PLOS ONE: La catepsina E es un marcador de diferenciación y gástrico en anillo de sello carcinoma de células del estómago: Una sugerencia novela sobre gástrico Tumorigénesis

Extracto

El cáncer gástrico (CG) presenta varias características histológicas, aunque el mecanismo que subyace a su diversidad rara vez dilucidado. Se clasifican principalmente en el adenocarcinoma bien diferenciado tubular (tub1), moderadamente diferenciado adenocarcinoma tubular (tub2), adenocarcinoma pobremente diferenciado (POR), carcinoma de células en anillo de sello (SIG), adenocarcinoma mucinoso (MUC), y el adenocarcinoma papilar (PAP). Mediante cribado, encontramos catepsina E (CTSE)
expresa universalmente en la de tipo SIG, de vez en cuando en tipo por, y raramente en líneas celulares GC tub1 /de tipo tub2. En las piezas resecadas quirúrgicamente, CTSE se immunostained en 50/51 sig-tipo (98,0%), 3/10 tub1 de tipo (30,0%), 7/18 tub2 de tipo (38,9%), 15/26 por tipo ( 57,7%), 4/10 pap-tipo (40,0%), y 0/3 de tipo MUC (0,0%) GC. En las piezas resecadas endoscópicamente, 6/7 sig-tipo (85,7%), 7/52 tub1 de tipo (13,7%), 5/12 tub2 de tipo (41,7%), 2/7 pap-tipo (28,6%) GC y 0/6 adenoma (0,0%) expresó CTSE. Para tejidos no malignos, CTSE se expresa universalmente en fúndica normal del píloro, y las glándulas cardíacas de estómago, pero difícilmente en otros órganos digestivos. En la metaplasia intestinal precancerosa del estómago, CTSE se observa principalmente en el tipo gástrico-y-intestinal mixta y deficiente en el tipo exclusivamente-intestinal. CTSE expresión se correlaciona positivamente con el marcador gástrico MUC5AC ( p Hotel < 0,0001) y una correlación negativa con el marcador intestinal MUC2 ( p = 0,0019
). Por tipo sig GC, en ambos tumores y la mucosa de fondo, la expresión de MUC5AC y CTSE es alta, mientras que la de MUC2 es baja, lo que indica que tipo sig GC refleja las características de fondo de la mucosa. Para adenoma gástrico y tub1 /de tipo tub2 GC, los tumores más indiferenciados tienden a mostrar una mayor expresión de CTSE con MUC5AC y menor expresión de MUC2 en los tumores, pero tienden a presentar menor expresión de CTSE, MUC5AC y MUC2 en el fondo mucosa. Estos sugieren que más adenocarcinoma gástrico maligno con fuerte gástrica y propiedades intestinales más débiles tienden a surgir de fondo mucosa con una disminución de ambas características gástricos e intestinales. En conclusión, CTSE es un marcador de diferenciación tanto gástrico y carcinoma de células en anillo de sello, que debe arrojar luz sobre el mecanismo de la tumorigénesis gástrica

Visto:. Konno-Shimizu M, N Yamamichi, Inada Ki, Kageyama- Yahara N, Shiogama K, Takahashi Y, et al. (2013) La catepsina E es un marcador de diferenciación y gástrico en anillo de sello carcinoma de células del estómago: Una sugerencia Novel en Tumorigénesis gástrico. PLoS ONE 8 (2): e56766. doi: 10.1371 /journal.pone.0056766

Editor: Anthony W.I. Lo, la Universidad China de Hong Kong, Hong Kong

Recibido: noviembre 20, 2012; Aceptado 14 de enero de 2013; Publicado: 22 Febrero 2013

Derechos de Autor © 2013 Konno-Shimizu et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este trabajo fue apoyado en parte por una subvención de la Fundación Memorial Sato para la investigación del cáncer, en parte por una beca de investigación del Instituto de investigación del cáncer Nakayama, en parte por una beca de investigación de la Fundación para el fomento de la investigación del cáncer, y también en parte por la subvención-in- Ayuda para jóvenes científicos (B) del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología (MEXT). Pero todos los proveedores de fondos no tiene función alguna en el diseño del estudio, la recogida y el análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

