PLOS ONE: cathepsine E est un marqueur de gastrique Différenciation et Sceau-Ring Cell Carcinoma de l'estomac: A Novel Suggestion sur Gastric Tumorigenesis

Résumé

Le cancer gastrique (GC) présente diverses caractéristiques histologiques, bien que le mécanisme sous-jacent sa diversité est rarement élucidé. Il est principalement classés en adénocarcinome bien différencié tubulaire (Bain1), adénocarcinome tubulaire modérément différencié (tub2), peu différencié adénocarcinome (por), carcinome chevalière (sig), adénocarcinome mucineux (CUM), et adénocarcinome papillaire (pap). Par dépistage, nous avons trouvé cathepsine E (CTSE)
exprime universellement en sig type, parfois dans de type por, et rarement dans des lignées cellulaires de GC /de type tub2 de Bain1. Chez les spécimens chirurgicalement réséquées, CTSE a été immunocolorée dans 50/51 sig type (98,0%), 3/10 Bain1 type (30,0%), 7/18 tub2 type (38,9%), 15/26 por type ( 57,7%), 4/10 pap type (40,0%), et 0/3 muc type (0,0%) GC. Dans les échantillons endoscopically-réséquées, 6/7 sig type (85,7%), 7/52 Bain1 type (13,7%), 5/12 tub2 type (41,7%), 2/7 pap type (28,6%) GC et 0/6 adénome (0,0%) ont exprimé CTSE. Pour les tissus non malignes, CTSE est universellement exprimée en fundique normale, pylore, et les glandes cardiaques de l'estomac, mais à peine dans d'autres organes digestifs. Dans la métaplasie intestinale précancéreuse de l'estomac, CTSE est surtout observée dans le type gastrique et intestinal mixte et déficiente en caractères uniquement-intestinal. expression CTSE est positivement corrélé avec le marqueur gastrique MUC5AC ( p
< 0,0001) et une corrélation négative avec le marqueur intestinal MUC2 ( p = 0,0019
). Pour-sig type GC, dans les deux tumeurs et fond muqueuse, l'expression de MUC5AC et CTSE est élevée alors que celle de MUC2 est faible, ce qui indique que de type sig GC reflète les caractéristiques de fond muqueuse. Pour adénome gastrique et /tub2 type Bain1 GC, des tumeurs plus indifférenciées tendent à montrer une expression plus élevée de CTSE avec MUC5AC et d'expression inférieure de MUC2 dans les tumeurs, mais ils ont tendance à présenter une plus faible expression de CTSE, MUC5AC et MUC2 en arrière-plan muqueuse. Ceux-ci suggèrent que plus adénocarcinome gastrique maligne avec gastrique plus forte et les propriétés intestinales plus faibles ont tendance à provenir de fond muqueuse avec une diminution de deux caractéristiques gastriques et intestinales. En conclusion, CTSE est un marqueur de la différenciation gastrique et le carcinome à cellules chevalière, qui devrait faire la lumière sur le mécanisme de la tumorigenèse gastrique

Citation:. Konno-Shimizu M, Yamamichi N, Inada Ki, Kageyama- Yahara N, Shiogama K, Takahashi Y, et al. (2013) cathepsine E est un marqueur de gastrique Différenciation et Sceau-Ring Cell Carcinoma de l'estomac: A Novel Suggestion sur Gastric tumorigenèse. PLoS ONE 8 (2): e56766. doi: 10.1371 /journal.pone.0056766

Editeur: Anthony W.I. Lo, l'Université chinoise de Hong Kong, Hong Kong

Reçu: 20 Novembre 2012; Accepté le 14 Janvier 2013; Publié: 22 Février 2013 |

Droit d'auteur: © 2013 Konno-Shimizu et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Ce travail a été soutenu en partie par une subvention de la Fondation Sato Memorial for Cancer Research, en partie par une subvention de Nakayama Cancer Research Institute, de recherche en partie par une subvention de recherche de la Fondation pour la promotion de la recherche sur le cancer, et également en partie par Grant-in- aide pour jeunes scientifiques (B) du ministère de l'Education, Culture, sports, science et technologie (MEXT). Mais tous les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

