PLoS ONE: Cathepsin E ist ein Marker von Magen-Differenzierung und Siegelringzellkarzinom von Magen: A Novel Anregung auf Gastric Tumorigenesis

Abstrakt

Magenkrebs (GC) verschiedene histologische Eigenschaften präsentiert, obwohl der Mechanismus ihrer Vielfalt zugrunde liegenden selten aufgeklärt wird. Es ist vor allem in gut differenzierte Rohr Adenokarzinom (TUB1) klassifiziert, mäßig differenzierten Rohr Adenokarzinom (tub2), schlecht differenzierten Adenokarzinom (por), Siegelringzellkarzinom (sig), muzinöse Adenokarzinom (muc) und papilläres Adenokarzinom (pap). Durch Screening fanden wir Cathepsin E (CTSE)
universell in sig-Typ, gelegentlich in por-Typ, und nur selten in TUB1 /tub2-Typ GC-Zelllinien exprimiert. In chirurgisch reseziert Proben, CTSE wurde 50/51 sig-Typ (98,0%), 10.03 TUB1-Typ (30.0%), 18.7 tub2-Typ (38,9%), 15/26 por-Typ (immunhistochemisch 57,7%), 10.04 pap-Typ (40,0%) und 0/3 muc-Typ (0,0%) GC. In endoskopisch reseziert Proben, 07.06 sig-Typ (85,7%), 7/52 TUB1-Typ (13,7%), 12.05 tub2-Typ (41,7%), 2/7 pap-Typ (28,6%) GC und 0/6 Adenom (0,0%) ausgedrückt CTSE. Für nicht-malignen Gewebe wird CTSE universell in normalen Fundus, Pylorus und Herz Drüsen des Magens ausgedrückt, aber kaum in anderen Verdauungsorgane. In der präkanzerösen intestinale Metaplasie des Magens, ist CTSE meistens in gemischten Magen-und-Darm-Typ und einen Mangel an nur-Darm-Typ beobachtet. CTSE Ausdruck positiv mit Magen-Marker MUC5AC ( p
< 0,0001) korreliert und negativ korreliert mit Darm-Marker MUC2 ( p
= 0,0019). Für sig-Typ GC, sowohl in Tumoren und Hintergrund-Schleimhaut, die Expression von MUC5AC und CTSE ist hoch, während das von MUC2 niedrig ist, was darauf hinweist, dass sig-Typ GC die Eigenschaften Hintergrund Schleimhaut widerspiegelt. Für Magen-Adenom und TUB1 /tub2-Typ GC, mehr undifferenzierte Tumoren sind in der Regel eine höhere Expression von CTSE mit MUC5AC und niedriger Expression von MUC2 in Tumoren zu zeigen, aber sie neigen dazu, eine geringere Expression von CTSE, MUC5AC und MUC2 im Hintergrund Schleimhaut zu präsentieren. Diese deuten darauf hin, dass bösartiger Adenokarzinom des Magens mit stärkeren Magen-und Darm schwächeren Eigenschaften neigen dazu, von Hintergrund Schleimhaut entstehen sowohl mit Magen- und Darmfunktionen verringert. Abschließend ist CTSE ein Marker für beide Magen-Differenzierung und Zellkarzinom Siegelring, der auf dem Mechanismus der Magen tumorigenesis beleuchten sollte

Citation. Konno-Shimizu M, Yamamichi N, Inada Ki, Kageyama- Yahara N, Shiogama K, Takahashi Y, et al. (2013) Cathepsin E ist ein Marker von Magen-Differenzierung und Siegelringzellkarzinom von Magen: A Novel Anregung auf Magen Tumorigenesis. PLoS ONE 8 (2): e56766. doi: 10.1371 /journal.pone.0056766

Editor: Anthony W. I. Lo, The Chinese University of Hong Kong, Hong Kong

Empfangen: 20. November 2012; Akzeptiert: 14. Januar 2013 beginnen; Veröffentlicht: 22. Februar 2013