el cáncer gástrico (CG) es el cuarto cáncer más común y la segunda causa de muerte por cáncer en todo el mundo, a pesar de la disminución gradual de su incidencia y mortalidad [1], [2]. Es bien sabido que la malignidad gástrica presenta varias características histológicas [3]. La clasificación más ampliamente utilizada de cáncer gástrico es la clasificación de Lauren que distingue intestinal (diferenciado) de tipo GC y difusa (no diferenciado) de tipo GC [4]. Lauren escribir es simple y fácil de entender, aunque su simplificación a menudo conduce a la incapacidad de reflejar las características precisas de malignidad gástrica [3]. En la clasificación japonesa más detallada de cáncer gástrico [5], que es similar a la clasificación de la OMS [6], adenocarcinoma gástrico está clasificado en seis categorías: adenocarcinoma tubular bien diferenciado (tub1), moderadamente diferenciado adenocarcinoma tubular (tub2), pobremente diferenciado adenocarcinoma (pOR), carcinoma de células en anillo de sello (SIG), adenocarcinoma mucinouse (MUC), y el adenocarcinoma papilar (PAP). En términos generales, difuso de Lauren tipo (indiferenciado) incluye porción, señal, y de tipo muc GC, mientras intestinal de Lauren (diferenciado) tipo comprende tub1-, tub2-, y de tipo pap GC [3].

Entre los distintos tipos histológicos de GC, nos hemos centrado en el carcinoma de células en anillo de sello (SRCC) del estómago (de tipo SIG GC). SRCC es un adenocarcinoma secretoras de mucina, en el que la mucina intracitoplasmática comprime sus núcleos para dar las células apariencia de "anillo de sello" [7]. Mientras SRCC se ha informado de que se originó a partir de varios tejidos, el estómago es el órgano más común de origen [7], [8]. A pesar de la prevalencia frecuente de SRCC entre las neoplasias gástricas, las características clínico-patológicas de tipo SIG GC son objeto de controversia; algunos estudios previos informaron que histología de células en anillo de sello presenta un mejor pronóstico [9], [10], [11], mientras que otros estudios informaron que la histología de SRCC es un signo de bastante peor pronóstico [8], [12], [ ,,,0],13], [14]. Bajo tales antecedentes, tratamos de encontrar nuevos genes marcadores específicos para el tipo sig-GC. En la mayoría de los estudios anteriores [15], [16], [17], de tipo SIG GC había sido analizados en conjunto con los de tipo por tipo y muc, debido a que estos tres tipos de GC se clasifican en tipo difuso de Lauren. Sin embargo, muchos informes sugirieron que de tipo sig GC es bastante diferente del de tipo muc porción o GC, desde el punto de vista de las características moleculares o potenciales malignos [3], [13], [18]. Por lo tanto, analizamos el tipo sig GC independientemente del GC porción y de tipo MUC.

Entre el gran número de genes, se proyectarán varios más, como cadherina
genes de la familia [19 ], [20], humanos mucina
genes [21], vimentina
[22], catepsina
genes de la familia [23], [24], [25] , etc., cuyas expresiones se han notificado a ser diferente entre CG de tipo intestinal y difuso de Lauren. El objetivo principal de nuestro estudio es encontrar una pista sobre la carcinogénesis no resuelta de tipo SIG GC a través de la identificación de sus genes marcadores específicos. Esperábamos que nuestro juicio llevaría a genes desconocidos aguas arriba reguladores (como factores de transcripción específicos) que determinan las propiedades del tipo GC sig. Algunos factores de transcripción relacionados con propiedades gastrointestinales se han aclarado como CDX
genes de la familia [26], [27], gli
genes de la familia [28], y sox2
[29], pero creemos que no son pocos los genes cruciales para la diferenciación gastrointestinal y la oncogénesis gástrica aún quedan por descubrir. Otro objetivo de nuestro estudio es analizar la etapa muy temprana de la tumorigénesis gástrica basado en la expresión de nuevos genes marcadores identificados. No sólo se centra en el tipo sig-GC, que desafía aún más para evaluar todo tipo de casos tempranos GC mediante el análisis de expresión de genes marcadores identificados tanto en la lesión tumoral y la mucosa adyacente. Estamos convencidos de nuestro trabajo debe ser una clave para acercarse a las características polémicas de tipo SIG GC, y también debe ser una ventaja para elucidar las diversas propiedades histológicas de malignidad gástrica.

