PLoS ONE: cathepsine E is een merker van Maag Differentiatie en Signet-Ring celcarcinoom van Maag: A Novel suggestie op Gastric Tumorgenese

Abstract

Maagkanker (GC) presenteert diverse histologische kenmerken, hoewel de onderliggende mechanisme zijn diversiteit wordt zelden opgehelderd. Het wordt hoofdzakelijk ingedeeld in goed gedifferentieerd buisvormige adenocarcinoom (tub1), matig gedifferentieerd buisvormige adenocarcinoom (tub2), slecht gedifferentieerde adenocarcinoom (por), zegelring cell carcinoma (sig), mucineus adenocarcinoom (MUC), en papillaire adenocarcinoom (pap). Door screening, vonden we cathepsine E (CTSE)
universeel uitdrukt in sig-type, nu en in por-type, en zelden in tub1 /tub2-type GC cellijnen. In chirurgisch-resectiepreparaten, werd CTSE immunostained in 50/51 sig-type (98,0%), 10/03 tub1-type (30,0%), 18/07 tub2-type (38,9%), 15/26 por-type ( 57,7%), 4/10 pap-type (40,0%) en 0/3 muc-type (0,0%) GC. In endoscopisch-resectiepreparaten, 6/7 sig-type (85,7%), 7/52 tub1-type (13,7%), 12/05 tub2-type (41,7%), 07/02 pap-type (28,6%) GC en 0/6 adenoom (0,0%), uitgedrukt CTSE. Voor niet-kwaadaardige weefsels wordt CTSE algemeen uitgedrukt in normale fundus, pylorus, en cardiale klieren van de maag, maar nauwelijks in andere spijsverteringsorganen. In de voorstadia intestinale metaplasie van de maag, wordt CTSE meestal waargenomen in gemengde maag-en-intestinale type en een tekort aan enkel-intestinale type. CTSE uitdrukking is positief gecorreleerd met de maag marker MUC5AC ( p Restaurant < 0,0001) en negatief gecorreleerd met intestinale marker MUC2 ( p
= 0,0019). Voor sig-type GC, zowel in tumoren en achtergrond slijmvlies, expressie van MUC5AC en CTSE hoog is terwijl die van MUC2 is laag, wat aangeeft dat sig-type GC weerspiegelt de kenmerken van de achtergrond slijmvlies. Voor maag adenoom en tub1 /tub2-type GC, meer ongedifferentieerde tumoren hebben de neiging om een ​​hogere expressie van CTSE met MUC5AC en lagere expressie van MUC2 in tumoren te laten zien, maar ze hebben de neiging om lagere expressie van CTSE, MUC5AC en MUC2 presenteren op de achtergrond slijmvlies. Deze suggereren dat er meer kwaadaardige adenocarcinoom van de maag met sterkere maag- en zwakker intestinale eigenschappen hebben de neiging om voort uit de achtergrond slijmvlies met een verminderde zowel maag- en darm functies. Tot slot, CTSE is een marker van zowel de maag differentiatie en zegelring cell carcinoma, die licht moeten werpen op het mechanisme van het ontstaan ​​van tumoren maag

Visum:. Konno-Shimizu M, Yamamichi N, Inada Ki, Kageyama- Yahara N, Shiogama K, Takahashi Y, et al. (2013) cathepsine E Is een marker van Maag Differentiatie en Signet-Ring celcarcinoom van Maag: A Novel suggestie op Gastric Tumorgenese. PLoS ONE 8 (2): e56766. doi: 10.1371 /journal.pone.0056766

Editor: Anthony W.I. Lo, De Chinese Universiteit van Hong Kong, Hong Kong

Ontvangen: 20 november 2012; Aanvaard: 14 januari 2013; Gepubliceerd: 22 februari 2013

Copyright: © 2013 Konno-Shimizu et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd

Financiering:. Dit werk werd mede ondersteund door een subsidie ​​van Sato Memorial Foundation for Cancer Research, voor een deel door een onderzoeksbeurs van Nakayama Cancer Research Institute, onder meer door een onderzoek subsidie ​​van de Stichting ter bevordering van Cancer Research, en ook voor een deel door Grant-in- steun voor jonge wetenschappers (B) van het ministerie van Onderwijs, Cultuur, Sport, Wetenschap en Technologie (MEXT). Maar alle financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript

Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan ​​

Introductie

Maagkanker (GC) is de vierde meest voorkomende kanker en de tweede oorzaak van kanker-gerelateerde sterfgevallen wereldwijd, ondanks de geleidelijke afname van de incidentie en mortaliteit [1], [2]. Het is algemeen bekend dat de maag maligniteit presenteert diverse histologische kenmerken [3]. De meest gebruikte indeling van maagkanker is Lauren classificatie van de darm (gesplitste) onderscheidt typen GC en diffuse (ongedifferentieerde) type GC [4]. Lauren typen is duidelijk en gemakkelijk te begrijpen, hoewel de oversimplificatie leidt vaak tot onvermogen reflecteren precieze kenmerken van de maag maligniteit [3]. In de meer gedetailleerde Japanse classificatie van maagkanker [5], die overeenkomt met de WHO classificatie [6], is maagdarmkanker ingedeeld in zes categorieën: goed gedifferentieerd buisvormige adenocarcinoom (tub1), matig gedifferentieerd buisvormige adenocarcinoom (tub2), slecht gedifferentieerde adenocarcinoom (por), zegelring cell carcinoma (sig), mucinouse adenocarcinoom (MUC), en papillaire adenocarcinoom (pap). In grote lijnen, Lauren's diffuse (ongedifferentieerde) type omvat por-, sig- en muc-type GC, terwijl Lauren's intestinale (gedifferentieerde) soort omvat tub1-, tub2- en pap-type GC [3].

van de verschillende histologische types GC, hebben we ons gericht op zegelring cell carcinoma (SRCC) van de maag (sig-type GC). SRCC een mucine uitscheidende adenocarcinoom, waarbij intracytoplasmatische mucine comprimeert hun kernen aan de cellen karakteristieke "zegelring" uitstraling [7]. Hoewel SRCC is naar verluidt afkomstig uit verschillende weefsels, maag is de meest voorkomende orgaan van oorsprong [7], [8]. Ondanks de veelvuldige prevalentie van SRCC onder de maag maligniteiten, klinisch-pathologische kenmerken van sig-type GC zijn nog steeds controversieel; een aantal eerdere studies gemeld dat zegelring cel histologie presenteert een betere prognose [9], [10], [11], terwijl andere studies gemeld dat histologie van SRCC is een teken van eerder slechtere prognose [8], [12], [ ,,,0],13], [14]. Onder dergelijke achtergrond, hebben we geprobeerd om nieuwe specifieke marker genen voor sig-type GC te vinden. In de meeste eerdere studies [15], [16], [17], was sig-type GC samen geanalyseerd por-type en muc-type, omdat deze drie soorten GC zijn onderverdeeld in Laurens diffuse type. Veel gesuggereerd dat sig-type GC is heel anders por- of muc-type GC, vanuit het oogpunt van moleculaire kenmerken of maligne potentieel [3], [13], [18]. Daarom hebben we een analyse van de sig-type GC onafhankelijk van de Portu- en muc-type GC.

Onder het grote aantal genen, we gescreend verschillende degenen zoals cadherine
familie genen [19 ], [20], de mens mucine
genen [21], vimentine
[22], cathepsine
familie genen [23], [24], [25] etc., waarvan de uitdrukkingen is gemeld dat verschillende tussen darm- en diffuus Type GC Laurens zijn. Het belangrijkste doel van ons onderzoek is het vinden van een aanwijzing voor onopgeloste carcinogenese van sig-type GC door middel van het identificeren van de specifieke marker genen. We hadden verwacht dat onze proces zou leiden tot onbekende upstream regulerende genen (zoals specifieke transcriptiefactoren) het bepalen van de eigenschappen van sig-type GC. Sommige transcriptiefactoren in verband met gastro-intestinale eigenschappen zijn opgehelderd zoals cdx
familie genen [26], [27], gli
familie genen [28], en Sox2
[29], maar we geloven niet een paar cruciale genen voor gastro-intestinale differentiatie en maag oncogenese nog steeds onontdekt. Een ander doel van onze studie is de zeer vroege fase van tumorigenese de maag gebaseerd op de expressie van nieuwe geïdentificeerde merkergenen analyseren. Niet alleen gericht op sig-type GC, we verder uitgedaagd om allerlei vroege GC gevallen evalueren door analyse geïdentificeerde marker genexpressie in zowel de tumorlaesie en aangrenzende mucosa. We zijn ervan overtuigd dat ons werk moet een sleutel tot het naderen van de controversiële aspecten van sig-type GC te zijn, en ook moet een lead zijn om het ophelderen van de verschillende histologische eigenschappen van maag maligniteit.

