 20 mg /dl de 3,3'-diaminobenzidina contendo uma gota de 30% de H _{2O 2, seguido por lavagem com PBS. contracoloração nuclear foi realizada com hematoxilina de Mayer. Para MUC5AC e MUC2, aquecimento hidratado em tampão de 1 mM de EDTA (pH 8,0) a 120 ° C, foi realizada pela primeira vez em uma panela de pressão (Delicio 6L; T-FAL, Rumily, França) durante 10 min para a recuperação de antigénio. A marcação primária com o anticorpo anti-MUC5AC (NCL-MUC-5AC, Novocastra, Newcastle-upon-Tyne, Reino Unido) a um anticorpo diluição 1:200 ou anti-MUC2 (NCL-NUC-2, Novocastra) a uma 1:500 diluição foi realizada durante 16 horas a temperatura ambiente. Após lavagem em PBS três vezes, a imunocoloração secundário com Histofine simples mancha MAX-PO (L) (Nichirei) foi realizada durante 30 min à temperatura ambiente. O passo seguinte foi a mesma que a coloração imunológica CTSE. Todas as secções foram avaliadas de forma independente por dois patologistas, juntamente com HE-coradas e seções manchadas de PAS das mesmas lesões.}

amostras de tumores

Entre os tecidos com cancro gástrico inclinadas na Saúde Fujita University School of Medicine, foram selecionados 51 carcinoma de células em anel de sinete gástrica (SIG) amostras cirurgicamente ressecados. Além disso, 67 cancro gástrico espécimes cirúrgicos de outros cinco tipos de adenocarcinoma gástrico (tub1, tub2, POR, pap, e MUC) foram selecionados aleatoriamente a partir do mesmo banco. Para as amostras por via endoscópica ressecados, foram selecionados 84 espécimes (78 casos de câncer gástrico e 6 casos de adenoma gástrico) que foram tratados na Universidade de Hospital de Tóquio de 2005 a 2011. Para todas as amostras clínicas, consentimentos informados por escrito foram obtidas dos pacientes correspondentes de acordo com a Declaração de Helsinki. Este estudo foi aprovado pelo comitê de ética institucional para a investigação humana na Universidade de Fujita Saúde, e também foi aprovado pelos comitês de ética da Universidade de Tóquio.

Retrovirus vetores

Para gerar vetores retrovirais expressando Cdx2
, Gli1
, Gli3
, CTSE
, e Sox2
, respectivos cDNAs foram inseridos pMXs-IRES -puro (celular Biolabs Inc., San Diego, CA) como se segue. Para Cdx2
, pMXs-Cdx2-IRES-puro foi gerado conforme relatado anteriormente [26]. ADNc Gli1
foi obtido a partir de pCR-XL-TOPO-Gli1 (Open Biosystems, Huntsville, AL) através de amplificação por PCR utilizando os iniciadores 5'-agccagatctatgagcccatctctgggattc-3 'e 5'-agtagcggccgcccctactctttaggcactagagt-3'. Após dupla digestão com Bgl II e Not I, o fragmento obtido foi inserido no local /Not I BamH I do pMXs-IRES-Puro (celular Biolabs Inc., San Diego, CA) para gerar pMXs-Gli1-IRES-puro. ADNc Gli3
foi obtido a partir de pCR-XL-TOPO-Gli3 (Open Biosystems) através de amplificação por PCR utilizando os iniciadores 5'-aatgcggccgctgatttccgttggt-3 'e 5'-tgcggatcctacgtgggcatttttg-3'. Após dupla digestão com BamH I e Not I, o fragmento obtido foi inserido no BamH I /Not I de sítios pMXs-IRES-puro para gerar pMXs-Gli3-IRES-puro. ADNc CTSE
foi obtido a partir de pCMV-SPORT6-CTSE (Thermo Fisher Scientific, Madison, WI) por meio de amplificação por PCR utilizando os iniciadores 5'-ccgagatctatgaaacgctccttcttttg-3 'e 5'-gggctcgagtaaaactgtcgaatgaaga-3'. Após dupla digestão com Bgl II e Xho I, o fragmento obtido foi inserido nos locais BamHI /XhoI de pMXs-IRES-puro para gerar pMXs-CTSE-IRES-puro. ADNc Sox2
foi obtido a partir de 7 MKN-DNA genómico através de amplificação por PCR utilizando os iniciadores 5'-atgtacaacatgatggagacggagct-3 'e 5'-tcacatgtgtgagaggggcagtgtg-3'. O fragmento amplificado foi inserido nos locais EcoR V do vector pT7Blue-T (Novagen, Darmstadt, Alemanha) para gerar pT7Blue-Sox2. Após dupla digestão com BamH I e Sal I, o fragmento obtido foi inserido nos locais BamHI /XhoI de pMXs-IRES-puro para gerar pMXs-Sox2-IRES-puro. Por co-transfecção destes plasmídeos com proteína G do vírus da estomatite vesicular envelope (VSV-G) plasmídeo de expressão em PLAT-GP pré-embalada linha de células (Cell Biolabs Inc.), respectivamente, VSV-G-pseudotipados vetores retrovirais baseados em MuLV expressando Cdx2
, Gli1
, Gli3
, CTSE
, e Sox2
foram preparados.