Copyright: © 2013 Konno-Shimizu et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Arbeit unterstützt wurde durch einen Zuschuss von Sato Memorial Foundation for Cancer Research, teilweise durch ein Forschungsstipendium von Nakayama Cancer Research Institute, teilweise durch ein Forschungsstipendium von Stiftung zur Förderung der Krebsforschung, und zum Teil auch von Grant-in- teil Hilfe für junge Wissenschaftler (B) aus dem Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie (MEXT). Aber alle Geldgebern keine Rolle bei Studiendesign hatte, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung zu veröffentlichen oder um die Herstellung des Manuskripts

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Magenkrebs (GC) ist die vierthäufigste Krebserkrankung und die zweithäufigste Todesursache durch Krebs verursachten weltweit trotz der allmählichen Verringerung der Inzidenz und Mortalität [1], [2]. Es ist allgemein bekannt, dass Magen-Malignität verschiedene histologische Eigenschaften [3] präsentiert. Die am häufigsten verwendete Klassifizierung von Magenkrebs ist Lauren Klassifikation, die Darm (differenziert) Typ GC und diffuse (undifferenziert) Typ GC [4] unterscheidet. Lauren Typisierung ist einfach und leicht zu verstehen, obwohl seine starke Vereinfachung führt oft zu incapability reflektieren präzise Merkmale des Magen-Malignität [3]. In der detaillierteren japanischen Klassifikation von Magenkrebs [5], die der WHO-Klassifikation ähnlich ist [6] wird Adenokarzinom des Magens in sechs Kategorien eingeteilt: gut differenziert Rohr Adenokarzinom (TUB1), mäßig differenzierten Rohr Adenokarzinom (tub2), schlecht differenzierten Adenokarzinom (por), Siegelringzellkarzinom (sig), mucinouse Adenokarzinom (muc) und papilläres Adenokarzinom (pap). Grob gesagt, Lauren diffuse (undifferenziert) Art umfasst Abschnitte, Si- und muc-Typ GC, während Lauren Darm (differenziert) Typ tub1- umfasst, tub2- und pap-Typ GC [3].

Unter den verschiedenen histologischen GC-Typen, konzentrierten wir uns auf Siegelringzellkarzinom (SRCC) des Magens (sig-Typ GC). SRCC ist ein Mucin-sekretierenden Adenokarzinom, in denen intrazytoplasmatischer Mucin komprimiert ihre Kerne die Zellen charakteristisch "Siegelring" Aussehen zu geben [7]. Während SRCC berichtet wurde aus verschiedenen Geweben entstanden zu sein, ist die häufigste Magen Ursprungsorgan [7], [8]. Trotz der häufigen Prävalenz von SRCC unter Magen-malignen Erkrankungen, sind klinisch-pathologischen Eigenschaften von sig-Typ GC noch umstritten; Einige frühere Studien berichteten, dass Siegelring-Histologie eine bessere Prognose präsentiert [9], [10], [11], während andere Studien berichteten, dass die Histologie von SRCC ein Zeichen von eher schlechter Prognose ist [8], [12], [ ,,,0],13], [14]. Unter solchen Hintergrund haben wir versucht, neue spezifische Markergene für sig-Typ GC zu finden. In den meisten früheren Studien [15], [16], [17], sig-Typ GC war mit por-Typ und muc-Typ analysiert zusammen sind, weil diese drei Arten von GC in Laurens diffusen Typ kategorisiert sind. viele Berichte jedoch vorgeschlagen, dass sig-Typ GC ist ganz anders als Abschnitte oder muc-Typ GC, aus der Sicht der molekularen Eigenschaften oder maligne Potentialen [3], [13], [18]. Deshalb haben wir analysiert, um die sig-Typ GC unabhängig vom Abschnitt und muc-Typ GC.