Materialen en methoden

Celkweek

Twintig maag-, colorectale tien, en twee niet-gastrointestinale kanker cellijnen werden bij 37 ° C [30] aangehouden in DMEM met 10% foetaal kalfsserum (Gibco /Invitrogen, Carlsbad, CA), [31]. Alle cellijnen werden gekocht van de American Type Culture Collection, RIKEN Cell Bank of Cell Resource Center for Biomedical Research Institute of Development, Aging en Kanker, Tohoku University. Namen en histologische vormen van kanker gebruikte cellijnen werden minutieus beschreven in bewijsstuk S1. Voor DNA demethylering reagens en histon deacetylase (HDAC) inhibitor, 5-aza-2'-deoxycytidine (5-aza-dC, Sigma-Aldrich) en 2 ug /ml of trichostatine A (TSA, Sigma-Aldrich) en 100 ng /ml werden toegevoegd aan het kweekmedium.

RT-PCR

Totaal cellulair RNA werd bereid met de ISOGEN RNA-isolatie reaent (Wako, Osaka, Japan) zoals eerder beschreven [30]. Semi-kwantitatieve RT-PCR werd uitgevoerd via de Superscript One-Step onder toepassing Platinum Taq (Gibco /Invitrogen). De primer paren en RT-PCR procedures toegepast om de expressie niveaus van de E-cadherine (CDH-1)
, LI-cadherine (CDH-17)
, MUC5AC detecteren
, MUC6
, MUC2
, CTSE (cathepsine E)
, CTSD (cathepsine D)
, CTSB (cathepsine B)
, CTSL (cathepsine L)
en GAPDH
worden getoond in de tabel S1.

Western Blotting

Whole celextracten (20 ug elk) gelyseerd en gekookt met 1x monsterbuffer [30] werden gescheiden door elektroforese op 12,5% SDS-polyacrylamidegelen, overgebracht naar nitrocellulose membraan (Hybond-N, Amersham, Freiburg, Duitsland) en immunologisch gekleurd met anti-humaan cathepsine E antilichaam (# AF1294, R &D Systems, Minneapolis, MN) of anti-humaan β-actine (C4) antilichaam (# sc-47.778, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Voor tweede antilichamen, mierikswortelperoxidase (HRP) geconjugeerd anti-geit IgG (H + L) antilichaam ezel (ˁ-035-003, Jackson, Baltimore, PA) en mierikswortelperoxidase (HRP) geconjugeerd anti-muis IgG (H + L) geit antilichaam (# A90-216P, Bethyl, Montgomery, TX) werden respectievelijk gebruikt. Specifieke banden werden gedetecteerd met Immunostar LD (Wako, Osaka, Japan) en LAS-4000 (Fuji Film, Tokyo, Japan).

Immunohistochemie

deparaffinisatie en endogene peroxidase inactivatie van klinische weefsels werden uitgevoerd zoals eerder beschreven [3]. Voor CTSE de primaire immunokleuring met anti-humaan CTSE geiten polyklonaal antilichaam (# AF1294, R &D Systems) bij een verdunning 1:100 werd gedurende 16 uur bij kamertemperatuur geroerd. Na wassen in PBS (fosfaat-gebufferde zouten) driemaal de secundaire immunokleuring met Histofine Simple Stain MAX-PO (G) (Nichirei, Tokyo, Japan) werd uitgevoerd gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Na wassen in PBS driemaal, werden de reactieproducten gevisualiseerd 20 mg /dl 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride oplossing die een daling van 30% H _{2O 2, gevolgd door wassen met PBS. Nucleaire tegenkleuring werd uitgevoerd met Mayer's hematoxiline. Voor MUC5AC en MUC2, gehydrateerd verwarmen in 1 mM EDTA buffer (pH 8,0) bij 120 ° C werd eerst uitgevoerd in een snelkookpan (Delicio 6L, T-FAL, Rumily, Frankrijk) gedurende 10 min voor antigen herstel. De primaire immunokleuring met anti-MUC5AC antilichaam (NCL-MUC-5AC, Novocastra, Newcastle-upon-Tyne, UK) bij een 1:200 verdunning of anti-MUC2 antilichaam (NCL-NUC-2, Novocastra) bij een 1:500 verdunning werd gedurende 16 uur bij kamertemperatuur geroerd. Na wassen in PBS driemaal, de secundaire immunokleuring met Histofine Simple Stain MAX-PO (G) (Nichirei) werd gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. De volgende stap was hetzelfde als CTSE immunologische kleuring. Alle immuun-secties werden onafhankelijk beoordeeld door twee pathologen, samen met HE-gekleurd en-PAS gekleurde coupes van dezelfde laesies.}

