PLoS ONE: katepsiini E on merkki Mahalaukun Differentiation ja Signet-Ring Cell karsinooma Maha A Novel ehdotukseni Mahalaukun Tumorigenesis

tiivistelmä

Mahasyöpää (GC) esittelee erilaisia ​​histologisia piirteitä, vaikka mekanismi taustalla sen monimuotoisuus on harvoin selvitetty. Se on pääasiassa luokiteltu hyvin eriytetty putkimainen adenokarsinooma (tub1), kohtuullisesti erilaistunut putkimainen adenokarsinooma (tub2), huonosti eriytetty adenokarsinooma (por), sinettisormus-rengas cell carcinoma (sig), mucinous adenokarsinooma (MUC), ja papillaarinen adenokarsinooma (PAP). Seulomalla, löysimme katepsiini E (CTSE) B ilmaisee yleisesti in sig-tyyppinen, toisinaan por-tyyppinen, ja harvoin tub1 /tub2-tyyppinen GC solulinjoja. Kirurgisesti-resektoitiin yksilöitä, CTSE immunovärjättiin in 50/51 sig-tyyppinen (98,0%), 3/10 tub1-tyyppinen (30,0%), 7/18 tub2-tyyppinen (38,9%), 15/26 por-tyyppi ( 57,7%), 4/10 pap-tyyppi (40,0%), ja 0/3 muc-tyyppi (0,0%) GC. In endoskooppisesti-resektoitiin yksilöitä, 6/7 sig-tyyppinen (85,7%), 7/52 tub1-tyyppinen (13,7%), 5/12 tub2-tyyppinen (41,7%), 2/7 pap-tyyppinen (28,6%) GC ja 0/6 adenooma (0,0%) ilmaistuna CTSE. Ei-pahanlaatuinen kudosten, CTSE yleismaailmallisesti ilmentyy normaaleissa fundic, mahanportin ja sydämen rauhaset mahalaukun, mutta tuskin muissa ruoansulatuskanavan. Vuonna precancerous suoliston metaplasiaa mahan, CTSE on havaittavissa pääasiassa seka mahalaukun-ja-suolikanavan tyyppi ja puutteellinen yksinomaan suoliston tyyppiä. CTSE ilmentyminen korreloi positiivisesti mahalaukun merkki MUC5AC ( p
< 0,0001) ja korreloi negatiivisesti suoliston merkki MUC2 ( p
= 0,0019). Sillä sig-tyyppinen GC, sekä kasvaimia ja tausta limakalvo, MUC5AC ja CTSE on korkea kun taas of MUC2 on alhainen, mikä osoittaa, että sig-tyyppinen GC heijastaa ominaisuudet tausta limakalvon. Mahalaukun adenooma ja tub1 /tub2-tyyppinen GC, lisää eriytymättömiä kasvaimet näyttäisikin korkeampi ilmentyminen CTSE kanssa MUC5AC ja alemman ilmentymistä MUC2 kasvaimissa, mutta ne ovat yleensä esittää alemman ilmaisua CTSE, MUC5AC ja MUC2 taustalla limakalvolla. Nämä viittaavat siihen, että enemmän pahanlaatuisia mahalaukun adenokarsinoomaa vahvempi maha- ja heikompi suoliston ominaisuudet ovat yleensä syntyy taustan limakalvon vähentynyt sekä mahalaukun ja suoliston toimintoja. Lopuksi CTSE on merkki sekä mahalaukun erilaistumista ja sinettisormus-rengas karsinooma, jonka pitäisi valottaa mekanismi mahalaukun kasvaimen kehittymisen.

Citation: Konno-Shimizu M, Yamamichi N, inada Ki, Kageyama- YAHARA N, Shiogama K, Takahashi Y, et ai. (2013) katepsiini E Onko Marker Mahalaukun Differentiation ja Signet-Ring Cell karsinooma Maha A Novel ehdotukseni Mahalaukun kasvaimien syntyyn. PLoS ONE 8 (2): e56766. doi: 10,1371 /journal.pone.0056766

Editor: Anthony W. I. Lo, Kiinan University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 20 marraskuu 2012; Hyväksytty: 14 tammikuu 2013; Julkaistu: 22 helmikuu 2013