introduction

le cancer gastrique (GC) est le quatrième cancer le plus fréquent et la deuxième cause de décès liés au cancer dans le monde, en dépit de la diminution progressive de son incidence et de mortalité [1], [2]. Il est bien connu que la malignité gastrique présente diverses caractéristiques histologiques [3]. La classification la plus largement utilisée du cancer gastrique est la classification Lauren qui distingue intestinale (différenciée) de type GC et diffus (indifférencié) de type GC [4]. Lauren frappe est simple et facile à comprendre, bien que son simplisme conduit souvent à l'incapacité de réfléchir caractéristiques précises de malignité gastrique [3]. Dans la classification japonaise plus détaillée du cancer gastrique [5], qui est similaire à la classification de l'OMS [6], l'adénocarcinome gastrique est classé en six catégories: adénocarcinome tubulaire bien différencié (de Bain1), adénocarcinome tubulaire modérément différencié (tub2), peu différenciés adénocarcinome (por), carcinome chevalière (sig), adénocarcinome mucinouse (CUM), et adénocarcinome papillaire (pap). D'une manière générale, la diffuse de Lauren (indifférencié) de type comprend portion, SIG- et type muc GC, tandis que l'intestin de Lauren (différenciée) type comprend tub1-, tub2- et type pap GC [3].

Parmi les différents types de GC histologiques, nous nous sommes concentrés sur le carcinome à cellules chevalière bague (SRCC) de l'estomac (type sig GC). SRCC est un adénocarcinome de mucine-sécrétant, dans lequel la mucine intracytoplasmique comprime leurs noyaux pour donner les cellules caractéristique "chevalière" apparence [7]. Alors que SRCC a été rapporté à l'origine de divers tissus, de l'estomac est l'organe le plus commun d'origine [7], [8]. Malgré la prévalence fréquente de SRCC parmi les tumeurs malignes gastriques, caractéristiques clinico de type sig GC sont encore controversés; certaines études antérieures ont rapporté que histologie chevalière bague présente un meilleur pronostic [9], [10], [11], alors que d'autres études ont indiqué que l'histologie du SRCC est un signe de plutôt pire pronostic [8], [12], [ ,,,0],13], [14]. Sous un tel contexte, nous avons essayé de trouver de nouveaux gènes marqueurs spécifiques pour-sig type GC. Dans la plupart des études précédentes [15], [16], [17], de type sig GC avait été analysée conjointement avec por-type et de type muc, parce que ces trois types de GC sont classés dans le type diffus de Lauren. Cependant, de nombreux rapports ont suggéré que de type sig GC est très différent du type muc portion ou GC, du point de vue des caractéristiques moléculaires ou des potentiels malins [3], [13], [18]. Par conséquent, nous avons analysé le GC-sig type indépendamment de la GC et portion de type muc.

Parmi le grand nombre de gènes, nous avons projeté plusieurs ceux tels que cadhérine
gènes de la famille [19 ], [20], mucine gènes humains [21], vimentine
[22], cathepsine
gènes de la famille [23], [24], [25] , etc., dont les expressions ont été signalés à être différent entre intestinal et diffus de type GC de Lauren. L'objectif principal de notre étude est de trouver un indice sur la carcinogenèse non résolue de type sig GC grâce à l'identification de ses gènes marqueurs spécifiques. Nous nous attendions à ce que notre essai conduirait à des gènes inconnus en amont réglementaires (tels que les facteurs de transcription spécifiques) qui déterminent les propriétés de type sig GC. Certains facteurs de transcription relatifs aux propriétés gastro-intestinales ont été précisées telles que cdx
gènes de la famille [26], [27], gli
gènes de la famille [28], et sox2
[29], mais nous croyons pas quelques gènes cruciaux pour la différenciation gastro-intestinale et l'oncogenèse gastrique reste encore à découvrir. Un autre but de notre étude est d'analyser le stade très précoce de la tumorigenèse gastrique sur la base de l'expression de nouveaux gènes marqueurs identifiés. Non seulement en se concentrant sur sig type GC, nous avons contesté en outre à évaluer tous les types de cas de GC précoces en analysant l'expression du gène marqueur identifié à la fois la lésion tumorale et de la muqueuse adjacente. Nous sommes convaincus de notre travail devrait être une clé pour aborder les caractéristiques controversées de type sig GC, et devrait également être un chef de file à l'élucidation des diverses propriétés histologiques de malignité gastrique.

Culture cellulaire

Vingt gastrique, dix colorectal et deux lignées de cellules cancéreuses non-gastro-intestinales ont été maintenues dans du DMEM avec 10% de sérum de veau foetal (Gibco /Invitrogen, Carlsbad, CA) à 37 ° C [30], [31]. Toutes les lignées cellulaires ont été achetés auprès de l'American Type Culture Collection, RIKEN banque de cellules, ou une cellule Centre de ressources pour l'Institut de recherche biomédicale du développement, le vieillissement et le cancer, Université de Tohoku. Les noms et les types histologiques de lignées de cellules cancéreuses utilisées ont été décrites minutieusement dans Document de support S1. Pour le réactif de l'ADN de déméthylation et d'histone désacétylases (HDAC), 5-aza-2'-désoxycytidine (5-aza-dC, Sigma-Aldrich) à 2 pg /ml ou la trichostatine A (TSA, Sigma-Aldrich) à 100 ng /on a ajouté ml dans le milieu de culture.