Materiales y Métodos

Cultivo celular

Twenty gástrico, colorrectal diez, y dos líneas celulares de cáncer no gastrointestinales se mantuvieron en DMEM con suero de ternera fetal 10% (Gibco /Invitrogen, Carlsbad, CA) a 37 ° C [30], [31]. Todas las líneas celulares se adquirieron de la American Type Culture Collection, RIKEN Cell Bank, o célula Centro de Recursos para el Instituto de Investigación Biomédica de Desarrollo, Envejecimiento y Cáncer de la Universidad de Tohoku. Los nombres y tipos histológicos de cáncer que se usan líneas celulares se describen minuciosamente en el Documento de Apoyo S1. Por reactivo de desmetilación del ADN y el inhibidor de la histona deacetilasa (HDAC), 5-Aza-2 'desoxicitidina (5-Aza-dC, Sigma-Aldrich) a 2 mg /ml o tricostatina A (TSA, Sigma-Aldrich) a 100 ng /se añadieron ml al medio de cultivo.

RT-PCR

total de ARN celulares se prepararon utilizando el reaent RNA ISOGEN aislamiento (Wako, Osaka, Japón) como se describe anteriormente [30]. Semi-RT-PCR cuantitativa se realizó mediante la reacción de un solo paso utilizando el superíndice Platinum Taq (Gibco /Invitrogen). Los procedimientos primer pares y RT-PCR empleadas para detectar los niveles de expresión de la E-cadherina (CDH-1)
, LI-cadherina (HDC-17)
, MUC5AC
, MUC6
, MUC2
, CTSE (catepsina E)
, CTSD (catepsina D)
, CTSB (catepsina B)
, CTSL (catepsina L)
, y GAPDH
se muestran en la Tabla S1.

Western Blot las

extractos de células enteras (20 g cada uno) se lisaron y se hierve con tampón 1x de la muestra [30] fueron separados por electroforesis en 12,5% en geles de SDS poliacrilamida, se transfirieron a membrana de nitrocelulosa (Hybond-N, Amersham, Freiburg, Alemania), y a inmunotinción con anti-humano catepsina e anticuerpos (# AF1294, R & D Systems, Minneapolis, MN) anticuerpo anti-β-actina humana (C4) (# SC-47778, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) o. Para segundos anticuerpos, peroxidasa de rábano (HRP) conjugado con IgG anti-cabra (H + L) de anticuerpos de burro (ˁ-035-003, Jackson, Baltimore, PA) y peroxidasa de rábano (HRP) conjugado con anti-IgG de ratón (H + L anticuerpo de cabra) (# A90-216P, se utilizaron respectivamente Bethyl, Montgomery, TX). bandas específicas se detectaron con Immunostar LD (Wako, Osaka, Japón) y LAS-4000 (Fuji Film, Tokio, Japón).

La inmunohistoquímica

Se realizaron desparafinación e inactivación de la peroxidasa endógena de tejidos clínicos como se describe anteriormente [3]. Para CTSE, la inmunotinción con el anticuerpo primario CTSE policlonal de cabra anti-humano (# AF1294, R & D Systems) a una dilución 1:100 se realizó durante 16 horas a temperatura ambiente. Después de lavar en PBS (Phosphate Buffered-sales) tres veces, la inmunotinción secundaria con Histofine simple mancha MAX-PO (G) (Nichirei, Tokyo, Japón) se realizó durante 30 min a temperatura ambiente. Después de lavar en PBS tres veces, los productos de reacción se visualizaron en solución tetrahidrocloruro de 20 mg /dl 3,3'-diaminobencidina que contiene una gota de 30% H _{2O 2, seguido por lavado con PBS. contratinción nuclear se realizó con hematoxilina de Mayer. Para MUC5AC y MUC2, calefacción hidratada en 1 mM EDTA (pH 8,0) a 120 ° C se llevó a cabo por primera vez en una olla a presión (Delicio 6L; T-FAL, Rumily, Francia) durante 10 minutos para la recuperación de antígenos. La inmunotinción con anti-primaria MUC5AC de anticuerpos (NCL-MUC-5AC, Novocastra, Newcastle-upon-Tyne, Reino Unido) a una dilución 1:200 o anti-anticuerpo MUC2 (NCL-NUC-2, Novocastra) a una 1:500 dilución se llevó a cabo durante 16 horas a temperatura ambiente. Después de lavar en PBS tres veces, la inmunotinción secundaria con Histofine simple mancha MAX-PO (G) (Nichirei) se realizó durante 30 min a temperatura ambiente. El siguiente paso fue la misma que CTSE tinción inmunológica. Todas las secciones immunostained se evaluaron de forma independiente por dos patólogos, junto con SE-manchado secciones y PAS manchadas de las mismas lesiones.}