Copyright: © 2013 Konno-Shimizu et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain avustusta Sato Memorial Foundation for Cancer Research, osittain tutkimus avustusta Nakayama Cancer Research Institute, osittain tutkimus apuraha Foundation edistämiseksi Cancer Research, ja myös osittain Grant-in- tukea nuorten tutkijoiden (B) opetus-, kulttuuri-, urheilu-, tiede ja teknologia (MEXT). Mutta kaikki rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahasyöpää (GC) on neljänneksi yleisin syöpä ja toiseksi syy syövän liittyvät kuolemat maailmanlaajuisesti, vaikka aleneminen asteittain sen ilmaantuvuutta ja kuolleisuutta [1], [2]. On tunnettua, että mahalaukun pahanlaatuisen esittelee erilaisia ​​histologisia piirteitä [3]. Laajimmin käytetty luokittelu mahasyöpä on Lauren luokitus, joka erottaa suoliston (eriytetty) tyyppi GC ja hajanainen (eriyttämätön) tyyppi GC [4]. Lauren kirjoittaminen on tavallinen ja helppo ymmärtää, vaikka sen yksinkertaistamista johtaa usein kyvyttömyys heijastaa täsmälliset ominaisuudet mahalaukun pahanlaatuisen [3]. Vuonna yksityiskohtaisemmat Japani luokitusta mahasyövän [5], joka on samanlainen kuin WHO: n luokituksen [6], mahalaukun adenokarsinooman luokitellaan kuuteen ryhmään: hyvin eriytetty putkimainen adenokarsinooma (tub1), kohtuullisesti erilaistunut putkimainen adenokarsinooma (tub2), huonosti eriytetty adenokarsinooma (por), sinettisormus-rengas cell carcinoma (sig), mucinouse adenokarsinooma (MUC), ja papillaarinen adenokarsinooma (pAP). Yleisesti ottaen Lauren n diffuusi (eriyttämätön) tyyppi sisältää por-, merkit- ja MUC-tyypin GC, kun taas Lauren n suoliston (eriytetty) tyyppi käsittää tub1-, tub2- ja pap-tyypin GC [3].

eri histologinen GC tyyppejä, keskityimme sinettisormus-rengas cell carcinoma (SRCC) mahalaukun (sig-tyyppinen GC). SRCC on limaa erittävä adenokarsinooma, jossa intracytoplasmic mukiinia pakkaa tumansa antaa solujen ominaisuus "sinettisormus-rengas" ulkonäkö [7]. Vaikka SRCC on raportoitu olevan peräisin eri kudoksista, vatsa on yleisin elin alkuperä [7], [8]. Vaikka usein esiintyvyys SRCC keskuudessa mahasyöpäriskiin, kliinis piirteitä sig-tyyppinen GC ovat edelleen kiistanalaisia; Joissakin aiemmissa tutkimuksissa on raportoitu, että sinettisormus-rengas solu histologia esittelee parempi ennuste [9], [10], [11], kun taas muut tutkimukset raportoitu, että histologia SRCC on merkki melko huonompi ennuste [8], [12], [ ,,,0],13], [14]. Tällaisessa tausta, yritimme löytää uusia erityisiä markkerigeenejä sig-tyypin GC. Useimmissa aiemmissa tutkimuksissa [15], [16], [17], sig-tyyppinen GC oli analysoitu yhdessä por-tyypin ja MUC-tyyppinen, koska näiden kolmen GC on luokiteltu Laurenin hajanainen tyyppi. Kuitenkin, monet raportit ehdotti, että sig-tyyppinen GC on aivan eri por- tai muc-tyypin GC näkökulmasta molekyyli- piirteitä tai pahanlaatuinen potentiaalit [3], [13], [18]. Siksi olemme analysoineet sig-tyyppinen GC riippumatta Por- ja MUC-tyypin GC.

joukossa suuri määrä geenejä, me seulotaan useita mekanismeja, kuten kadheriini
perhe geenejä [19 ], [20], ihmisen musiinituoton
geenejä [21], vimentiinista
[22], katepsiini
perhe geenejä [23], [24], [25] jne, jonka ilmaisuja on raportoitu olevan erilaiset Laurenin suoliston ja hajanainen tyyppi GC. Päätarkoituksena Tutkimuksemme on löytää vihjeen ratkaisematta karsinogeneesi of sig-tyyppinen GC määrittelemällä sen erityinen markkerigeeni. Odotimme, että kokeilu johtaisi tuntematon ylävirran säätelygeeneissä (kuten tiettyjen transkriptiotekijöiden) määritetään ominaisuudet sig-tyyppinen GC. Jotkut transkriptiotekijät liittyvät ruoansulatuskanavan ominaisuuksia on selvitetty esimerkiksi cdx
perhe geenejä [26], [27], gli
perhe geenejä [28], ja Sox2
[29], mutta uskomme, ei muutama ratkaiseva geenejä maha erilaistumiseen ja mahalaukun syövän synnyn edelleen löytämättä. Toinen tutkimuksen tarkoituksena on analysoida hyvin varhaisessa vaiheessa mahalaukun kasvaimen kehittymisen perusteella ilmaus tunnistettu uusia markkerigeeni. Ei vain keskittymällä sig-tyypin GC, me edelleen haastoi arvioimaan kaikenlaisia ​​varhain GC tapauksia analysoimalla tunnistettu markkerigeeni ilmentymistä sekä kasvainleesion ja viereisen limakalvon. Olemme vakuuttuneita työmme pitäisi olla avain lähestyy kiistanalainen ominaisuudet sig-tyyppinen GC, ja myös pitäisi olla lukemiin valaisemaan eri histologisia ominaisuuksia mahalaukun pahanlaatuisen.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

Kaksikymmentä mahalaukun, kymmenen peräsuolen, ja kaksi ei-maha-syöpäsolulinjoja pidettiin DMEM: ssä, jossa oli 10% vasikan sikiön seerumia (Gibco /Invitrogen, Carlsbad, CA) 37 ° C: ssa [30], [31]. Kaikki solulinjat ostettiin American Type Culture Collection, RIKEN Cell Bank, tai Cell Resource Center for Biomedical Research Institute of Development, ikääntymisen ja syövän yhteys, Tohoku University. Nimet ja histologisia tyyppejä käytetään syövän solulinjoja on kuvattu minutely tukemisessa Document S1. DNA demetylaatio reagenssia ja histonideasetylaasi (HDAC) estäjä, 5-atsa-2'-deoksisytidiini (5-atsa-dC, Sigma-Aldrich) 2 ug /ml tai trikostatiini A (TSA, Sigma-Aldrich) 100 ng /ml lisättiin elatusaineeseen.