Unter der großen Anzahl von Genen, wir mehrere solche wie Cadherin
Familie Gene gescreent [19 ], [20], Mensch Mucin
Gene [21], Vimentin
[22], Cathepsin
Familie Gene [23], [24], [25] usw. haben, deren Ausdrücke berichtet zwischen Laurens Darm- und diffusen Typ GC, anders zu sein. Der Hauptzweck unserer Studie ist der Suche nach einem Hinweis auf ungelöste Karzinogenese von sig-Typ GC durch seine spezifischen Markergene zu identifizieren. Wir erwarten, dass unsere Studie an unbekannte Upstream regulatorische Gene (wie spezifische Transkriptionsfaktoren) Bestimmung der Eigenschaften von sig-Typ GC führen würde. Einige Transkriptionsfaktoren zu Magen-Darm-Eigenschaften im Zusammenhang geklärt sind wie CDX
Familie Gene [26], [27], gli
Familie Gene [28], und Sox2
[29], aber wir glauben nicht wenige wichtige Gene für die Magen-Darm-Differenzierung und Magen oncogenesis bleiben noch unentdeckt. Ein weiteres Ziel unserer Studie ist es, die sehr frühen Stadium von Magen tumorigenesis basierend auf der Expression der identifizierten neuen Markergene zu analysieren. Nicht nur auf sig-Typ GC konzentrieren wir weiter alle Arten von frühen GC Fälle durch die Analyse identifizierten Marker Genexpression sowohl in der Tumorläsion und angrenzenden Schleimhaut zu bewerten in Frage gestellt. Wir sind überzeugt, unsere Arbeit ein Schlüssel zur Annäherung an die umstrittenen Features von sig-Typ GC sein sollte, und sollte auch eine Leine geführt werden, um die verschiedenen histologischen Eigenschaften von Magen-Malignität Aufklären.

Materialien und Methoden

Cell Culture

Zwanzig Magen-, zehn Dickdarm-, und zwei nicht-Magen-Darm-Krebs-Zelllinien in DMEM mit 10% fötalem Kälberserum (Gibco /Invitrogen, Carlsbad, CA) bei 37 ° C [30] gehalten wurden, [31]. Alle Zelllinien wurden von der American Type Culture Collection, RIKEN Cell Bank erworben haben, oder Zell Resource Center for Biomedical Research Institute of Development, Altern und Krebs, Tohoku University. Namen und histologischen Typen von Krebszelllinien verwendet wurden in Begleitdokument S1 minutiös beschrieben. Für die DNA-Demethylierung Reagenz und Histon-Deacetylase (HDAC) -Inhibitor, 5-Aza-2'-desoxycytidin (5-Aza-dC, Sigma-Aldrich) bei 2 &mgr; g /ml oder Trichostatin A (TSA, Sigma-Aldrich) bei 100 ng /ml wurden dem Kulturmedium zugesetzt.

RT-PCR

zelluläre Gesamt-RNAs wurden die ISOGEN RNA Isolation reaent hergestellt unter Verwendung von (Wako, Osaka, Japan), wie zuvor beschrieben [30]. Semi-quantitative RT-PCR wurde durch das Superscript One-Step-Reaktion unter Verwendung des Platinum Taq (Gibco /Invitrogen) durchgeführt. Die Primerpaare und RT-PCR-Verfahren eingesetzt, um die Expressionsniveaus des E-Cadherin (CDH-1)
, LI-Cadherin (CDH-17)
, MUC5AC zu erkennen
, MUC6
, MUC2
, CTSE (Cathepsin E)
, CTSD (Cathepsin D)
, CTSB (Cathepsin B)
, CTSL (Cathepsin L)
und GAPDH
in der Tabelle S1 gezeigt.

