PLoS ONE: Cathepsin E è un marker di differenziazione gastrico e Sigillo-Ring carcinoma dello stomaco: un suggerimento romanzo sul gastrico Tumorigenesis

Astratto

cancro gastrico (GC) presenta varie caratteristiche istologiche, anche se il meccanismo alla base la sua diversità è raramente chiarito. Si è classificato principalmente in adenocarcinoma ben differenziato tubolare (tub1), adenocarcinoma tubolare moderatamente differenziato (tub2), adenocarcinoma scarsamente differenziato (por), carcinoma a cellule ad anello con castone (SIG), adenocarcinoma mucinoso (MUC), e l'adenocarcinoma papillare (PAP). Con lo screening, abbiamo trovato catepsina E (CTSE)
esprime universalmente in sig-tipo, di tanto in tanto a por-tipo, e raramente in tub1 /tub2 tipo linee di cellule GC. Nei campioni chirurgicamente resecati, CTSE è stato immunostained in 50/51 sig-tipo (98,0%), 3/10 tub1-tipo (30,0%), 7/18 tub2-tipo (38,9%), 15/26 por-tipo ( 57,7%), 4/10 pap-tipo (40,0%), e 0/3 MUC-tipo (0,0%) GC. Nei campioni endoscopicamente-resezione, 6/7 sig-tipo (85,7%), 7/52 tub1-tipo (13,7%), 5/12 tub2-tipo (41,7%), 2/7 pap-tipo (28,6%) GC e 0/6 adenoma (0,0%) ha espresso CTSE. Per tessuti non maligni, CTSE è universalmente espresso in fundica normale, pilorica e ghiandole cardiache di stomaco, ma difficilmente in altri organi digestivi. Nella metaplasia intestinale precancerose dello stomaco, CTSE si osserva principalmente nel tipo di gastrico-e-intestinale mista e carenti di tipo esclusivamente-intestinale. espressione CTSE è positivamente correlata con l'indicatore gastrica MUC5AC ( p
< 0,0001) e negativamente correlata con pennarello intestinale MUC2 ( p = 0,0019
). Per sig-tipo GC, in entrambi i tumori e lo sfondo della mucosa, espressione di MUC5AC e CTSE è alto, mentre quello della MUC2 è basso, indicando che in ordine di tipo GC riflette le caratteristiche di fondo della mucosa. Per adenoma gastrica e tub1 /tub2-tipo GC, i tumori più indifferenziati tendono a mostrare più alta espressione di CTSE con MUC5AC e bassa espressione di MUC2 nei tumori, ma tendono a presentare più bassa espressione del CTSE, MUC5AC e MUC2 in background mucosa. Questi suggeriscono che più maligna adenocarcinoma gastrico con forte gastrica e deboli proprietà intestinali tendono a derivare da sfondo mucosa con diminuzione sia le caratteristiche gastriche e intestinali. In conclusione, CTSE è un marker di differenziazione sia gastrica e carcinoma a cellule ad anello con castone, che dovrebbe far luce sul meccanismo della tumorigenesi gastrica

Visto:. Konno-Shimizu M, N Yamamichi, Inada Ki, Kageyama- Yahara N, K Shiogama, Takahashi Y, et al. (2013) Cathepsin E è un marker di differenziazione gastrico e Sigillo-Ring carcinoma dello stomaco: un suggerimento Novel sul gastrico Tumorigenesis. PLoS ONE 8 (2): e56766. doi: 10.1371 /journal.pone.0056766

Editor: Anthony W.I. Lo, l'Università cinese di Hong Kong, Hong Kong

Ricevuto: 20 novembre 2012; Accettato: 14 Gennaio, 2013; Pubblicato: 22 febbraio 2013

Copyright: © 2013 Konno-Shimizu et al. Questo è un articolo ad accesso libero distribuito sotto i termini della Creative Commons Attribution License, che permette l'uso senza restrizioni, la distribuzione e la riproduzione con qualsiasi mezzo, a condizione che l'autore originale e la fonte sono accreditati

Finanziamento:. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da una sovvenzione da Sato Memorial Foundation for Cancer Research, in parte da una borsa di studio da Nakayama Cancer Research Institute, in parte da una borsa di studio dalla Fondazione per la promozione della ricerca sul cancro, e in parte anche da grant-in- aiuti per giovani scienziati (B) del Ministero della Pubblica Istruzione, Cultura, Sport, Scienza e Tecnologia (MEXT). Ma tutti i finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto

Competere interessi:.. Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi in competizione