RT-PCR

Yhteensä solu-RNA: t valmistettiin käyttämällä ISOGEN RNA: n eristämistä reaent (Wako, Osaka, Japani), kuten aiemmin on kuvattu [30]. Semi-kvantitatiivinen RT-PCR tehtiin kautta Superscript One-Step-reaktiossa käyttäen Platinum Taq (Gibco /Invitrogen). Alukeparit ja RT-PCR-menettelyjä käytetään havaitsemaan ekspressiotasoja E-kadheriinin (CDH-1) B, LI-kadheriinin (CDH-17) B, MUC5AC
, MUC6
, MUC2
, CTSE (katepsiini E) B, CTSD (Cathepsin D) B, CTSB (katepsiini B) B, CTSL (katepsiini L) B, ja GAPDH
on esitetty taulukossa S1.

Western-blottaus

kokosoluekstraktien (20 ug kutakin) hajotettiin ja keitettiin 1x Näytepuskuriin [30] erotettiin elektroforeesilla 12,5% SDS-polyakryyliamidigeeleillä, siirrettiin nitroselluloosakalvolle (Hybond-N, Amersham, Freiburg, Saksa), ja immunovärjättiin anti-ihmisen katepsiini E vasta-ainetta (# AF1294, R &D Systems, Minneapolis, MN) tai anti-ihmisen β-aktiini (C4) vasta-aineen (# sc-47778, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Toisen vasta-aineita, piparjuuriperoksidaasi (HRP) konjugoitua anti-vuohi lgG: llä (H + L) aasi-vasta-ainetta (ˁ-035-003, Jackson, Baltimore, PA) ja piparjuuriperoksidaasi (HRP) konjugoitua anti-hiiri-IgG (H + L) vuohen vasta-ainetta (# A90-216P, BETHYL, Montgomery, TX) käytettiin vastaavasti. Erityisiä juovat tunnistettiin Immunostar LD (Wako, Osaka, Japani) ja LAS-4000 (Fuji Film, Tokio, Japani).

immunohistokemia

Deparaffinization ja endogeeninen peroksidaasi inaktivaation kliinistä kudoksista tehtiin kuten aiemmin on kuvattu [3]. Varten CTSE, ensisijainen immunovärjäys anti-ihmisen CTSE vuohen polyklonaalinen vasta-aine (# AF1294, R &D Systems) kanssa 1:100 laimennus suoritettiin 16 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Pesun jälkeen PBS: ssä (fosfaatti-puskuroitu-suolat) kolme kertaa, toisen immunovärjäytyminen, jossa Histofine Simple Stain MAX-PO (G) (Nichirei, Tokio, Japani) suoritettiin 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Pesun jälkeen PBS: ssä kolme kertaa, reaktiotuotteet visualisoitiin 20 mg /dl 3,3'-diaminobentsidiinitetrahydrokloridilla liuos, joka sisältää tippa 30% H _{2O 2, jonka jälkeen pesu PBS: llä. Nuclear counterstaining toteutettiin Mayerin hematoxilin. MUC5AC: lle ja MUC2, sammutettua kuumentamalla 1 mM EDTA-puskuriin (pH 8,0), 120 ° C: ssa ensin suoritetaan paineen liesi (delicio 6L; T-FAL, Rumily, Ranska) 10 minuuttia antigeenin haku. Ensisijainen Immunovärjäyksen anti-MUC5AC-vasta (NCL-MUC-5AC, Novocastra, Newcastle-upon-Tyne, UK) kanssa 1:200 laimennus tai anti-MUC2 vasta-aine (NCL-NUC-2, Novocastra) noin 1:500 laimennus suoritettiin 16 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Pesun jälkeen PBS: ssä kolme kertaa, toisen immunovärjäytyminen, jossa Histofine Simple Stain MAX-PO (G) (Nichirei) suoritettiin 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Seuraava vaihe oli sama kuin CTSE immunologinen värjäys. Kaikki immunovärjättiin kohdat arvioitiin itsenäisesti kaksi patologia sekä HE-värjätään ja PAS leikkeitä samasta vaurioita.}

kasvainnäytteestä

Niistä mahasyövän kudoksia kallisteta klo Fujita Health University School of Medicine, valitsimme 51 mahalaukun sinettisormus-rengas cell carcinoma (sig) näytteet kirurgisesti resekoitu. Lisäksi 67 mahasyövän kirurgisista näytteistä muiden viisi eri mahalaukun adenokarsinooman (tub1, tub2, por, pap, ja MUC) valittiin satunnaisesti samassa pankissa. Sillä endoskooppisesti resektoitiin näytteet, valitsimme 84 yksilöt (78 mahalaukun syöpätapausta ja 6 mahalaukun adenooma tapausta) hoidetuilla Tokion yliopiston sairaalan vuodesta 2005 vuoteen 2011. Kaikista kliinisistä näytteistä, kirjallinen tietoon perustuva suostumus saatiin vastaavista potilaista mukaan Helsingin julistuksen. Tutkimus hyväksyi institutionaalisten eettisen Review Board ihmisille tutkimat Fujita Health University, ja hyväksyi myös eettisen valiokuntien Tokion yliopiston.