Tumor Samples

Onder de maagkanker weefsels belegd bij de Fujita Health University School of Medicine, selecteerden we 51 gastric zegelring cell carcinoma (sig) monsters chirurgisch weggesneden. Verder werden 67 maagkanker chirurgische specimens van vijf andere soorten maagdarmkanker (tub1, tub2, por, pap en muc) willekeurig gekozen uit dezelfde bank. Voor het endoscopisch weggesneden monsters, selecteerden we 84 exemplaren (78 maagkanker gevallen en 6 maag adenomen gevallen), die aan de Universiteit van Tokyo ziekenhuis werden behandeld tussen 2005 en 2011. Voor alle klinische monsters, werden geschreven geïnformeerd toestemming verkregen van de overeenkomstige patiënten volgens de Verklaring van Helsinki. Deze studie werd goedgekeurd door de institutionele ethische toetsingscommissie voor menselijke onderzoek bij Fujita Health University, en werd ook goedgekeurd door de ethische commissies van de Universiteit van Tokyo.

Retrovirus vectoren

Om retrovirale vectoren te genereren expressie Cdx2
, Gli1
, Gli3
, CTSE
en Sox2
, respectievelijke cDNA's werden ingebracht in pMXs-IRES -puro (Cell Biolabs Inc., San Diego, CA) als volgt. Voor Cdx2
, pMXs-Cdx2-IRES-puro werd gegenereerd zoals eerder [26] gemeld. Gli1
cDNA werd verkregen uit pCR-XL-TOPO-Gli1 (Open Biosystems, Huntsville, AL) via PCR-amplificatie met behulp van primers 5'-agccagatctatgagcccatctctgggattc-3 'en 5'-agtagcggccgcccctactctttaggcactagagt-3'. Na dubbele digestie met Bgl II en Not I, het verkregen fragment werd in de BamHI /NotI plaats van pMXs-IRES-puro (Cell Biolabs Inc., San Diego, CA) om pMXs-Gli1-IRES-puro genereren ingevoegd. Gli3
cDNA verkregen uit pCR-XL-TOPO-Gli3 (Open Biosystems) via PCR amplificatie met behulp van primers 5'-aatgcggccgctgatttccgttggt-3 'en 5'-tgcggatcctacgtgggcatttttg-3'. Na dubbele digestie met BamHI en NotI, het verkregen fragment werd in de BamHI /NotI plaatsen van pMXs-IRES-puro te pMXs-Gli3-IRES-puro genereren. CTSE
cDNA verkregen uit pCMV-sport6-CTSE (Thermo Fisher Scientific, Madison, WI) via PCR amplificatie met behulp van primers 5'-ccgagatctatgaaacgctccttcttttg-3 'en 5'-gggctcgagtaaaactgtcgaatgaaga-3'. Na dubbele digestie met BglII en XhoI, werd het verkregen fragment geïnsereerd in de BamHI /XhoI plaatsen van pMXs-IRES-puro te pMXs-CTSE-IRES-puro genereren. Sox2
cDNA verkregen uit MKN-7 genomische DNA via PCR amplificatie met behulp van primers 5'-atgtacaacatgatggagacggagct-3 'en 5'-tcacatgtgtgagaggggcagtgtg-3'. Het geamplificeerde fragment werd ingevoegd in de EcoRV plaatsen van pT7Blue-T vector (Novagen, Darmstadt, Duitsland) naar pT7Blue-Sox2 genereren. Na dubbele digestie met BamH I en Sal I werd het verkregen fragment geïnsereerd in de BamHI /XhoI plaatsen van pMXs-IRES-puro te pMXs-Sox2-IRES-puro genereren. Door cotransfectie van deze plasmiden met vesiculaire stomatitis envelop G-eiwit (VSV-G) expressie plasmide in PLAT-GP voorverpakt cellijn (Cell Biolabs Inc.) respectievelijk VSV-G-pseudo-MuLV gebaseerde retrovirus vectoren die Cdx2
, Gli1
, Gli3
, CTSE
en Sox2
bereid.