Introduzione

cancro gastrico (GC) è il quarto cancro più comune e la seconda causa di morte per cancro in tutto il mondo, nonostante la progressiva diminuzione della sua incidenza e la mortalità [1], [2]. È ben noto che neoplasia gastrica presenta varie caratteristiche istologiche [3]. La classificazione più diffusa di cancro gastrico è la classificazione Lauren che distingue intestinale (differenziato) tipo GC e diffusa (indifferenziata) di tipo GC [4]. Lauren digitazione è semplice e facile da capire, anche se la sua semplificazione spesso porta a incapacità di riflettere le caratteristiche precise di malignità gastrica [3]. In più dettagliata classificazione giapponese di cancro gastrico [5], che è simile alla classificazione WHO [6], adenocarcinoma gastrico è classificato in sei categorie: adenocarcinoma tubolare ben differenziato (tub1), adenocarcinoma tubolare moderatamente differenziato (tub2), scarsamente differenziato adenocarcinoma (por), carcinoma a cellule ad anello con castone (sIG), adenocarcinoma mucinouse (MUC), e l'adenocarcinoma papillare (PAP). In linea generale, diffuso di Lauren (indifferenziata) tipo comprende Porto-, segnale, e MUC-tipo GC, mentre intestinale di Lauren (differenziato) tipo tub1- comprende, tub2-, e pap-tipo GC [3].

Tra i vari tipi istologici GC, ci siamo concentrati sul carcinoma a cellule ad anello con castone (SRCC) dello stomaco (in ordine di tipo GC). SRCC è un adenocarcinoma mucina-secernenti, in cui mucina intracitoplasmatica comprime i loro nuclei di dare le cellule caratteristico aspetto "ad anello con castone" [7]. Mentre SRCC stato segnalato per essere originati da vari tessuti, stomaco è l'organo più comune di origine [7], [8]. Nonostante la frequente prevalenza di SRCC tra i tumori gastrici, le caratteristiche clinico-patologici di sig-tipo GC sono ancora controversi; alcuni studi precedenti hanno riportato che istologia a cellule ad anello con castone presenta una prognosi migliore [9], [10], [11], mentre altri studi hanno riportato che l'istologia di SRCC è un segno di piuttosto prognosi peggiore [8], [12], [ ,,,0],13], [14]. In tale contesto, abbiamo cercato di trovare nuovi geni marcatori specifici per SIG-tipo GC. Nella maggior parte degli studi precedenti [15], [16], [17], in ordine di tipo GC era stato analizzato insieme a por-tipo e MUC-tipo, perché questi tre tipi di GC sono classificati in tipo diffuso di Lauren. Tuttavia, molte relazioni hanno indicato che in ordine di tipo GC è molto diverso da Porto- o MUC-tipo GC, dal punto di vista delle caratteristiche molecolari o potenzialità maligne [3], [13], [18]. Pertanto, abbiamo analizzato il sig-tipo GC indipendentemente dalla GC porto- e MUC-tipo.

Tra il vasto numero di geni, abbiamo proiettato diversi quelli, come caderina
geni della famiglia [19 ], [20], umani mucina
geni [21], vimentin
[22], catepsina
geni della famiglia [23], [24], [25] , ecc, le cui espressioni sono stati segnalati per essere diverse tra intestinale e diffuso tipo GC di Lauren. Lo scopo principale del nostro studio è trovare un indizio per carcinogenesi irrisolto del sig-tipo GC attraverso l'identificazione dei suoi geni marcatori specifici. Ci aspettavamo che il nostro processo porterebbe a geni sconosciuti a monte normativi (quali fattori di trascrizione specifici) che determinano le proprietà del sig-tipo GC. Alcuni fattori di trascrizione per immobili gastrointestinali sono stati chiariti, come cdx
geni della famiglia [26], [27], Gli
geni della famiglia [28], e Sox2
[29], ma crediamo non pochi geni cruciali per la differenziazione gastrointestinale e oncogenesi gastrico rimangono ancora da scoprire. Un altro scopo del nostro studio è quello di analizzare la fase molto precoce di tumori gastrici in base alla espressione di nuovi geni marcatori identificati. Non solo concentrandosi su ordine a-tipo GC, abbiamo ulteriormente chiamati a valutare tutti i tipi di casi GC primi analizzando identificato l'espressione del gene marcatore sia nella lesione tumorale e della mucosa adiacente. Siamo convinti del nostro lavoro dovrebbe essere una chiave per avvicinarsi alle caratteristiche controversi del sig-tipo GC, e dovrebbe anche essere un vantaggio per chiarire le varie proprietà istologici di tumore maligno gastrico.