Western Blotting

Ganzzellextrakte (20 &mgr; g jeweils) lysiert und gekochtem mit 1x Probenpuffer [30] wurden durch Elektrophorese auf 12,5% SDS-Polyacrylamid-Gelen getrennt, auf Nitrocellulose-Membran (Hybond-N, Amersham, Freiburg, Deutschland) und immunhistochemisch mit Anti-Human-Cathepsin E Antikörper (# AF1294, R & D Systems, Minneapolis, MN) oder Anti-Human-β-Actin (C4) Antikörper (# sc-47778, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Für zweite Antikörper, Meerrettich-Peroxidase (HRP) -konjugierte anti-Ziege IgG (H + L) Esel-Antikörper (ˁ-035-003, Jackson, Baltimore, PA) und Meerrettich-Peroxidase (HRP) -konjugierte anti-Maus-IgG (H + L) Ziegen-Antikörper (# A90-216P, Bethyl, Montgomery, TX) wurden jeweils verwendet. Spezifische Banden wurden mit Immunostar LD (Wako, Osaka, Japan) und LAS-4000 (Fuji Film, Tokyo, Japan) detektiert.

Immunohistochemistry

Entparaffinierung und endogene Peroxidase Inaktivierung von klinischen Gewebe wurden durchgeführt, wie zuvor beschrieben [3]. Für CTSE, die primäre Immunfärbung mit anti-human CTSE polyklonalen Ziegen-Antikörper (# AF1294, R & D Systems) bei einer 1:100 Verdünnung wurde 16 h bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach dem Waschen in PBS (Phosphat-gepufferte-Salze) dreimal, die sekundäre Immunfärbung mit Histofine Einfache Stain MAX-PO (G) (Nichirei, Tokyo, Japan) wurde für 30 min bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach dem Waschen in PBS drei Mal, wurden die Reaktionsprodukte in 20 mg /dl 3,3'-Diaminobenzidintetrahydrochlorid Lösung, die einen Tropfen 30% H _{2 O 2 durch Waschung mit PBS, gefolgt visualisiert. Nuclear Gegenfärbelösung wurde mit Mayers Hematoxilin erreicht. für 10 min für die Antigen-Retrieval; für MUC5AC und MUC2, hydratisiertes Erhitzen in 1 mM EDTA-Puffer (pH 8,0) bei 120 ° C wurde zuerst in einem Druckkocher (T-FAL, Rumily, Frankreich Delicio 6L) durchgeführt. Die primäre Immunfärbung mit Anti-MUC5AC Antikörper (NCL-MUC-5AC, Novocastra, Newcastle-upon-Tyne, UK) bei einer 1:200 Verdünnung oder Anti-MUC2-Antikörper (NCL-NUC-2, Novocastra) bei einem 1:500 Verdünnung wurde 16 h bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach dem Waschen in PBS drei Mal wurde die sekundäre Immunfärbung mit Histofine Einfache Stain MAX-PO (G) (Nichirei) für 30 min bei Raumtemperatur durchgeführt. Der folgende Schritt war die gleiche wie CTSE immunologische Anfärbung. Alle immunogefärbten Abschnitte wurden unabhängig voneinander von zwei Pathologen ausgewertet, zusammen mit HE-gefärbt und PAS-gefärbten Schnitten aus den gleichen Läsionen.}

Tumorproben

Unter den Magenkrebsgewebe an der Fujita Health überhöht University School of Medicine, wählten wir 51 Magen-Siegelringzellkarzinom (sig) Proben operativ reseziert. Des Weiteren 67 Magenkrebs chirurgischen Proben von fünf anderen Arten von Adenokarzinom des Magens (TUB1, tub2, por, pap und muc) wurden von der gleichen Bank zufällig ausgewählt. Für die endoskopisch reseziert Proben, wählten wir 84 Proben (78 Magenkrebs-Fälle und 6 Magen-Adenom Fälle), die von 2005 bis 2011. Für alle klinischen Proben, eine schriftliche Zustimmungen wurden aus den entsprechenden Patienten in der Universität von Tokyo Krankenhaus behandelt wurden erhalten nach der Deklaration von Helsinki. Diese Studie wurde an Fujita Health Universität für die menschliche Untersuchung durch die institutionellen ethischen Review Board genehmigt und wurde auch von den Ethikkommissionen der Universität Tokyo genehmigt.