retrovirusvektorit

Voit luoda retrovirusvektoreilla ekspressoivat Cdx2
, Gli1
, Gli3
, CTSE
, ja Sox2
, vastaavat cDNA insertoitiin pMXs-IRES -puro (Cell Biolabs Inc., San Diego, CA) seuraavasti. Sillä Cdx2
, pMXs-Cdx2-IRES-puro synnytettiin kuten on raportoitu aiemmin [26]. Gli1
cDNA saatiin pCR-XL-TOPO-Gli1 (Open Biosystems, Huntsville, AL) kautta PCR-monistuksella käyttäen alukkeita 5'-agccagatctatgagcccatctctgggattc-3 'ja 5'-agtagcggccgcccctactctttaggcactagagt-3'. Sen jälkeen, kun kahden digestion Bglll ja NotI, saatu fragmentti insertoitiin BamHI /Not I -kohtaan pMXs-IRES-Puro (Cell Biolabs Inc., San Diego, CA) tuottaa pMXs-Gli1-IRES-puro. Gli3
cDNA saatiin pCR-XL-TOPO-Gli3 (Open Biosystems) kautta PCR-monistuksella käyttäen alukkeita 5'-aatgcggccgctgatttccgttggt-3 'ja 5'-tgcggatcctacgtgggcatttttg-3'. Sen jälkeen, kun kahden digestion BamH I: n ja Not I saatu fragmentti insertoitiin BamHI /Not I-kohtiin pMXs-IRES-Puro tuottaa pMXs-Gli3-IRES-puro. CTSE
cDNA saatiin pCMV-SPORT6-CTSE (Thermo Fisher Scientific, Madison, WI) kautta PCR-monistuksella käyttäen alukkeita 5'-ccgagatctatgaaacgctccttcttttg-3 'ja 5'-gggctcgagtaaaactgtcgaatgaaga-3'. Sen jälkeen, kun kahden digestion Bglll ja Xhol, saatu fragmentti insertoitiin BamHI /XhoI-kohtiin pMXs-IRES-Puro tuottaa pMXs-CTSE-IRES-puro. Sox2
cDNA saatiin MKN-7 genomisen DNA: n PCR: llä-monistuksella käyttäen alukkeita 5'-atgtacaacatgatggagacggagct-3 'ja 5'-tcacatgtgtgagaggggcagtgtg-3'. Monistettu fragmentti insertoitiin EcoRI-V sivustoja pT7Blue-T vektoriin (Novagen, Darmstadt, Saksa) tuottaa pT7Blue-Sox2. Sen jälkeen, kun kahden digestion BamH I ja Sai I, saatu fragmentti insertoitiin BamHI /XhoI-kohtiin pMXs-IRES-Puro tuottaa pMXs-Sox2-IRES-puro. Transfektoimalla nämä plasmidit kanssa rakkulasuutulehdusvirusta kirjekuori G-proteiini (VSV-G) ekspressioplasmidin osaksi PLAT-GP valmiiksi pakattu solulinja (Cell Biolabs Inc.) vastaavasti, VSV-G-pseudotyypitettyä MuLV-pohjainen retrovirus ilmentävät Cdx2
, Gli1
, Gli3
, CTSE
, ja Sox2
valmistettiin.

tulokset

ilmentäminen katepsiini E (CTSE) B on korreloi merkitsevästi alkunsa histologinen tyyppi mahasyövän solulinjojen

Voit etsiä markkerigeenejä sig-tyypin GC, me seulotaan ilmaus useiden geenien raportoitu näyttää erottuva ilme välillä Laurenin suoliston ja hajanainen tyyppi GC. Expression of E-kadheriinin
( CDH-1
) [19], LI-kadheriinin
( CDH-17
) [20], MUC5AC
[21], MUC6
[21], MUC2
[21], vimentiinista
[22], CTSD
( katepsiini D
) [23], [24], CTSE
( katepsiini E
) [23], [24], CTSB
( katepsiini B
) [25], CTSL
( katepsiini L
) [25], ja GAPDH
(sisäinen kontrolli) geenejä arvioidaan RT-PCR: llä 20 GC linjat yhdessä 12 syöpäsolulinjoissa, jotka ovat peräisin muista elimistä (kuvio 1A). Sitten suunnattu huomiomme CTSE
, sillä se ilmentää sekä Kato-III ja NUGC-4 peräisin sig-tyypin GC, ja koska se ei koskaan ilmaisee MKN-7 ja H-111-TC tiedettiin peräisin hyvin eriytetty putkimainen adenokarsinooma mahaan (tub1-tyyppinen GC, tositteet S1).