Materiali e Metodi

Coltura cellulare

Twenty gastrica, dieci colorettale, e due linee di cellule di cancro non gastrointestinali sono stati mantenuti in DMEM con 10% di siero fetale di vitello (Gibco /Invitrogen, Carlsbad, CA) a 37 ° C [30], [31]. Tutte le linee cellulari sono stati acquistati dalla American Type Culture Collection, RIKEN Cell Bank, o cella centro di risorse per Biomedical Research Institute di sviluppo, l'invecchiamento e il cancro, Università di Tohoku. Nomi e tipi istologici di linee cellulari tumorali utilizzati sono stati descritti minuziosamente nel documento giustificativo S1. Per demetilazione DNA reagente e istone deacetilasi inibitore (HDAC), 5-Aza-2'-deossicitidina (5-Aza-dC, Sigma-Aldrich) a 2 ug /ml o tricostatina A (TSA, Sigma-Aldrich) a 100 ng /ml sono stati aggiunti al mezzo di coltura.

RT-PCR

RNA cellulare totale sono stati preparati utilizzando il reaent isolamento ISOGEN RNA (Wako, Osaka, Giappone), come descritto in precedenza [30]. Semi-RT-PCR quantitativa è stata effettuata attraverso l'apice reazione One-Step utilizzando il Platinum Taq (Gibco /Invitrogen). Le procedure di coppie di primer e RT-PCR utilizzati per rilevare i livelli di espressione della E-caderina (CDH-1)
, LI-caderina (CDH-17)
, MUC5AC
, MUC6
, MUC2
, CTSE (catepsina E)
, CTSD (catepsina D)
, CTSB (Cathepsin B)
, CtSL (Cathepsin L)
, e GAPDH
sono mostrati nella Tabella S1.

Western Blotting

estratti di cellule intere (20 mcg ciascuna) lisato e bollito con 1x tampone del campione [30] sono stati separati mediante elettroforesi su 12,5% gel di SDS poliacrilammide, trasferito alla membrana di nitrocellulosa (Hybond-N, Amersham, Friburgo, Germania), e immunostained con anti-umano Cathepsin e anticorpo (# AF1294, R & D Systems, Minneapolis, MN) anticorpo anti-umano β-actina (C4) (# sc-47778, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) o. Per il secondo anticorpi, perossidasi di rafano (HRP) coniugata anti-IgG di capra (H + L) anticorpo asino (ˁ-035-003, Jackson, Baltimora, PA) e perossidasi di rafano (HRP) coniugata anti-topo IgG (H + L) anticorpo di capra (# A90-216P, Bethyl, Montgomery, TX) sono stati rispettivamente utilizzati. bande specifiche sono state rilevate con Immunostar LD (Wako, Osaka, Giappone) e LAS-4000 (Fuji Film, Tokyo, Giappone).

L'immunoistochimica

Sparaffinatura e endogena perossidasi inattivazione dei tessuti clinici sono stati eseguiti come precedentemente descritto [3]. Per CTSE, l'immunocolorazione primaria con anticorpo anti-umano CTSE capra policlonale (# AF1294, R & D Systems) a una diluizione 1:100 è stata eseguita per 16 ore a temperatura ambiente. Dopo il lavaggio in PBS per tre volte, l'immunocolorazione secondaria (tamponata al fosfato Salts) con Histofine Simple Stain MAX-PO (G) (Nichirei, Tokyo, Giappone) è stato eseguito per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo lavaggio in PBS per tre volte, i prodotti di reazione sono stati visualizzati in soluzione tetraidrocloride 20 mg /dl 3,3'-diaminobenzidina contenente un calo del 30% H _{2O 2, seguita da lavaggio con PBS. di contrasto nucleare è stata compiuta con ematossilina di Mayer. Per MUC5AC e MUC2, riscaldamento idratata in 1 mM EDTA (pH 8.0) a 120 ° C per la prima volta eseguita in una pentola a pressione (Delicio 6L, T-FAL, Rumily, Francia) per 10 minuti per il recupero antigene. L'immunostaining primaria con l'anti-anticorpo MUC5AC (NCL-MUC-5AC, Novocastra, Newcastle-upon-Tyne, UK) ad una 1:200 diluizione o anti-MUC2 anticorpi (NCL-NUC-2, Novocastra) ad una 1:500 diluizione è stato eseguito per 16 ore a temperatura ambiente. Dopo il lavaggio in PBS per tre volte, l'immunocolorazione secondario con Histofine Simple Stain MAX-PO (G) (Nichirei) è stata effettuata per 30 minuti a temperatura ambiente. Il passo successivo è stato lo stesso di CTSE colorazione immunologica. Tutte le sezioni immunostained sono stati valutati indipendentemente da due patologi, insieme con HE-macchiato e sezioni PAS macchiati dalle stesse lesioni.}