Retrovirus-Vektoren

retrovirale Vektoren zu erzeugen exprimierenden Cdx2
, Gli1
, Gli3
, CTSE
und Sox2
wurden entsprechende cDNAs in pMXs-IRES eingefügt -puro (Cell Biolabs Inc., San Diego, CA) wie folgt. Für Cdx2
wurde pMXs-Cdx2-IRES-puro zuvor wie berichtet erzeugt [26]. Gli1
cDNA wurde aus pCR-XL-TOPO-Gli1 (Open Biosystems, Huntsville, AL) über PCR-Amplifikation erhalten unter Verwendung von Primern 5'-agccagatctatgagcccatctctgggattc-3 'und 5'-agtagcggccgcccctactctttaggcactagagt-3'. Nach dem Doppel Verdauung mit Bgl II und Not I wurde das erhaltene Fragment in die BamH I /Not I-Stelle von pMXs-IRES-puro (Cell Biolabs Inc., San Diego, CA) eingefügt pMXs-Gli1-IRES-puro erzeugen. Gli3
cDNA von pCR-XL-TOPO-Gli3 (Open Biosystems) durch PCR-Amplifikation erhalten wurde, wurde unter Verwendung der Primer 5'-aatgcggccgctgatttccgttggt-3 'und 5'-tgcggatcctacgtgggcatttttg-3'. Nach dem Doppel Verdauung mit BamH I und Not I wurde das erhaltene Fragment in die BamH I eingefügt /Not I-Stellen von pMXs-IRES-puro pMXs-Gli3-IRES-puro zu erzeugen. CTSE
cDNA von pCMV-SPORT6-CTSE (Thermo Fisher Scientific, Madison, WI) durch PCR-Amplifikation erhalten wurde, wurde unter Verwendung der Primer 5'-ccgagatctatgaaacgctccttcttttg-3 'und 5'-gggctcgagtaaaactgtcgaatgaaga-3'. Nach dem Doppel Verdauung mit Bgl II und Xho I wurde das erhaltene Fragment in die /XhoI BamH I eingefügt Websites von pMXs-IRES-puro pMXs-CTSE-IRES-puro zu erzeugen. Sox2
cDNA von MKN-7 genomische DNA mittels PCR-Amplifikation erhalten wurde, wurde unter Verwendung der Primer 5'-atgtacaacatgatggagacggagct-3 'und 5'-tcacatgtgtgagaggggcagtgtg-3'. Das amplifizierte Fragment wurde in die EcoR V Stellen des Vektors pT7Blue-T eingesetzt (Novagen, Darmstadt, Deutschland) pT7Blue-Sox2 zu erzeugen. Nach dem Doppel Verdauung mit BamH I und Sal I wurde das erhaltene Fragment in die /XhoI BamH I eingefügt Websites von pMXs-IRES-puro pMXs-Sox2-IRES-puro zu erzeugen. Durch Cotransfektion dieser Plasmide mit VSV Umschlag G-Protein (VSV-G) Expressionsplasmid in Plat-GP Vorverpackung Zelllinie (Cell Biolabs Inc.) bzw. VSV-G-pseudotypisierten MuLV basierenden Retrovirusvektoren ausdrücken Cdx2
, Gli1
, Gli3
, CTSE
und Sox2
hergestellt.

Ergebnisse

• PLoS ONE: Retinsäure-Activated Ndrg1a Zügelt Wnt /β-Catenin Xenopus Pancreas zulassen Signaling, Speiseröhre, Magen und Duodenum Specification
• PLoS ONE: Postoperative Radiochemotherapie in Kombination mit Epirubicin-Based Triplet Chemotherapie bei lokal fortgeschrittenem Adenokarzinom des Magens oder gastroösophagealen Junction