Resultaten

expressie van cathepsine E (CTSE)
is significant gecorreleerd met Ontstaan ​​histologische type van maagkanker cellijnen

Om de marker genen voor sig-type GC zoeken, we gescreend de expressie van verschillende genen gerapporteerd aan onderscheidende expressie tussen darm- en diffuse het type GC Lauren's te laten zien. Expressie van E-cadherine
( CDH-1
) [19], LI-cadherine
( CDH-17
) [20], MUC5AC
[21], MUC6
[21], MUC2
[21], vimentine
[22], CTSD
( cathepsine D
) [23], [24], CTSE
( cathepsine E
) [23], [24], CTSB
( cathepsine B
) [25], CTSL
( cathepsine L
) [25], en GAPDH
(interne controle) genen waren geëvalueerd door RT-PCR in 20 GC lijnen met de 12 kanker cellijnen afgeleid van andere organen (Figuur 1A). Vervolgens richt onze aandacht op de CTSE
, zoals uitdrukt zowel Kato-III en NUGC-4 afgeleid van sig-type GC, en ook omdat het niet uitdrukt MKN-7 en H-111-TC waarvan bekend is dat afkomstig is van goed gedifferentieerd buisvormige adenocarcinoom van de maag (tub1-type GC, bewijsstuk S1).

voor andere onderzochte genen expressie van CDH-1
( E- cadherine
), meldde vaak een tekort aan Lauren's soort diffuse GC [19], [32], te zijn [33], werd onverwacht ontdekt in de twee sig-type-GC-afgeleide cellen (Figuur 1A). Het was ook onverwacht dat CDH-17
( LI-cadherine
), vermoedelijk een intestinale marker gen [20], [26], [27], tot expressie in vrijwel alle maagkanker cellijnen zoals sig-type (Figuur 1A). Voor andere cathepsinefamilie genen CTSD
werd gemeld in hoge mate uitgedrukt in diffuse soort GC en ook een prognostische parameter voor maagcarcinoom patiënten [23], [34], maar de resultaten van RT-PCR onthulde dat alle de onderzochte kanker cellijnen even uitdrukkelijke CTSD
(Figuur 1A). CTSB Kopen en CTSL
werden gemeld te worden verhoogd in maagcarcinoom [35] en gecorreleerd met de kwaadaardige eigenschap [36], maar specifieke expressie van geen CTSB golfreizen of CTSL
in sig-type-GC afgeleide cellijnen kon worden gedetecteerd (Figuur 1A). Als geheel is het expressieprofiel van CTSE
lijkt heel anders dan andere cathepsinefamilie genen zijn.

We evalueerden de volgende relatie tussen CTSE expressie en histologische type 20 GC cellijnen. Op basis van de gedetailleerde bewaking van de literatuur in "histologische Type Gastric Cancer Cell Lines 'van bewijsstuk S1 beschreven, kan 19 GC cellijnen worden gesorteerd Lauren en Japanse classificatie [3], [4], [5] (tabel 1) . Volgens de classificatie Lauren, 7 van 11 het type diffuse GC-afgeleide cellen en 1 van het type 5-intestinale GC afgeleide cellen brengen CTSE (Tabel 1): CTSE
gen vaak wordt uitgedrukt in diffuse type en deficiënt intestinale het type GC. Associatie tussen CTSE expressie en histologische kenmerk van de maag maligniteit wordt duidelijker wanneer preciezer Japanse classificatie wordt toegepast. Onder de cellijnen van diffuse het type GC, is het opmerkelijk dat NUGC-4 en Kato-III is ontstaan ​​uit sig-type GC sterk uiten CTSE, terwijl SH-10-TC en KE-97 afkomstig van MUC-type GC hebben een tekort aan CTSE uitdrukking. Voor de cellen afkomstig van por-type GC, de meest voorkomende histologische type maag maligniteit [3], CTSE uitdrukking is divers: MKN-45, KE-39, HuG1-PI, HuG1-N, en AGS sterk uiten CTSE, terwijl GCIY en HGC-27 hebben een tekort aan CTSE expressie. Integendeel, onder de cellijnen van Laurens intestinaal Type GC, namelijk tub1 en tub2 Japanse indeling, MKN-7, H-111-TC, MKN-74 en AZ521 gebrek CTSE expressie, met slechts één uitzondering van NCI-N87 toont duidelijk CTSE expressie.

Uit deze resultaten, we speculeerden dat de expressie van CTSE significant gecorreleerd is met histologische type maagkanker. Voor andere zeldzame soorten GC cellijnen MKN-1, ECC-10 en ECC-12 absoluut deficiënt CTSE expressie (Figuur 1A, Tabel 1).