tumorali Campioni

Tra i tessuti di cancro gastrico sopraelevate alla Salute Fujita University School of Medicine, abbiamo selezionato 51 carcinoma a cellule ad anello con castone gastrica (sIG) campioni chirurgicamente asportati. Inoltre, 67 di cancro gastrico campioni chirurgici di altri cinque tipi di adenocarcinoma gastrico (tub1, tub2, por, pap, e MUC) sono stati selezionati in modo casuale dalla stessa banca. Per i campioni endoscopicamente resezione, abbiamo selezionato 84 campioni (78 casi di cancro gastrico e 6 casi di adenoma gastrico) che sono stati trattati presso l'Università di Tokyo Hospital dal 2005 al 2011. Per tutti i campioni clinici, consensi informati scritti sono stati ottenuti dai pazienti corrispondenti secondo la Dichiarazione di Helsinki. Questo studio è stato approvato dal consiglio revisione etica istituzionale di indagine umana Fujita University Health, ed è stato anche approvato dai comitati etici dell'Università di Tokyo.

Retrovirus Vettori

Per generare vettori retrovirali esprimendo Cdx2
, Gli1
, GLI3
, CTSE
, e Sox2
, rispettivi cDNA sono stati inseriti in pMXs-IRES -puro (Cell Biolabs Inc., San Diego, CA) come segue. Per Cdx2
, pMXs-Cdx2-IRES-puro è stato generato come riportato in precedenza [26]. Gli1
cDNA è stato ottenuto da PCR-XL-TOPO-Gli1 (Open Biosystems, Huntsville, AL) mediante PCR usando primer 5'-agccagatctatgagcccatctctgggattc-3 'e 5'-agtagcggccgcccctactctttaggcactagagt-3'. Dopo doppia digestione con Bgl II e Non io, il frammento ottenuto è stato inserito nel sito /Non ho BamH I pMXs-IRES-puro (Cell Biolabs Inc., San Diego, CA) per generare pMXs-Gli1-IRES-puro. GLI3
cDNA è stato ottenuto da PCR-XL-TOPO-GLI3 (Open Biosystems) mediante PCR usando primer 5'-aatgcggccgctgatttccgttggt-3 'e 5'-tgcggatcctacgtgggcatttttg-3'. Dopo doppia digestione con BamH I e Non io, il frammento ottenuto è stato inserito nel BamH I /Not I siti di pMXs-IRES-Puro di generare pMXs-GLI3-IRES-puro. CTSE
cDNA è stato ottenuto da pCMV-SPORT6-CTSE (Thermo Fisher Scientific, Madison, WI) tramite PCR usando primer 5'-ccgagatctatgaaacgctccttcttttg-3 'e 5'-gggctcgagtaaaactgtcgaatgaaga-3'. Dopo doppia digestione con Bgl II e Xho I, il frammento ottenuto è stato inserito nei siti BamH I /Xho I di pMXs-IRES-puro per generare pMXs-CTSE-IRES-puro. Sox2
cDNA è stato ottenuto da MKN-7 DNA genomico mediante PCR usando primer 5'-atgtacaacatgatggagacggagct-3 'e 5'-tcacatgtgtgagaggggcagtgtg-3'. Il frammento amplificato è stato inserito nei siti EcoR V di pT7Blue-T vettore (Novagen, Darmstadt, Germania) per generare pT7Blue-Sox2. Dopo doppia digestione con BamH I e Sal io, il frammento ottenuto è stato inserito nei siti BamH I /Xho I di pMXs-IRES-puro per generare pMXs-Sox2-IRES-puro. Con cotrasfezione di questi plasmidi con la busta virus della stomatite vescicolare G proteine ​​(VSV-G) plasmide di espressione in PLAT-GP preconfezionamento linea cellulare (Cell Biolabs Inc.), rispettivamente, VSV-G-pseudotyped vettori retrovirali basati MuLV esprimendo Cdx2
, Gli1
, GLI3
, CTSE
, e Sox2
sono stati preparati.