resultados

a expressão de catepsina E (CTCE)
é significativamente correlacionada com Originado o tipo histológico de linhas celulares de cancro gástrico

para pesquisar os genes marcadores de tipo sig GC, nós analisamos a expressão de vários genes relatado para mostrar expressão distintiva entre intestinal e difuso tipo GC de Lauren. Expressão de E-caderina
( CDH-1 |) [19], LI-caderina
( CDH-17
) [20], MUC5AC
[21], MUC6
[21], MUC2
[21], vimentina
[22], CTSD
( catepsina D
) [23], [24], CTSE
( catepsina E
) [23], [24], CTSB
( catepsina B
) [25], CTSL
( catepsina L
) [25], e GAPDH
(controle interno) genes eram avaliada por RT-PCR em 20 linhas de GC, juntamente com as 12 linhas celulares de cancro derivadas de outros órgãos (Figura 1A). Em seguida, dirigiu nossa atenção para o CTSE
, em que expressa tanto em Kato-III e NUGC-4 derivada do tipo sig GC, e também porque ele nunca expressa em MKN-7 e H-111-TC conhecido por ser originado de adenocarcinoma tubular bem diferenciada do estômago (tipo tub1 GC, Documento de suporte S1).

para outros genes examinados, expressão de CDH-1 | ( E- caderina
), relataram que ser frequentemente deficiente em Lauren tipo difuso GC [19], [32], [33], foi inesperadamente detectada nas duas células derivadas do tipo GC-sig (Figura 1A). Foi também inesperado que CDH-17
(
LI-caderina), pensado para ser um gene marcador intestinal [20], [26], [27], expressa em quase todo o linhas celulares de cancro gástrico, incluindo do tipo SIG (Figura 1A). Para outros genes da família catepsina, CTSD
foi relatado para ser altamente expresso no tipo difuso GC e também um parâmetro de prognóstico para pacientes com carcinoma gástrico [23], [34], mas os resultados de RT-PCR revelou que todos as linhas celulares de cancro examinados igualmente expresso CTSD
(Figura 1A). CTSB
e CTSL
foram relatados para ser elevados em carcinoma gástrico [35] e correlacionada com a sua propriedade maligno [36], mas a expressão específica de nenhum CTSB
ou CTSL
em linhas celulares derivadas de GC do tipo SIG poderia ser detectado (Figura 1A). Como um todo, o perfil do CTSE expressão
parece ser bastante diferente de outros genes da família catepsina.