Expressie van cathepsine E (CTSE )
gen Majorly geregeld op het transcriptieniveau

de 13 maag-, colorectale 5 en 2 andere kankercellijnen, CTSE eiwitproductie werd geanalyseerd door Western blotting (Figuur 1B). 7 van de 20 cellijnen werden ook beoordeeld door immunohistochemie (Figuur S1). In de beide analyses CTSE
mRNA expressie en CTSE eiwitproductie werden meestal gekoppeld, wat suggereert CTSE
expressie wordt voornamelijk gereguleerd op het transcriptionele niveau. Bovendien alles-of-niets expressie van CTSE getoond in RT-PCR, western blotting en immunohistochemie suggereerde dat maagkanker cellen duidelijk worden ingedeeld in twee categorieën:. CTSE expressie type en CTSE-deficiënte Type

om de regulering van onderzoeken CTSE
gen, twee belangrijke epigenetische drugs, demethyleringsmiddel 5-Aza-2'-deoxycytidine en histondeacetylaseremmer trichostatine A [37], werden toegepast op vijf GC cellijnen (figuur 1C) . Drie CTSE expressie en twee CTSE-deficiënte GC cellijnen werden behandeld, maar we konden een verandering van niet op te sporen CTSE
transcriptie (figuur 1C). Voor methylatie, zochten we ook CpG eilanden in de suggestieve promotorregio van humaan CTSE
gen met behulp van twee websites: "http://www.uscnorris.com/cpgislands2/cpg.aspx" demonstreren CpG eiland zoeker en " http://www.ncbi.nlm.nih.gov "gesteund door de National Center for Biotechnology Information (NCBI). De resultaten van beide zoekopdrachten gesuggereerd dat de promotor van humane CTSE
gen wordt gekenmerkt door een lager percentage CpG dinucleotiden (55%) en geen CpG eiland, dat overeenkomt met onze resultaten (figuur 1C) zijn.

Daarnaast evalueerden we het effect van vier transcriptiefactoren die zijn gemeld aan vele gastro-intestinale genen reguleren: Cdx2
[26], [27], gli
familie genen ( gli1 Kopen en GLI3
) [28], en Sox2
[29]. Onder de stabiele transductie van Cdx2
, gli1
, GLI3
en Sox2
, maar we konden niet een duidelijke verandering van de CTSE
expressie (figuur 1D). Op dit moment konden we niet het regelgevend mechanisme van helderen CTSE
gen, dat moet worden opgelost in de toekomst.

cathepsine E (CTSE) is zeker Uitgedrukt in zegelring celcarcinoom van Maag

de speculatie van de GC cellijnen (Tabel 1, Figuur 1A) valideren we vervolgens geanalyseerd CTSE expressie in klinische monsters. In eerste instantie werden 51 sig-type GC monsters chirurgisch weggesneden geëvalueerd. Opvallend duidelijke kleuring van CTSE werd waargenomen in alle 51 monsters onderzocht en in 50 van 51 gevallen CTSE-positieve cellen bezet meer dan 90% van kankercellen in de tumor (tabel 2).

Hierna 67 chirurgische specimens uitzondering van die van sig-type GC gevallen geanalyseerd, die verschillende patronen van CTSE expressie (Tabel 2) gepresenteerd. CTSE expressie in por-type GC was duidelijk hoger in vergelijking met andere vier soorten GC, al was veel lager dan die van sig-type GC (tabel 2). Prevalentie van CTSE positieve cellen in tub1-, tub2-, pap- en muc-type GC is zeker lager, maar het is niet zo laag als andere normale spijsverteringsorganen (tabel 2). Typische immunokleuring beelden van CTSE zes soorten GC worden getoond in Figuur 2 (sig en tub1) en figuur S2 (tub2, pap, por, en muc).

Op basis van het resultaat van chirurgische specimens we verder geanalyseerd CTSE expressie van 84 endoscopisch weggesneden maag tumor samples. Vergeleken met chirurgisch specimens, de histologie van endoscopisch weggesneden weefsel veel homogener; het was daar verwacht dat associatie tussen CTSE expressie en histologie van maagkanker kan nauwkeuriger worden geanalyseerd. Ze omvatten 78 gevallen van beginnende adenocarcinoom (7 van sig-type 52 van tub1-type 12 van tub2-type en 7 van pap-type GC) en 6 gevallen van precancerous adenoom (tabel 3). CTSE expressie van sig-, tub1-, tub2- en pap-type GC endoscopisch weggesneden weefsel lijkt chirurgisch weggesneden die met overeenkomstige histologie (tabellen 2 en 3). Berekend CTSE expressie scores (tabel 3) blijkt duidelijk dat de neiging CTSE uitdrukt zeker in sig-type GC dat neigt deficiënt tub1- en tub2 GC-type te zijn. Ook moet worden opgemerkt dat de maag adenomen, welke als meer gedifferentieerde histologische functie tegenover tub1 GC-type kan worden beschouwd, het sterkst tekort aan CTSE (tabel 3).