Risultati

l'espressione di catepsina E (CTSE)
è significativamente correlata con Originato istologica di tipo gastrico Cancer Cell Lines

per cercare i geni marcatori per sIG di tipo GC, abbiamo proiettato l'espressione di diversi geni riferito a mostrare espressione distintiva tra intestinale e diffuso tipo GC di Lauren. L'espressione di E-caderina
( CDH-1
) [19], LI-caderina
( CDH-17
) [20], MUC5AC
[21], MUC6
[21], MUC2
[21], vimentin
[22], CTSD
( catepsina D
) [23], [24], CTSE
( catepsina E
) [23], [24], CTSB
( catepsina B
) [25], CtSL
( catepsina L
) [25], e GAPDH
(controllo interno) geni erano valutata mediante RT-PCR in 20 linee GC insieme con 12 linee di cellule tumorali derivate da altri organi (Figura 1A). Abbiamo poi rivolto la nostra attenzione al CTSE
, come si esprime sia in Kato-III e NUGC-4 derivato dal sig-tipo GC, e anche perché non esprime in MKN-7 e H-111-TC conosciuto per essere originato da adenocarcinoma tubolare ben differenziato dello stomaco (tub1-tipo GC, documento giustificativo S1).

per gli altri geni esaminati, espressione di CDH-1
( E- caderina
), segnalato per essere spesso carenti di tipo diffuso GC di Lauren [19], [32], [33], è stato inaspettatamente rilevato nelle due celle GC-derivato sig-tipo (Figura 1A). E 'stato anche inaspettato che CDH-17
( LI-caderina
), pensato per essere un gene marcatore intestinale [20], [26], [27], esprime in quasi tutto il linee di cellule di cancro gastrico tra cui sig-tipo (Figura 1A). Per gli altri geni della famiglia catepsina, CTSD
stato segnalato per essere altamente espresso nel tipo di GC diffuso e anche un parametro prognostico per i pazienti carcinoma gastrico [23], [34], ma i risultati di RT-PCR ha rivelato che tutti le linee di cellule tumorali esaminate ugualmente espresso CTSD
(Figura 1A). CTSB
e CtSL
sono stati segnalati per essere elevato in carcinoma gastrico [35] e correlato con la proprietà maligna [36], ma specifica espressione di alcuno CTSB
o CtSL
in sig tipo linee di cellule GC-derivato potrebbe essere rilevato (Figura 1A). Nel complesso, il profilo di espressione di CTSE
sembra essere molto diverso da altri geni della famiglia catepsina.

Abbiamo poi valutato la relazione tra l'espressione CTSE e il tipo istologico di linee cellulari 20 GC. Sulla base della sorveglianza dettagliata delle letterature descritte in "istologico tipo di cancro gastrico delle cellule Lines" di sostenere Documento S1, 19 linee di cellule GC possono essere ordinati per Lauren e la classificazione giapponese [3], [4], [5] (Tabella 1) . Secondo la classificazione Lauren, 7 di 11 cellule di GC-derivati ​​di tipo diffuso e 1 su 5 cellule GC-derivato di tipo intestinale esprimono CTSE (Tabella 1): CTSE
gene tende ad essere espressa in tipo diffuso e carenti di tipo GC intestinale. Associazione tra espressione CTSE e caratteristica istologica di tumore maligno gastrico diventa più chiaro quando si applica più precisa classificazione giapponese. Tra le linee cellulari di tipo GC diffuso, è da notare che NUGC-4 e Kato-III originati da sig-tipo GC fortemente esprimere CTSE, mentre SH-10-TC e KE-97 originati da MUC-tipo GC sono carenti di CTSE espressione. Per le cellule derivate da por-tipo GC, il tipo istologico più frequente di tumore maligno gastrico [3], espressione CTSE è varia: MKN-45, KE-39, HuG1-PI, HuG1-N, e AGS esprimono fortemente CTSE, mentre GCIY e HGC-27 sono carenti di espressione CTSE. Al contrario, tra le linee cellulari di tipo GC intestinale di Lauren, cioè tub1 e tub2 di classificazione giapponese, MKN-7, H-111-TC, MKN-74, e AZ521 mancano espressione CTSE, con una sola eccezione dei NCI-N87 mostrando espressione CTSE evidente.

Da questi risultati, abbiamo ipotizzato che l'espressione del CTSE è significativamente correlata con il tipo istologico del tumore gastrico. Per altri rari tipi di linee cellulari GC, MKN-1, ECC-10, ed ECC-12 sono assolutamente carenti di espressione CTSE (Figura 1A, Tabella 1).