A seguir, avaliou a relação entre a expressão CTCE e tipo histológico de linhas de células 20 GC. Com base na vigilância detalhada das literaturas descritos em "histológica tipo de célula Lines câncer gástrico" do Documento de Apoio S1, 19 linhas de células GC poderiam ser classificados por Lauren e classificação japonesa [3], [4], [5] (Tabela 1) . De acordo com a classificação de Lauren, 7 de 11 tipo difuso células derivadas de GC e 1 de 5 tipo intestinal células derivadas de GC expressar CTSE (Tabela 1): gene CTSE
tende a ser expressa em tipo difuso e deficiente em tipo intestinal GC. Associação entre a expressão CTCE e as características histológicas de malignidade gástrica fica mais clara quando a classificação japonesa mais preciso é aplicada. Entre as linhas de células de tipo difuso GC, é de salientar que NUGC-4 e Kato-III originou-type sig GC fortemente expressar CTCE, enquanto que SH-10-TC e KE-97 originou-type muc GC são deficientes em CTSE expressão. Para as células derivadas do tipo POR GC, o tipo histológico mais frequente de neoplasia gástrica [3], expressão CTCE é diversificada: MKN-45, KE-39, HuG1-PI, HuG1-N, e AGS expressar fortemente CTCE, enquanto GCIY e HGC-27 são deficientes na expressão CTCE. Pelo contrário, entre as linhas de células de tipo GC intestinal de Lauren, nomeadamente tub1 e tub2 de classificação japonesa, MKN-7, H-111-CT, MKN-74, e AZ521 falta expressão CTSE, com uma única excepção de NCI-N87 mostrando a expressão CTSE óbvia.

a partir destes resultados, nós especulamos que a expressão do CTCE é significativamente correlacionada com tipo histológico de câncer gástrico. Para outros tipos raros de linhas de células de GC, MKN-1, 10-ECC e ECC-12 são deficientes na expressão absolutamente CTSE (Figura 1A, Tabela 1).

A expressão de catepsina E (CTSE )
gene é regulada pelo Majorly a transcrição Nível

Usando o gástrico 13, 5 colorrectal, e 2 outras linhas celulares de cancro, a produção de proteína CTSE foi analisada por Western blotting (Figura 1B). 7 das 20 linhas de células foram também avaliados por imuno-histoquímica (Figura S1). Nas análises ambos os CTSE
expressão de mRNA e produção de proteína CTSE foram principalmente acoplado, sugerindo CTSE
expressão é regulada principalmente ao nível da transcrição. Além do mais, tudo-ou-Nenhuma expressão de CTSE mostrado na RT-PCR, transferência de Western, imuno-histoquímica e sugeriram que as células de cancro gástrico seria claramente classificados em duas categorias:. CTSE-expressando tipo e tipo CTSE deficiente

para investigar a regulação da CTSE
gene, duas principais drogas epigenéticas, agente de desmetilação 5-aza-2'-desoxicitidina e inibidor da histona deacetilase tricostatina a [37], foram aplicadas a cinco linhas de células GC (Figura 1C) . Três CTSE-expressar e duas linhas de células GC CTSE com deficiência foram tratadas, mas não conseguimos detectar qualquer mudança de CTSE
transcrição (Figura 1C). Para metilação, que também procurou ilhas CpG na região promotora sugestivo de gene CTSE
usando dois sites humana: "http://www.uscnorris.com/cpgislands2/cpg.aspx" demonstrando pesquisador ilha CpG e " http://www.ncbi.nlm.nih.gov ", apoiado pelo Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (NCBI). Os resultados de ambas as pesquisas sugerem que o promotor humano gene CTSE
é caracterizado por uma menor percentagem de dinucleótidos CpG (55%) e nenhuma ilha CpG, que são consistentes com os nossos resultados (Figura 1C).