CTSE is niet alleen een indicator van Signet -ring celcarcinoom van de maag, maar ook een Gastric differentiatiemarker

de verdeling van CTSE normale darm en maag precancerous onderzoeken immunokleuring van CTSE werd verder toegepast op niet-kankerachtige maag en andere organen spijsverteringskanaal. In de maag zonder atrofie en intestinale metaplasie, wordt expressie van CTSE duidelijk waargenomen in de fundic en pyloric klieren van de maag (figuur S3D /S3A en S3E /S3B). Cardiac klieren van de maag ook uiten CTSE, maar het is eerder zwakker dan meningsuiting in fundic of pyloric klieren (Figuur S3F /S3C). Contrastively wordt CTSE zelden uitgedrukt in slokdarm, twaalfvingerige darm, dunne darm en dikke darm (Figuur S4).

We verder geëvalueerd CTSE expressie in maagslijmvlies met intestinale metaplasie, een bekende voorstadium van maag [26 ], [29], [38]. Zoals getoond in figuur 3A, maag fundus klieren en intestinale metaplasie klieren vertonen contrasterende kleuren van CTSE. Doorgaans wordt intestinale metaplasie ingedeeld in twee categorieën: gemengde maag-en-intestinale type (incomplete type) en uitsluitend intestinale type (compleet type) [29], [38]. Het staat vast dat de voormalige ene uitdrukt zowel MUC5AC (gastric marker mucine) en MUC2 (intestinale marker mucine), terwijl de tweede een uiting niet MUC5AC maar MUC2 [29]. In beide soorten van intestinale metaplasie in de maag, we bevestigd dat de expressie van CTSE is vergelijkbaar met MUC5AC en tegenover MUC2 (Figuur 3B en 3C).

Om de associatie van CTSE expressie met MUC5AC en MUC2 uitdrukking te beoordelen, hun immunokleuring werd statistisch geëvalueerd met behulp van endoscopische resectie 84 maagtumor weefsels (Tabel S2). De correlatie analyses bleek dat CTSE expressie positief geassocieerd met de maag marker MUC5AC ( p Restaurant < 0,0001) en negatief geassocieerd met intestinale marker MUC2 ( p
= 0,0019). Synthetisch, hebben we geconcludeerd dat CTSE, zoals MUC5AC, is een van de maag differentiatie markers.

Meer Onzichtbare Tubular Darmkanker Neigt voortvloeien uit de achtergrond slijmvlies met een verminderde Beide "maag" en "darm" Eigenschappen

Om de initiatie stap van de maag ontstaan ​​van tumoren te onderzoeken, werd de achtergrond slijmvlies van vroege kanker en adenoom verder geëvalueerd, met behulp van 84 endoscopisch resectiepreparaten. CTSE expressie van niet-carcinomateuze maagslijmvlies naast tumorlaesie werd geëvalueerd, alsmede MUC5AC en MUC2 (Tabel 4). Voor sig-type GC, zowel tumorlaesie en achtergrond slijmvlies toonde vooral sterke expressie van CTSE en MUC5AC, terwijl de expressie van MUC2 zeer zwak in beide (tabel 4). Soortgelijke expressiepatronen van de drie markers in de tumor en aangrenzende mucosa suggereren dat inleiding van sig-type GC geeft de kenmerken van de achtergrond mucosa, vanuit het standpunt van "maag" en "darm" differentiatie. Dat wil zeggen, sig-type GC met niet-intestinale gastrische eigenschappen aanvankelijk plaatsvindt van de achtergrond mucosa met niet-intestinale en maag functies.

Voor gastrische adenoom en adenocarcinoom buisvormige (tub1 /tub2 type GC), contrastively, expressieprofielen van de drie markers zijn zeer interessant (Tabel 4). Meer ongedifferentieerde maag tumoren hebben de neiging om de expressie van CTSE en MUC5AC in tumor laesies te verhogen (tub2 > tub1 > adenoom), maar expressie van deze maag-markers op de achtergrond slijmvlies afnemen (tub2 < tub1 < adenoom). Deze suggereren dat er meer ongedifferentieerd (dus meer kwaadaardige) maag tumoren geschikt is om de sterkere maag pand laten zien, terwijl ze de neiging om voort uit de achtergrond slijmvlies met een verminderde maag functies. Aan de andere kant, meer gedifferentieerde maag tumoren hebben de neiging om MUC2 in zowel de tumor laesies en achtergrond slijmvlies uit te drukken (adenoom > tub1 > tub2). Dit suggereert dat intestinale differentiatie van achtergrond maagslijmvlies leidt naar de darmen gedifferentieerde (dus minder kwaadaardige) de maag tumoren.