L'espressione di catepsina E (CTSE )
Gene è regolamentato Majorly alla trascrizione livello

con il 13 gastrico, 5 del colon-retto, e 2 altre linee cellulari di cancro, la produzione di proteine ​​CTSE è stato analizzato mediante Western blotting (Figura 1B). 7 delle 20 linee di cellule sono stati valutati anche mediante immunoistochimica (Figura S1). Nelle analisi entrambi i CTSE
espressione di mRNA e la produzione di proteine ​​CTSE sono stati per lo più accoppiate, suggerendo CTSE
espressione è regolata principalmente a livello trascrizionale. Inoltre, tutto-o-nulla espressione di CTSE mostrato in RT-PCR, Western blotting, e immunoistochimica ha suggerito che le cellule di cancro gastrico sarebbero chiaramente classificati in due categorie:. Tipo CTSE-esprimere e di tipo CTSE-carenti

per studiare la regolazione del CTSE
gene, due importanti farmaci epigenetici, agente demethylating 5-Aza-2'-deossicitidina e inibitore dell'istone deacetilasi tricostatina a [37], sono stati applicati a cinque linee di cellule GC (Figura 1C) . Tre CTSE che esprimono e sono stati trattati due linee di cellule GC CTSE deficienti, ma non siamo riusciti a rilevare eventuali cambiamenti di CTSE
trascrizione (Figura 1C). Per metilazione, abbiamo cercato anche isole CpG nella regione del promotore suggestiva umana CTSE
gene utilizzando due siti web: "http://www.uscnorris.com/cpgislands2/cpg.aspx" dimostrando isola ricercatore e CpG " http://www.ncbi.nlm.nih.gov "sostenuto dal National center for Biotechnology Information (NCBI). I risultati di entrambe le ricerche hanno suggerito che il promotore di umana CTSE
gene è caratterizzato da una percentuale inferiore di dinucleotidi CpG (55%) e nessuna isola CpG, che sono in linea con i nostri risultati (Figura 1C).

In aggiunta, abbiamo valutato l'effetto di quattro fattori di trascrizione che sono stati segnalati per regolare molti geni gastrointestinali: CDX2
[26], [27], Gli
famiglia ( Gli1
e GLI3
) [28], e Sox2
[29]. Sotto la trasduzione stabile di CDX2
, Gli1
, GLI3
, e Sox2
, tuttavia, non abbiamo potuto rilevare un cambiamento evidente di CTSE
espressione (Figura 1D). Allo stato attuale, non siamo riusciti a chiarire il meccanismo di regolazione del CTSE
gene, che dovrebbe essere risolto in futuro.

Cathepsin E (CTSE) è sicuramente Espresso in anello con castone carcinoma a cellule di stomaco

Per convalidare la speculazione dalle linee cellulari GC (Tabella 1, Figura 1A), abbiamo analizzato la prossima espressione CTSE in campioni clinici. In un primo momento, sono stati valutati 51 campioni GC in ordine di tipo chirurgicamente asportati. Sorprendentemente, evidente colorazione del CTSE è stata osservata in tutti i 51 campioni esaminati, e in 50 su 51 casi, cellule CTSE-positivi occupato più del 90% delle cellule tumorali nel tumore (Tabella 2).

Avanti, 67 campioni chirurgici derivanti da casi GC diversi sig-tipo sono stati analizzati, che ha presentato vari modelli di espressione CTSE (Tabella 2). espressione CTSE in por tipo GC è ovviamente maggiore rispetto ad altri quattro tipi di GC, anche se era molto inferiore a quella del sig tipo GC (Tabella 2). La prevalenza di cellule positive CTSE in tub1-, tub2-, Pap, e MUC-tipo GC è sicuramente inferiore, ma non è così basso da altri normali organi digestivi (Tabella 2). immagini di immunoistochimica tipici di CTSE in sei tipi di GC sono mostrati in figura 2 (SIG e tub1) e Figura S2 (tub2, pap, por, e MUC).

Sulla base del risultato di campioni chirurgici, abbiamo ulteriormente espressione CTSE analizzato 84 campioni di tumore gastrico per via endoscopica resezione. Rispetto al chirurgicamente esemplari, l'istologia del tessuto asportato endoscopicamente è molto più omogenea; è stato quindi previsto che l'associazione tra espressione CTSE e Istologia del cancro gastrico potrebbe essere analizzato con maggiore precisione. Essi prevedevano 78 casi di adenocarcinoma precoce fase (7 del sig-tipo, 52 di tub1-tipo, 12 di tub2-tipo, e 7 di pap-tipo GC) e 6 casi di adenoma precancerose (Tabella 3). CTSE espressione di segnale, tub1-, tub2-, e pap-tipo GC nei tessuti asportati endoscopicamente assomiglia a quelli asportati chirurgicamente con corrispondente istologia (Tabelle 2 e 3). Calcolati CTSE espressione punteggi (Tabella 3) mostrano chiaramente una tendenza che CTSE esprime sicuramente in sig-tipo GC, mentre tende ad essere carente in tub1- e tub2 tipo GC. Va inoltre notato che adenoma gastrica, che può essere considerato come più differenziato caratteristica istologica rispetto al tub1 di tipo GC, ha mostrato il più forte deficit di CTSE (tabella 3).