Além disso, avaliou-se o efeito de quatro fatores de transcrição que foram relatados para regular muitos genes gastrointestinais: CDX2
[26], [27], gli
família ( Gli1
e
Gli3) [28], e sox2
[29]. Sob a transdução estável de CDX2
, Gli1
, Gli3
, e sox2
, no entanto, não foi possível detectar uma mudança óbvia de CTSE
expressão (Figura 1D). No momento, nós não poderiam elucidar o mecanismo de regulação da gene CTSE
, que deve ser resolvido no futuro.

Catepsina E (CTCE) é definitivamente Expresso em Signet-anel Carcinoma de estômago

Para validar a especulação a partir das linhas celulares de GC (Tabela 1, Figura 1A), que ao lado analisados ​​expressão CTSE em amostras clínicas. Na primeira, foram avaliadas 51 amostras de GC-tipo sig ressecadas cirurgicamente. Surpreendentemente, foi observada coloração da CTSE óbvia em todas as amostras examinadas 51, e em 50 de 51 casos, as células CTSE-positivos ocupada mais do que 90% de células cancerosas no tumor (Tabela 2).

Em seguida, 67 espécimes cirúrgicos derivados de fontes diferentes sig-tipo casos foram analisadas de GC, o qual apresentou vários padrões de expressão CTSE (Tabela 2). CTSE expressão no tipo POR CG estava, obviamente, maior em comparação com outros quatro tipos de GC, que foi muito mais baixa do que a do tipo SIG GC (Tabela 2). Prevalência de células positivas CTCE em tub1-, tub2-, pap-, e do tipo muc GC é certamente inferior, mas não é tão baixo como outros órgãos digestivos normais (Tabela 2). imunocoloração imagens típicas de CTSE em seis tipos de GC são apresentados na Figura 2 (SIG e tub1) e Figura S2 (tub2, PAP, POR, e MUC).

Com base no resultado de espécimes cirúrgicos, que mais expressão CTSE analisados ​​de 84 amostras tumorais gástricas por endoscopia ressecados. Comparado com peças cirúrgicas, a histologia do tecido submetida à ressecção endoscópica é muito mais homogénea; foi dali esperado que a associação entre a expressão CTCE e histologia do câncer gástrico pode ser analisado de forma mais precisa. Eles constituído por 78 casos de adenocarcinoma estágio inicial (7 de sig-type, 52 de tub1-type, 12 de tub2-type, e 7 do tipo pap GC) e 6 casos de adenoma pré-cancerosa (Tabela 3). expressão CTSE de sig-, tub1-, tub2-, e do tipo pap GC nos tecidos por via endoscópica ressecados se assemelha a uns cirurgicamente ressecados com histologia correspondente (Tabelas 2 e 3). Calculadas CTCE pontuações de expressão (Tabela 3) mostram claramente uma tendência que CTSE definitivamente expressa no tipo sig GC enquanto ela tende a ser deficiente em GC tub1- e do tipo tub2. Deve ser também notado que o adenoma gástrico, o que pode ser considerado como uma característica histológica mais diferenciada em comparação com o tipo tub1 GC, mostrou a deficiência de CTSE mais forte (Tabela 3).

CTSE não é apenas um indicador da Signet -ring Carcinoma de estômago, mas também um gástrico Diferenciação marcador

para examinar a distribuição de CTSE no intestino normal e estômago pré-cancerosa, imunocoramento CTCE foi ainda aplicada a barriga não-cancerosas e de outros órgãos do aparelho digestivo. No estômago, sem atrofia e metaplasia intestinal, expressão do CTCE é claramente observado nas glândulas fúndica e pilórica do estômago (Figura S3D /S3A e S3E /S3B). glândulas cardíacas de estômago também expressam CTSE, embora seja um pouco mais fraco do que a expressão nas glândulas fúndicas ou pilórica (Figura S3F /S3C). Contrastivamente, CTSE raramente é expressa no esófago, duodeno, intestino delgado, e intestino grosso (Figura S4).