RT-PCR

ARN totaux cellulaires ont été préparés en utilisant le reaent d'isolement d'ARN ISOGEN (Wako, Osaka, Japon) comme décrit précédemment [30]. Semi-quantitative de RT-PCR a été effectuée par la réaction en une seule étape en utilisant la Superscript Platinum Taq (Gibco /Invitrogen). Les paires d'amorces et RT-PCR procédures utilisées pour détecter les niveaux de la E-cadhérine (CDH-1)
, LI-cadhérine (CDH-17)
, MUC5AC expression
, MUC6
, MUC2
, CTSE (cathepsine E)
, CTSD (cathepsine D)
, CTSB (cathepsine B)
, CTSL (cathepsine l)
et

Blotting
Western

extraits de cellules entières GAPDH
sont représentés dans le tableau S1. (20 pg chacun) lysées et on fait bouillir avec 1 x tampon d'échantillon [30] ont été séparés par électrophorèse sur des gels à 12,5% de SDS de polyacrylamide, transférés sur une membrane de nitrocellulose (Hybond-N, Amersham, Fribourg, Allemagne), et immunocolorées avec la cathepsine anti-humaine E anticorps (# AF1294, R & D Systems, Minneapolis, MN) ou β-actine (C4) anticorps anti-humain (# sc-47778, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Pour la deuxième anticorps, la peroxydase de raifort (HRP) conjugué à IgG anti-chèvre (H + L) anticorps d'âne (ˁ-035-003, Jackson, Baltimore, PA) et la peroxydase de raifort (HRP) conjugué à IgG anti-souris (H + L) anticorps de chèvre (# A90-216P, Bethyl, Montgomery, TX) ont été respectivement utilisés. bandes spécifiques ont été détectés avec Immunostar LD (Wako, Osaka, Japon) et LAS-4000 (Fuji Film, Tokyo, Japon).

immunohistochimie

Déparaffinage endogène et la peroxydase inactivation des tissus cliniques ont été réalisées comme précédemment décrit [3]. Pour CTSE, l'immunocoloration avec un anticorps primaire polyclonal de chèvre CTSE anti-humain (# AF1294, R & D Systems) à une dilution 1:100 a été réalisée pendant 16 heures à température ambiante. Après lavage dans du PBS (Phosphate Buffered-sels) à trois reprises, l'immunocoloration secondaire avec Histofine Tache simple MAX-PO (G) (Nichirei, Tokyo, Japon) a été réalisée pendant 30 min à température ambiante. Après lavage dans du PBS trois fois, les produits de réaction ont été visualisés dans une solution de tétrachlorhydrate de 20 mg /dl de 3,3'-diaminobenzidine contenant une baisse de 30% de H _{2 O 2, suivie d'un lavage avec du PBS. La contre nucléaire a été accompli avec l'hématoxyline de Mayer. Pour MUC5AC et MUC2, chauffage hydraté dans 1 mM de tampon EDTA (pH 8,0) à 120 ° C a été réalisée d'abord dans une cocotte-minute (Delicio 6L; T-FAL, Rumily, France) pendant 10 minutes pour la récupération de l'antigène. L'immunocoloration primaire avec anti-MUC5AC anticorps (NCL-MUC-5AC, Novocastra, Newcastle-upon-Tyne, Royaume-Uni) à une dilution ou 1:200 anti-MUC2 anticorps (NCL-NUC-2, Novocastra) à un 1:500 la dilution a été réalisée pendant 16 heures à température ambiante. Après lavage dans du PBS à trois reprises, la coloration immunologique secondaire avec Histofine Tache simple MAX-PO (G) (Nichirei) a été réalisée pendant 30 min à température ambiante. L'étape suivante a été la même que celle CTSE coloration immunologique. Toutes les sections immunocolorées ont été évalués indépendamment par deux pathologistes, avec HE-tachée et sections PAS tachée des mêmes lésions.}