CTSE non è solo un indicatore di Sigillo -ring carcinoma dello stomaco, ma anche un gastrico differenziazione marker

per esaminare la distribuzione dei CTSE in budello normale e stomaco precancerosa, immunocolorazione del CTSE è stato ulteriormente applicato a stomaco non-cancerose e di altri organi dell'apparato digerente. Nello stomaco, senza atrofia e metaplasia intestinale, espressione del CTSE è chiaramente osservata nelle ghiandole fundica e pilorica dello stomaco (Figura S3D /S3A S3E /S3B). ghiandole cardiache di stomaco esprimono anche CTSE, anche se è piuttosto debole di espressione in ghiandole fundica o piloriche (Figura S3F /S3C). Contrastivamente, CTSE è raramente espressa in esofago, duodeno, intestino tenue e crasso (figura S4).

Abbiamo valutato ulteriore espressione CTSE nella mucosa gastrica con metaplasia intestinale, una condizione precancerosa ben noto di stomaco [26 ], [29], [38]. Come mostrato in figura 3A, ghiandole fundica gastrici e intestinali ghiandole metaplastiche mostrano colorazione contrastiva di CTSE. In genere, metaplasia intestinale è classificato in due categorie: di tipo misto gastrico-e-intestinale (tipo incompleto) e di tipo esclusivamente intestinale (tipo completo) [29], [38]. E 'ben noto che il primo si esprime sia MUC5AC (gastrica marcatore mucina) e MUC2 (intestinale marcatore mucina), mentre il secondo non si esprime MUC5AC ma MUC2 [29]. In entrambi i tipi di metaplasia intestinale nello stomaco, abbiamo confermato che l'espressione del CTSE è simile a MUC5AC e di fronte a MUC2 (Figura 3B e 3C).

Per valutare l'associazione di espressione CTSE con espressione MUC5AC e MUC2, la loro immunocolorazione è stata valutata utilizzando statisticamente endoscopicamente asportato 84 tessuti tumorali gastriche (Tabella S2). La correlazione analisi ha mostrato che l'espressione CTSE è positivamente associato con pennarello gastrica MUC5AC ( p
< 0,0001) e negativamente associata con pennarello intestinale MUC2 ( p = 0,0019
). In sintesi, abbiamo concluso che CTSE, come MUC5AC, è uno dei marcatori di differenziazione gastrici.

Più indifferenziato tubolare Adenocarcinoma Tende a Sorgi dal fondo mucosa con diminuzione Sia "gastrico" e "intestinale" Caratteristiche

Per studiare il passo avvio della tumorigenesi gastrica, lo sfondo mucosa del precoce del cancro e adenoma è stata ulteriormente valutata, utilizzando 84 campioni endoscopicamente resezione. CTSE espressione non cancerose mucosa gastrica adiacente alla lesione tumorale è stata valutata, unitamente MUC5AC e MUC2 (Tabella 4). Per sig-tipo GC, sia la lesione tumorale e sfondo mucosa principalmente mostrato una forte espressione di CTSE e MUC5AC, mentre l'espressione di MUC2 era molto debole in entrambi (Tabella 4). Simili pattern di espressione dei tre marcatori nel tumore e mucosa adiacente suggeriscono che l'inizio del sig tipo GC riflette le caratteristiche di bassa mucosa, dal punto di vista della differenziazione "gastrico" e "intestinale". Vale a dire, in ordine di tipo GC con i non-intestinali proprietà gastrici inizialmente si verifica dallo sfondo mucose con caratteristiche di non-intestinali e gastrici
.

Per adenoma gastrica e adenocarcinoma tubolare (tub1 /tub2-tipo GC), contrastivamente, profili di espressione dei tre marcatori sono molto interessanti (Tabella 4). tumori gastrici Più indifferenziati tendono ad aumentare l'espressione di CTSE e MUC5AC nelle lesioni tumorali (tub2 > >tub1; adenoma), ma diminuisce l'espressione di questi marcatori gastrici nei precedenti mucose (tub2 < tub1 < adenoma). Questi suggeriscono che più indifferenziati (quindi più maligni) tumori gastrici atte a mostrare la proprietà gastrico più forte, mentre tendono a derivare dallo sfondo mucose con diminuzione caratteristiche gastrici. D'altra parte, i tumori gastrici più differenziati tendono ad esprimere MUC2 in entrambe le lesioni tumorali e lo sfondo della mucosa (adenoma > >tub1; tub2). Questo suggerisce che la differenziazione intestinale di sfondo mucosa gastrica porta alle livello intestinale differenziati (quindi meno maligni) tumori gastrici.