muille tutkitaan geenien ilmentyminen CDH-1
( E- kadheriini
), on raportoitu olevan usein puutteellinen Lauren diffuusi tyyppi GC [19], [32], [33], on yllättäen havaittu kaksi sig-tyypin GC peräisin olevia soluja (kuvio 1A). Oli myös odottamatonta, että CDH-17
( LI-kadheriinin
), ajatellaan olevan suoliston markkerigeeni [20], [26], [27], ilmaisee lähes kaikissa mahasyöpä solulinjojen sig-tyypin (kuvio 1A). Muiden katepsiini perheen geenejä, CTSD
on raportoitu olevan erittäin ilmaistaan ​​diffuusi tyyppi GC ja myös prognostiset parametrin mahakarsinoo- potilaille [23], [34], mutta tulokset RT-PCR osoitti, että kaikki tutkituista syöpäsolulinjoja yhtä nimenomaista CTSD
(kuvio 1A). CTSB
ja CTSL
raportoitu olevan koholla mahakarsinoo- [35] ja korreloi sen pahanlaatuinen ominaisuus [36], mutta erityinen ilmaisu ei CTSB
tai CTSL
in sig-tyypin GC-solulinjoissa voitiin havaita (kuvio 1A). Kokonaisuutena ilmaisu profiilia CTSE
näyttää olevan aivan erilainen kuin muut katepsiini perheen geenejä.

vieressä arvioinut suhdetta CTSE ilmaisun ja histologinen tyyppi 20 GC solulinjoissa. Perustuvat yksityiskohtaisiin valvonnasta kirjallisuutta kuvattu "histologinen tyyppi mahasyövän Cell Lines" Tukiviestintämenetelmä Document S1, 19 GC solulinjoja voitaisiin järjestellä Lauren ja Japani luokittelu [3], [4], [5] (taulukko 1) . Mukaan Lauren luokitusta, 7 11 hajanainen tyyppi GC peräisin olevia soluja ja 1 5 suolen tyyppiä GC-johdetut solut ilmentävät CTSE (taulukko 1): CTSE
geenin yleensä ilmaistaan ​​diffuusi tyyppi ja puutteellinen suoliston tyyppi GC. Association välillä CTSE ilmaisun ja histologinen ominaisuus mahalaukun pahanlaatuisen kirkastuu, kun tarkempi Japani luokitusta sovelletaan. Niistä solulinjoja hajanainen tyyppi GC, on huomionarvoista, että NUGC-4 ja Kato-III peräisin sig-tyyppinen GC voimakkaasti ilmaista CTSE, kun taas SH-10-TC ja KE-97 peräisin MUC-tyyppinen GC ovat puutteellisia CTSE ilmaisu. Sillä peräisin olevia soluja por-tyyppinen GC, yleisin histologinen tyyppi mahalaukun pahanlaatuisen [3], CTSE ilme on monipuolinen: MKN-45, KE-39, HuG1-PI, HuG1-N, ja AGS voimakkaasti ilmaista CTSE, kun taas GCIY ja HGC-27 ovat puutteellisia CTSE ilme. Päinvastoin, joukossa solulinjoja Lauren suoliston tyyppi GC, eli tub1 ja tub2 ja Japanin luokittelu, MKN-7, H-111-TC, MKN-74, ja AZ521 puuttuu CTSE ilmaisu, yhtä poikkeusta lukuun ottamatta NCI-N87 näkyvää CTSE ilme.

näiden seurauksena olemme arveltu, että ilmentyminen CTSE merkittävästi korreloi histologinen tyyppi mahasyövän. Muiden harvinaisia ​​GC solulinjojen, MKN-1, ECC-10, ja ECC-12 ovat ehdottoman puutteellisia CTSE ilmaisu (kuvio 1A, taulukko 1).

ilmentäminen katepsiini E (CTSE )
Gene on säädelty aikuinen on Transcription tason

käyttäen 13 mahalaukun, 5 peräsuolen, ja 2 muuta syövän solulinjat, CTSE proteiinin tuotantoa analysoitiin Western blottauksella (kuvio 1 B). 7 20 solulinjoja arvioitiin myös immunohistokemia (kuvio S1). Vuonna molemmissa analyyseissä CTSE
mRNA ilmaisun ja CTSE proteiinin tuotanto käytti enimmäkseen kytketty viittaa CTSE
ilmentymistä pääasiassa säädellään transkription tasolla. Sitä paitsi, kaikki-tai-ei mitään ilmentymistä CTSE esitetty RT-PCR, Western blotting ja immunohistokemia ehdotti, että mahalaukun syöpäsolut olisi selvästi luokitella kahteen ryhmään: CTSE ilmentäviä tyypin ja CTSE-geenittömän.