Foram avaliados ainda expressão CTSE na mucosa gástrica, com metaplasia intestinal, uma condição pré-cancerosa bem conhecido de estômago [26 ], [29], [38]. Como mostrado na Figura 3A, as glândulas gástricas e glândulas fúndicas de metaplasia intestinal exibem coloração, pelo contraste, CTSE. Normalmente, metaplasia intestinal é classificado em duas categorias: tipo misto gástrica e intestinal (tipo incompleto) e tipo exclusivamente intestinal (tipo completa) [29], [38]. Está bem estabelecido que a anterior expressa tanto MUC5AC (gástrico marcador mucina) e MUC2 (mucina intestinal marcador), enquanto a segunda não expressa uma MUC5AC mas MUC2 [29]. Em ambos os tipos de metaplasia intestinal no estômago, que confirmou que a expressão do CTCE é semelhante ao MUC5AC e oposta à MUC2 (Figura 3B e 3C).

Para avaliar a associação de expressão CTSE com expressão MUC5AC e MUC2, a sua imunocoloração foi avaliada estatisticamente usando submetida à ressecção endoscópica 84 tecidos tumorais gástricas (Tabela S2). As análises de correlação mostraram que a expressão CTSE está positivamente associada com o marcador gástrica MUC5AC ( p Art < 0,0001) e negativamente associada com o marcador intestinal MUC2 ( p
= 0,0019). Sinteticamente, concluímos que CTCE, como MUC5AC, é um dos marcadores de diferenciação gástricas.

Mais indiferenciado Tubular Adenocarcinoma tende a surgir do fundo Mucosa com diminuição Tanto "gástrica" ​​e "intestinal" Características

Para investigar a etapa de iniciação de desenvolvimento de neoplasias gástricas, a mucosa do câncer precoce e adenoma de fundo também foi avaliada, usando 84 amostras por via endoscópica ressecados. CTSE expressão da mucosa gástrica não-canceroso adjacente à lesão tumoral foi avaliada, juntamente com MUC5AC e MUC2 (Tabela 4). Para tipo SIG GC, tanto a lesão tumoral e da mucosa do fundo mostrou principalmente forte expressão de CTSE e MUC5AC, enquanto que a expressão de MUC2 era muito fraco em ambos (Tabela 4). padrões de expressão semelhantes dos três marcadores no tumor e na mucosa adjacente sugerem que a iniciação do tipo SIG GC reflecte as características da mucosa do fundo, a partir da vista de diferenciação "gástrica" ​​e "intestino". Isto é, do tipo sig GC com propriedades gástricos não-intestinais inicialmente ocorre a partir da mucosa fundo com recursos não-intestinais e gástricas.

Para adenoma gástrica e adenocarcinoma tubular (tipo tub2 tub1 /GC), contrastivamente, perfis das três marcadores de expressão são muito interessante (Tabela 4). tumores gástricos mais indiferenciados tendem a aumentar a expressão de CTSE e MUC5AC em lesões tumorais (tub2 > tub1 > adenoma), mas diminuição da expressão destes marcadores na mucosa gástrica fundo (tub2 < tub1 < adenoma). Estes sugerem que tumores gástricos (portanto, mais maligno) de mais indiferenciadas aptos a mostrar a propriedade gástrica mais forte, enquanto eles tendem a surgir a partir da mucosa fundo com diminuição características gástricas. Por outro lado, os tumores gástricos mais diferenciados tendem a expressar MUC2 em ambas as lesões tumorais e na mucosa do fundo (adenoma > tub1 > tub2). Isto sugere que a diferenciação intestinal de fundo mucosa gástrica leva aos tumores no intestino diferenciadas (portanto, menos malignos) gástricos.