Per pap-tipo GC, espressioni di CTSE, MUC5AC, e MUC2 erano notevolmente forte sia la lesione tumorale e della mucosa, che sono molto diverse dai modelli di espressione di tub1 /tub2 tipo GC (Tabella 4) circostante. Pap-tipo GC è classificato in tipo intestinale di Lauren assieme tub1 /tub2-tipo GC, ma le nostre analisi presenti ha suggerito che pap-tipo e tub1 /tub2-tipo GC non dovrebbero trattati nella stessa categoria, dal punto di vista gastrica e intestinale Caratteristiche. Nelle nostre precedenti relazioni analizzando Brm
[3], un possibile gene marcatore chiave di differenziazione intestinale, espressione di Brm in gastrica papillare adenocarcinoma (PAP) è molto diversa da adenocarcinoma tubolare di stomaco (tub1 e tub2). Allo stato attuale, siamo convinti che la differenza tra istologico pap-tipo GC e tub1 /tub2-tipo GC deve essere rigorosamente riconosciuta.

Discussione

Ruoli e regolamento di Cathepsin E (CTSE) nel umano stomaco

cathepsin E (CTSE), un non-lisosomiale intracellulare aspartico proteasi, è una delle proteasi della famiglia catepsina [39], [40]. Un altro aspartico proteasi cathespin D (CTSD), un omologo di CTSE, rappresenta una delle principali attività proteolitica nel componente lisosomiale, ma ruoli funzionali di CTSE non sono stati chiariti [24], [39]. Distribuzione dei due proteasi è molto diversa: CTSD è universalmente esisteva in lisosomi di vari tessuti (coerenti con il risultato in Figura 1A), che CTSE è espresso principalmente nelle cellule del sistema immunitario, quali macropahges, linfociti, cellule dendritiche, ecc [39 ]. Espressione del CTSE nello stomaco è stata riportata anche [23], [24], anche se la funzione fisiologica e patologica della gastrica CTSE è attualmente sconosciuta [39], [40]. Nel presente studio che ha valutato ben 202 campioni clinici gastrici, abbiamo chiaramente mostrato CTSE è sia il marcatore gastrica differenziazione e l'indicatore di carcinoma a cellule ad anello con castone gastrica, ma il significato di espressione CTSE gastrica rimane incerta.

Per analizzare la relazione di espressione CTSE e potenziale oncogeno, abbiamo prodotto il retrovirus vettore MuLV-based [26] portando CTSE
gene e trasdotti in le CTSE deficienti linee di cellule di cancro gastrico: MKN-74, SH-10 -TC e MKN-1. Abbiamo valutato la possibilità di modificare la produzione di mucina gastrica (Figura S5) o dei loro cambiamenti morfologici, ma è stata osservata nessuna alterazione. Utilizzando queste linee cellulari stabilizzate, abbiamo eseguito ulteriormente sia la formazione di colonie in agar morbido [30] e induzione di apoptosi dal trattamento di actinomicina D, camptotecina, e staurosporine [41]. Tuttavia, abbiamo potuto rilevare l'effetto di espressione CTSE sulla crescita né indipendente né di ancoraggio resistenza all'apoptosi farmaco-indotta (dati non riportati)

Nel recente studio, CTSE è stato segnalato per avere un po 'di potenziale anti-oncogenico.: Kawakubo et al.
dimostrato che CTSE induce specificamente arresto della crescita ed apoptosi nelle linee cellulari di cancro della prostata umana catalizzando il rilascio proteolitici di necrosi tumorale solubile ligando indurre apoptosi-factor-correlato (TRAIL) dalla superficie cellulare [42 ]. Tuttavia, i topi deficienti CTSE-ha fatto né mostra cancro inclini fenotipo né presenti disturbi gastrici evidenti [43], [44], [45]. Allo stato attuale, si tratta di una questione di congetture se l'attività antitumorale riportato CTSE potrebbe applicarsi cancro gastrico tra cui il carcinoma a cellule ad anello con castone. Insieme con il suo regolamento unelucidated e funzione fisiologica, effetti di CTSE sulla differenziazione gastrica e tumorigenesi sono problemi fondamentali che dovrebbero essere risolti in futuro.

gastrico canceration dal punto di vista di "gastrico" e "intestinale" Proprietà di sfondo

• PLoS ONE: acido retinoico-Activated Ndrg1a reprime Wnt /β-catenina segnalazione su Consenti Xenopus Pancreas, Esofago, Stomaco, e duodeno Specification
• PLoS ONE: postoperatoria chemioradioterapia combinazione con epirubicina-Based Triplet chemioterapia per localmente avanzato adenocarcinoma dello stomaco o gastroesofageo Junction