tutkia sääntely CTSE
geeni, kaksi suurta epigeneettiset huumeet, demetyloivan agentti 5-atsa-2'-deoksisytidiini ja histonideasetylaasi estäjä trikostatiini [37], levitettiin viisi GC solulinjoja (kuvio 1 C) . Kolme CTSE ilmentäviä ja kaksi CTSE puutteesta GC solulinjat käsiteltiin, mutta emme pystyneet havaitsemaan muutokset CTSE
transkriptio (kuvio 1 C). Metylaation, myös etsinyt CpG saaria viittaavia promoottorialueen ihmisen CTSE
geeni kahdella sivustot: "http://www.uscnorris.com/cpgislands2/cpg.aspx" osoittavat CpG-saarekkeen etsijä ja " http://www.ncbi.nlm.nih.gov "tukee National Center for Biotechnology Information (NCBI). Tulokset sekä hakuja ehdotti, että promoottori ihmisen CTSE
geeni on ominaista alhaisempi CpG dinukleotidien (55%) ja ei-CpG-saarekkeen, jotka ovat yhdenmukaisia ​​tuloksemme (kuvio 1 C).

lisäksi arvioimme vaikutus neljän transkriptiotekijöiden, jotka on ilmoitettu säätelemään monien ruoansulatuskanavan geenejä: cdx2
[26], [27], gli
perhe geenejä ( gli1
ja Gli3
) [28], ja Sox2
[29]. Alle vakaa transduktion cdx2
, gli1
, Gli3
, ja Sox2
kuitenkaan Emme havainneet selvää muutosta CTSE
ilmaisu (kuvio 1 D). Tällä hetkellä emme voi valaista sääntelymekanismi on CTSE
geeniä, jotka olisi ratkaistava tulevaisuudessa.

katepsiini E (CTSE) on ehdottomasti Ilmaistuna Signet-rengas Cell karsinooma Vatsa

validoimiseksi keinottelun GC solulinjoista (taulukko 1, kuvio 1A), me seuraavaksi analysoidaan CTSE ilmaisun kliinisistä näytteistä. Aluksi 51 sig-tyyppinen GC näytteet kirurgisesti resekoituun arvioitiin. Silmiinpistävän selvää värjäytyminen CTSE havaittiin kaikissa 51 näytteet tutkitaan, ja 50 51 tapauksessa, CTSE-positiivisten solujen käytössä yli 90% syöpäsolujen kasvain (taulukko 2).

Seuraavaksi 67 kirurgisista näytteistä, jotka ovat peräisin GC muissa kuin sig-tyypin analysoitiin, joka esitetään erilaisia ​​malleja CTSE ilmentymisen (taulukko 2). CTSE ilmentyminen por-tyypin GC ilmeisesti korkeampi verrattuna muihin neljä GC, vaikka se oli paljon pienempi kuin sig-tyypin GC (taulukko 2). Esiintyvyys CTSE positiivisten solujen tub1-, tub2-, pap-, ja muc-tyypin GC on varmasti pienempi, mutta se ei ole niin alhainen, että muita tavanomaisia ​​ruoansulatuskanavan elimissä (taulukko 2). Tyypillisiä immunovärjäystä kuvia CTSE kuudessa tyyppisiä GC esitetään kuvassa 2 (sig ja tub1) ja kuvassa S2 (tub2, papa, por, ja MUC).

tuloksen perusteella kirurgisten näytteiden olemme edelleen analysoidaan CTSE ilmentyminen 84 endoskooppisesti resektoitiin mahakasvaimen näytteitä. Verrattuna kirurgisesti yksilöitä, histologia tähystyksessä resektoitiin kudos on paljon homogeeninen; se oli sieltä odotettavissa, että yhdistyksen välillä CTSE ilmaisun ja histologia mahasyövän voitaisiin analysoida tarkemmin. Ne koostuvat 78 tapausta varhaisessa vaiheessa adenokarsinooma (7 sig-tyyppi, 52 tub1-tyyppi, 12 tub2-tyyppi, ja 7 pap-tyypin GC) ja 6 tapauksissa prekanseroosisten adenooma (taulukko 3). CTSE ilmentymä merkittä-, tub1-, tub2- ja pap-tyyppinen GC endoskooppisesti resektoitiin kudoksissa muistuttaa kirurgisesti resektoitiin niitä vastaaviin histologia (taulukot 2 ja 3). Laskettu CTSE ilmaisun tulokset (taulukko 3) osoittavat selvästi taipumus että CTSE ehdottomasti ilmaisee sig-tyyppinen GC taas se on yleensä puutteellinen tub1- ja tub2-tyypin GC. Olisi myös huomattava, että mahalaukun adenooma, jota voidaan pitää eriytetympää histologinen ominaisuus verrattuna tub1-tyypin GC osoitti vahvin puutos CTSE (taulukko 3).