Las muestras tumorales

Entre los tejidos de cáncer gástrico en bancos en la Salud Fujita Escuela universitaria de Medicina, se seleccionaron 51 carcinoma de células en anillo de sello gástrica (SIG) muestras resecado quirúrgicamente. Por otra parte, 67 de cáncer gástrico especímenes quirúrgicos de otros cinco tipos de adenocarcinoma gástrico (tub1, tub2, por, pap, y muc) fueron seleccionados al azar del mismo banco. Para las muestras resecadas endoscópicamente, se seleccionaron 84 muestras (78 casos de cáncer gástrico y 6 casos de adenoma gástrico) que fueron tratados en el Hospital de la Universidad de Tokio, de 2005 a 2011. Para todas las muestras clínicas, consentimientos informados escritos se obtuvieron de los pacientes correspondientes de acuerdo con la Declaración de Helsinki. Este estudio fue aprobado por el comité de revisión ética institucional para la investigación humana de la Universidad de Fujita de la Salud, y también fue aprobado por los comités de ética de la Universidad de Tokio.

Retrovirus vectores

Para generar vectores retrovirales que expresan Cdx2
, Gli1
, Gli3
, CTSE
, y Sox2
, respectivos ADNc se insertaron en pMXs-IRES -puro (Cell Biolabs Inc., San Diego, CA) como sigue. Para Cdx2
, pMXs-Cdx2-IRES-Puro se generó como se informó anteriormente [26]. Gli1
cDNA se obtuvo de pCR-XL-TOPO-Gli1 (Open Biosystems, Huntsville, AL) a través de la amplificación por PCR usando los cebadores 5'-agccagatctatgagcccatctctgggattc-3 'y 5'-agtagcggccgcccctactctttaggcactagagt-3'. Después de la doble digestión con Bgl II y Not I, se insertó el fragmento obtenido en el sitio /Not I BamH I de pMXs-IRES-Puro (Cell Biolabs Inc., San Diego, CA) para generar pMXs-Gli1-IRES-Puro. Gli3
cDNA se obtuvo de pCR-XL-TOPO-Gli3 (Open Biosystems) a través de la amplificación por PCR usando los cebadores 5'-aatgcggccgctgatttccgttggt-3 'y 5'-tgcggatcctacgtgggcatttttg-3'. Después de la doble digestión con BamH I y Not I, el fragmento obtenido se insertó en el BamHI /No I sitios de pMXs-IRES-Puro para generar pMXs-Gli3-IRES-Puro. CTSE
cDNA se obtuvo a partir de pCMV-SPORT6-CTSE (Thermo Fisher Scientific, Madison, WI) a través de la amplificación por PCR usando los cebadores 5'-ccgagatctatgaaacgctccttcttttg-3 'y 5'-gggctcgagtaaaactgtcgaatgaaga-3'. Después de la doble digestión con Bgl II y Xho I, el fragmento obtenido se insertó en los sitios BamH I /Xho I de pMXs-IRES-Puro para generar pMXs-CTSE-IRES-Puro. Sox2
cDNA se obtuvo de MKN-7 ADN genómico mediante amplificación por PCR usando los cebadores 5'-atgtacaacatgatggagacggagct-3 'y 5'-tcacatgtgtgagaggggcagtgtg-3'. El fragmento amplificado se insertó en los sitios EcoR V de pT7Blue-T vector (Novagen, Darmstadt, Alemania) para generar pT7Blue-Sox2. Después de la doble digestión con BamH I y Sal I, el fragmento obtenido se insertó en los sitios BamH I /Xho I de pMXs-IRES-Puro para generar pMXs-Sox2-IRES-Puro. Por cotransfección de estos plásmidos con envoltura del virus de la estomatitis vesicular proteína G (VSV-G) en el plásmido de expresión PLAT-GP preenvasado línea celular (Cell Biolabs Inc.), respectivamente, los vectores retrovirales basados ​​en MuLV VSV-G-pseudotyped expresando Cdx2
, Gli1
, Gli3
, CTSE
, y Sox2
estaban preparados.

resultados

expresión de catepsina E (CTSE)
es significativamente correlacionado con Originado histológico tipo de líneas celulares de cáncer gástrico

para buscar los genes marcadores de tipo SIG GC, que exhibió la expresión de varios genes reportado para mostrar la expresión distintiva entre CG de tipo intestinal y difuso de Lauren. La expresión de E-cadherina gratis ( CDH-1

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