Por tipo pap GC, expressões do CTCE, MUC5AC e MUC2 foram consideravelmente forte, tanto na lesão tumoral e mucosa circundante, que são bastante diferentes dos padrões de tub1 /-tub2 tipo GC (Tabela 4) expressão. -Type Pap GC é classificada em tipo intestinal de Lauren juntamente com tub1 /tipo tub2 GC, mas nossas análises atuais sugerem que pap-tipo e tub1 /tipo tub2 GC não deve tratados da mesma categoria, do ponto de vista gástrica e intestinal características. Em nossos relatórios anteriores analisando Brm
[3], um possível gene marcador chave de diferenciação intestino, expressão de Brm em gástrica adenocarcinoma papilar (PAP) é bastante diferente do adenocarcinoma tubular de estômago (tub1 e tub2). No momento, estamos convencidos de que a diferença histológica entre tipo pap GC e tub1 /tipo tub2 GC devem ser rigorosamente reconhecido.

Discussão

Funções e Regulamento de Catepsina E (CTCE) na estômago humano

a catepsina E (CTSE), uma protease aspártica intracelular não-lisossomal, é uma das proteases da família catepsina [39], [40]. Outra protease aspártica cathespin D (CTSD), um homólogo de CTSE, representa uma actividade proteolítica maior no componente lisossomal, mas os papéis funcionais de CTSE não foram elucidados [24], [39]. Distribuição de ambas as proteinases é muito diferente: CTSD é universalmente existia nos lisossomas de vários tecidos (consistente com o resultado na Figura 1A), ao passo que CTSE é expresso principalmente nas células do sistema imunológico, tais como macropahges, linfócitos, células dendríticas, etc [39 ]. Expressão de CTSE no estômago também tem sido relatada [23], [24], embora a função fisiológica e patológica da CTSE gástrico é actualmente desconhecido [39], [40]. No presente estudo avaliando como muitos como 202 amostras gástricas clínicos, mostrou claramente CTCE é tanto o marcador gástrica diferenciação e o marcador de carcinoma gástrico anel de sinete, mas o significado da expressão CTSE gástrica permanece incerto.

Para analisar a relação de expressão CTCE e potencial oncogênico, que produziu o vector retroviral baseado em MuLV [26] que gene CTSE
e traduzidas-lo nas linhas celulares de cancro CTSE deficientes gástricas: MKN-74, SH-10 -TC, e MKN-1. Nós avaliamos a possibilidade de alterar a produção de mucina gástrica (Figura S5) ou suas alterações morfológicas, mas não foi observada nenhuma alteração. Usando estas linhas celulares estabelecidas, foram realizados mais dois a formação de colónias em agar mole [30] e a indução de apoptose por tratamento de actinomicina D, camptotecina, e estaurosporina [41]. No entanto, foi possível detectar o efeito de expressão em CTSE nem o crescimento independente de ancoragem, nem a resistência à apoptose induzida por drogas (dados não mostrados)

No estudo recente, foi relatado CTSE ter algum potencial anti-oncogénica.: Kawakubo et ai. demonstraram que
CTSE induz especificamente a paragem do crescimento e apoptose em linhas celulares de cancro da próstata humano, catalisando a libertação proteolítica do ligando indutor de apoptose relacionado com o factor de necrose tumoral solúvel (TRAIL) da superfície da célula [42 ]. No entanto, os ratinhos deficientes em CTSE fez nem fenótipo do cancro propensas exibem nem distúrbios gástricos presentes óbvias [43], [44], [45]. Actualmente, é uma questão de conjectura se a atividade antitumoral relatado de CTSE poderia aplicar câncer gástrico incluindo carcinoma de células em anel de sinete. Juntamente com a sua regulação unelucidated e função fisiológica, os efeitos do CTCE sobre a diferenciação gástrica e tumorigênese são problemas fundamentais que devem ser resolvidos no futuro.

gástrica cancerização do Ponto de Vista "gástrica" ​​e "intestinal" Propriedade de fundo

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