CTSE ei ole vain osoitus Signet -sormus Cell karsinooma vatsa, mutta myös mahalaukun Differentiation Marker

tarkastella jakautumista CTSE normaalissa suolistossa ja precancerous vatsa, immunovärjäyksen CTSE edelleen sovellettu ei-syöpä mahan ja muut ruoansulatuskanavan elimissä. Vatsassa ilman surkastumista ja suoliston metaplasiasta ilmaus CTSE on selvästi havaittavissa fundic ja mahanportin rauhaset mahalaukun (kuva S3D /S3A ja S3E /S3B). Sydämen rauhaset mahalaukun myös ilmaista CTSE, vaikka se on pikemminkin heikompi ilmentyminen fundic tai mahaportin rauhaset (kuvio S3F /S3C). Contrastively, CTSE harvoin ilmaistaan ​​ruokatorven, pohjukaissuolessa, ohutsuolessa, ja paksusuoli (kuva S4).

arvioitiin edelleen CTSE ilmaisun mahan limakalvoa suoliston metaplasiaa, tunnettu verisyövän esiaste mahan [26 ], [29], [38]. Kuten kuviossa 3A on esitetty, mahalaukun fundic rauhaset ja suoliston metaplastiset rauhaset näytteille kontrastiiviseen värjäytymistä CTSE. Tyypillisesti suoliston metaplasiaa luokitellaan kahteen luokkaan: mixed mahalaukun-ja-suolikanavan tyyppi (epätäydellinen tyyppi) ja ainoastaan ​​suolen tyyppi (täydellinen tyyppi) [29], [38]. Se on vakiintunut, että entinen yksi ekspressoi sekä MUC5AC (mahan markkeri musiinia) ja MUC2 (suoliston merkki musiinigeenit), kun taas jälkimmäinen ilmaisee ei MUC5AC vaan MUC2 [29]. Molemmissa suolen metaplasiaa vatsassa, olemme vahvistaneet, että ilmaus CTSE on samanlainen MUC5AC ja vastapäätä MUC2 (kuvio 3B ja 3C).

arvioimiseksi yhdistys CTSE ilmaisutapoja MUC5AC ja MUC2 ilme, niiden immunovärjäyksellä arvioitiin tilastollisesti käyttämällä endoskooppisesti resektoitiin 84 mahakasvaimen kudoksissa (taulukko S2). Korrelaatio analyysit osoittivat, että CTSE ilmentyminen positiivisesti liittyy mahan merkki MUC5AC ( p
< 0,0001) ja negatiivisesti yhteydessä suoliston merkki MUC2 ( p
= 0,0019). Synteettisesti päättelimme, että CTSE, kuten MUC5AC, on yksi mahalaukun Differentiaatiomarkkerien.

Lisää Eriyttämätön Tubular Adenokarsinooma Taipumus syntyvät Tausta limakalvon kanssa laski sekä "mahalaukun" ja "suoliston" Ominaisuudet

tutkimiseksi aloittamisesta vaihe mahalaukun tuumorigeneesiprosessin taustalla limakalvon varhaisen syövän ja adenooma arvioitiin edelleen käyttäen 84 endoskooppisesti resekoitu yksilöitä. CTSE ilmentyminen ei-syöpä mahalaukun limakalvon vieressä leesioiden arvioitiin yhdessä MUC5AC ja MUC2 (taulukko 4). For sig-tyypin GC, sekä tuumorivaurioon ja tausta limakalvon enimmäkseen osoitti vahvaa ekspressiota CTSE ja MUC5AC, kun taas ekspressio MUC2 oli hyvin heikko molemmissa (taulukko 4). Samanlaisia ​​ekspressiomalleja kolmesta merkkiaineiden kasvain ja viereisen limakalvon mukaan aloittaminen sig-tyyppinen GC heijastaa ominaisuudet taustan limakalvon, mistä näkymä "mahalaukun" ja "suoliston" erilaistumista. Toisin sanoen, sig-tyyppinen GC ei-suolikanavan mahalaukun ominaisuudet aluksi tapahtuu taustasta limakalvon ei-suoliston ja mahalaukun ominaisuuksia.

mahalaukun adenooma ja putkimainen adenokarsinooma (tub1 /tub2-tyyppinen GC), contrastively ilmentyminen profiilit kolme merkkiä ovat erittäin mielenkiintoisia (taulukko 4). Enemmän eriytymättömiä mahalaukun kasvaimet yleensä lisäävät ilmentymistä CTSE ja MUC5AC tuumorileesioissa (tub2 > tub1 > adenooma), mutta vähentää ilmentymistä näiden mahalaukun merkkiaineiden taustalla limakalvon (tub2 < tub1 < adenooma). Nämä viittaavat siihen, että enemmän erilaistumaton (siis enemmän pahanlaatuisia) mahalaukun kasvaimet omiaan osoittamaan vahvempaa mahalaukun omaisuutta, kun taas ne yleensä johtuvat taustasta limakalvon kanssa vähentynyt mahalaukun ominaisuuksia. Toisaalta, eriytetymmällä mahalaukun kasvaimet yleensä ilmaista MUC2 sekä tuumorileesioissa ja taustan limakalvo (adenooma > tub1 > tub2). Tämä viittaa siihen, että suoliston erilaistuminen tausta mahalaukun limakalvon johtaa intestinaalisesti eriytetty (eli vähemmän pahanlaatuinen) mahalaukun kasvaimet.