Voor pap-type GC, uitingen van CTSE, MUC5AC en MUC2 waren aanzienlijk sterk in zowel de tumor laesie en omringende mucosa, die totaal anders zijn de expressiepatronen van tub1 /tub2 type GC (tabel 4) zijn. Pap-type GC is ingedeeld in de darm soort Lauren's samen met tub1 /tub2-type GC, maar onze huidige analyses gesuggereerd dat pap-type en tub1 /tub2-type GC niet in dezelfde categorie moeten worden behandeld, vanuit het standpunt van de maag en darmen Kenmerken. In onze vorige verslagen analyseren Brm
[3], een mogelijke belangrijke marker-gen van gut differentiatie, expressie van Brm in de maag papillair adenocarcinoom (PAP) is heel anders dan buisvormige adenocarcinoom van de maag (tub1 en tub2). Op dit moment zijn we ervan overtuigd dat histologische verschil tussen pap-type GC en tub1 /tub2-type GC strikt moeten worden erkend.

Discussie

Rollen en Verordening van cathepsine E (CTSE) in de menselijke Maag

cathepsine E (CTSE), een non-lysosomale intracellulaire asparaginezuurprotease, is een van de cathepsinefamilie proteasen [39], [40]. Andere asparaginezuurprotease cathespin D (CTSD), een homoloog van CTSE, een belangrijke proteolytische activiteit in het lysosomale component, maar functionele rol van CTSE niet opgehelderd [24], [39]. Verdeling van beide proteasen is anders: CTSD is algemeen bestond in lysosomen van verschillende weefsels (consistent met de resultaten in figuur 1A), terwijl CTSE voornamelijk tot expressie gebracht in cellen van het immuunsysteem zoals macropahges, lymfocyten, dendritische cellen, etc. [39 ]. Expressie van CTSE in de maag is ook beschreven [23], [24], hoewel fysiologische en pathologische functie van maag CTSE is momenteel niet bekend [39], [40]. In de huidige studie ter evaluatie van maar liefst 202 klinische monsters maag, we duidelijk aangetoond CTSE is zowel de maag differentiatie marker en de maag zegelring cell carcinoma marker, maar de betekenis van de maag CTSE meningsuiting blijft onzeker.

Om analyseren van de relatie tussen CTSE expressie en oncogene potentieel produceerden we de MuLV gebaseerde retrovirus vector [26] uitvoeren CTSE
gen getransduceerd en deze in de CTSE-deficiënte maagkanker cellijnen: MKN-74, SH-10 -TC en MKN-1. We evalueerden de mogelijkheid van het veranderen van de maag mucine productie (Figuur S5) of de morfologische veranderingen, maar geen verandering werd waargenomen. Met behulp van deze gevestigde cellijnen, we verder zowel de kolonievorming in zachte agar [30] en inductie van apoptose uitgevoerd door behandeling van actinomycine D, camptothecine en staurosporine [41]. We konden echter het effect van expressie CTSE Voor geen verankering onafhankelijke groei of resistentie tegen geneesmiddelen geïnduceerde apoptose te detecteren (gegevens niet getoond)

In de recente studie, CTSE werd gemeld dat sommige anti-oncogene potentieel.: Kawakubo et al.
aangetoond dat CTSE specifiek induceert groeistop en apoptose in menselijke prostaatkanker cellijnen door het katalyseren van de proteolytische afgifte van oplosbare tumor necrosis factor-gerelateerde apoptose inducerende ligand (TRAIL) vanaf het celoppervlak [42 ]. Echter, CTSE-deficiënte muizen deed geen van beide vertonen kanker gevoelige fenotype noch aanwezig voor de hand liggende maagaandoeningen [43], [44], [45]. Momenteel is het koffiedik kijken of gerapporteerde antitumoractiviteit van CTSE maagkanker waaronder zegelring celcarcinoom kunnen toepassen. Samen met zijn unelucidated regelgeving en fysiologische functie, effecten van CTSE op de maag differentiatie en het ontstaan ​​van tumoren zijn fundamentele problemen die moeten worden opgelost in de toekomst.

Gastric verkankering vanuit het standpunt van de "maag" en "intestinale" Bezit van Achtergrond

• PLoS ONE: retinoïnezuur-Activated Ndrg1a Onderdrukt Wnt /β-catenine signalering toestaan ​​Xenopus alvleesklier, slokdarm, maag, twaalfvingerige darm en Specification
• PLoS ONE: Postoperatieve chemoradiotherapie met Gecombineerd met Epirubicine-Based Triplet Chemotherapie voor lokaal gevorderde adenocarcinoom van de maag of gastro-Junction