pap-tyyppinen GC, ilmauksia CTSE, MUC5AC, ja MUC2 olivat huomattavasti vahva sekä kasvainleesion ja ympäröivän limakalvon, jotka ovat aivan erilaisia ​​kuin ekspressiomalleja tub1 /tub2-tyypin GC (taulukko 4). Pap-tyyppinen GC luokitellaan Laurenin suoliston tyyppiä yhdessä tub1 /tub2-tyyppinen GC, mutta nykyisen analyysejä ehdotti, että pap-tyyppinen ja tub1 /tub2-tyyppinen GC saisi kohdella samalla luokkaan kannalta mahan ja suoliston ominaisuudet. Aiemmissa raporteissa analysoidaan BRM
[3], keskeiseksi markkerigeeni suolen erilaistumisen ilmentyminen Brm mahalaukun papillaarinen adenokarsinooma (PAP) on aivan erilainen kuin putkimainen adenokarsinooma mahaan (tub1 ja tub2). Tällä hetkellä olemme vakuuttuneita, että histologinen ero pap-tyyppinen GC ja tub1 /tub2-tyyppinen GC tulisi ehdottomasti tunnustettava.

Keskustelu

Roolit ja asetukseen katepsiini E (CTSE) vuonna ihmisen mahalaukku

katepsiini E (CTSE), ei-lysosomaalisen solunsisäisen aspartyyliproteaasi, on yksi katepsiini perheen proteaasit [39], [40]. Toinen aspartyyliproteaasin cathespin D (CTSD), homologin CTSE, on suuri proteolyyttinen aktiivisuus on lysosomaalisen komponentti, mutta toimiva roolit CTSE ei ole selvitetty [24], [39]. Jakelu sekä proteinaasien on aivan erilainen: CTSD on yleisesti olemassa lysosomeihin eri kudoksissa (yhdenmukainen tuloksen kuviossa 1A), kun taas CTSE ilmentyy pääasiassa immuunisysteemin soluja, kuten macropahges, lymfosyytit, dendriittisolut, jne [39 ]. Expression of CTSE mahassa on myös raportoitu [23], [24], vaikka fysiologisissa ja patologisissa tehtävä mahalaukun CTSE ei tällä hetkellä tunneta [39], [40]. Tässä tutkimuksessa arvioidaan peräti 202 kliinistä mahalaukun näytteitä, olemme selvästi osoitti CTSE on sekä mahalaukun differentiaatiomarkkeri ja mahalaukun sinettisormus-rengas cell carcinoma merkki, mutta merkitys mahalaukun CTSE ilmaisun on edelleen epävarma.

analysoida suhde CTSE ilmaisun ja onkogeeninen, valmistimme MuLV-pohjainen retrovirus vektori [26] kuljettaa CTSE
geeni ja transdusoitiin se osaksi CTSE puutosta mahasyövän solulinjoissa: MKN-74, SH-10 -TC, ja MKN-1. Arvioimme mahdollisuutta muuttaa mahan musiinia tuotannon (kuvio S5) tai niiden morfologisia muutoksia, mutta mitään muutosta ei havaittu. Käyttämällä näitä vakiintuneet solulinjat, me suoritetaan lisäksi sekä pesäkkeenmuodostusta pehmeässä agarissa [30] ja apoptoosin induktio käsittelemällä aktinomysiini D, kiinilla ja staurosporiinille [41]. Voimme kuitenkin havaita vaikutus CTSE ilmentymisen ole kiinnityspisteeseen riippumattomaan kasvuun eikä vastustuskykyä lääkkeen indusoiman apoptoosin (tuloksia ei ole esitetty).

tuoreessa tutkimuksessa, CTSE on raportoitu olevan jonkin verran anti-onkogeeninen: Kawakubo et al.
osoittaneet, että CTSE erityisesti indusoi kasvun pysähtymisen ja apoptoosin ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa katalysoimalla proteolyyttisen vapautumisen liukoisen tuumorinekroositekijän-sukuinen apoptoosia indusoiva ligandi (TRAIL) solun pinnasta [42 ]. Kuitenkin CTSE-hiirillä ei ole näytteille syöpä-altis fenotyyppi eikä läsnä ilmeinen mahalaukun sairaudet [43], [44], [45]. Tällä hetkellä se on asia arveluihin siitä ilmoitetaan antituumorivaikutuksen CTSE voitaisiin soveltaa mahasyövän lukien sinettisormus-rengas cell carcinoma. Yhdessä unelucidated sääntelyä ja fysiologisen toiminnan vaikutukset CTSE mahalaukun erilaistumiseen ja kasvaimen kehittymisen ovat perustavaa laatua olevia ongelmia, jotka on ratkaistava tulevaisuudessa.

mahan Canceration näkökulmasta "mahalaukun" ja "suoliston" Property of Taustaa

• PLoS ONE: retinoiinihappo-aktivoitu Ndrg1a tukahduttaa Wnt /β-kateniinin Signaling Salli Xenopus haima, ruokatorvi, mahalaukku, ja pohjukaissuoli Specification
• PLoS ONE: Leikkauksen jälkeiset kemosädehoito Yhdistettynä epirubisiini-Based Tripletin Kemoterapia paikallisesti Advanced Adenokarsinooma Maha tai Ruokatorven Junction