Des échantillons de tumeur

Parmi les tissus de cancer gastrique en banque à la santé Fujita University School of Medicine, nous avons sélectionné 51 gastrique carcinome chevalière en anneau (sig) échantillons réséquées chirurgicalement. En outre, 67 cancer gastrique échantillons chirurgicaux de cinq autres types de adénocarcinome gastrique (Bain1, tub2, por, pap, et muc) ont été choisis au hasard dans la même banque. Pour les échantillons endoscopically réséquées, nous avons sélectionné 84 échantillons (78 cas de cancer gastrique et 6 cas d'adénome gastrique) qui ont été traités à l'Université de l'hôpital de Tokyo de 2005 à 2011. Pour tous les échantillons cliniques, écrit le consentement éclairé ont été obtenues à partir des patients correspondants conformément à la Déclaration d'Helsinki. Cette étude a été approuvée par le comité d'éthique institutionnel pour l'investigation humaine à l'Université Health Fujita, et a également été approuvé par les comités d'éthique de l'Université de Tokyo.

Rétrovirus vecteurs

Pour générer des vecteurs rétroviraux exprimant Cdx2
, Gli1
, GH3
, CTSE
et Sox2
, des ADNc respectifs ont été insérés dans pMXs-IRES -puro (Biolabs Mobile Inc., San Diego, CA) comme suit. Pour Cdx2
, pMXs-Cdx2-IRES-puro a été généré comme indiqué précédemment [26]. Gli1 d'ADNc a été obtenu à partir de pCR-XL-TOPO-Gli1 (Open Biosystems, Huntsville, AL) par l'intermédiaire d'une amplification par PCR en utilisant des amorces 5 'agccagatctatgagcccatctctgggattc-3' et 5'-agtagcggccgcccctactctttaggcactagagt-3 '. Après double digestion avec Bgl II et Not I, le fragment obtenu a été inséré dans le site de pMXs-IRES-puro (Biolabs Mobile Inc., San Diego, CA) /Not I BamH I pour générer pMXs-Gli1-IRES-puro. GH3 d'ADNc a été obtenu à partir de pCR-XL-TOPO-GH3 (Open Biosystems) par amplification par PCR en utilisant des amorces 5 'aatgcggccgctgatttccgttggt-3' et 5'-tgcggatcctacgtgggcatttttg-3 '. Après double digestion avec BamH I et Not I, le fragment obtenu a été inséré dans le BamH I /Non sites pMXs-IRES-puro I pour générer pMXs-GH3-IRES-puro. CTSE d'ADNc a été obtenu à partir de pCMV-SPORT6-CTSE (Thermo Fisher Scientific, Madison, WI) par l'intermédiaire d'une amplification par PCR en utilisant des amorces 5 'ccgagatctatgaaacgctccttcttttg-3' et 5'-gggctcgagtaaaactgtcgaatgaaga-3 '. Après double digestion avec Bgl II et Xho I, le fragment obtenu a été inséré dans les sites BamH I /Xho I du pMXs-IRES-puro pour générer CTSE pMXs-IRES-Puro. ADNc Sox2 d'été obtenu à partir MKN-7, l'amplification de l'ADN génomique par PCR en utilisant des amorces 5 'atgtacaacatgatggagacggagct-3' et 5'-tcacatgtgtgagaggggcagtgtg-3 '. Le fragment amplifié a été inséré dans les sites EcoR V de pT7Blue-T vecteur (Novagen, Darmstadt, Allemagne) pour générer pT7Blue-Sox2. Après un double digestion avec BamH I et Sal I, le fragment obtenu a été inséré dans les sites BamH I /Xho I du pMXs-IRES-puro pour générer Sox2 pMXs-IRES-Puro. Par co-transfection de ces plasmides avec l'enveloppe du virus de la stomatite vésiculaire à la protéine G (VSV-G), le plasmide d'expression dans les PLAT-GP préemballage lignée cellulaire (Cell Biolabs Inc.), respectivement, VSV-G pseudotypés vecteurs rétroviraux à base de MuLV exprimant Cdx2
, Gli1
, GH3
, CTSE
et Sox2
ont été préparés.

Résultats

expression de cathepsine E (CTSE)
est significativement corrélée avec Provenu histologiques Type de lignées cellulaires de cancer gastrique

pour rechercher les gènes marqueurs pour-sig type GC, nous avons projeté l'expression de plusieurs gènes rapporté pour montrer l'expression distinctive entre intestinal et diffus de type GC de Lauren. Expression de E-cadhérine
( CDH-1
) [19], LI-cadhérine
( CDH-17
) [20], MUC5AC
[21], MUC6
[21], MUC2
[21], vimentine
[22], CTSD
( cathepsine D
) [23], [24], ( cathepsine E
) de CTSE [23], [24], CTSB
( cathepsine B
) [25], ( cathepsine L
)
CTSL [25], et GAPDH
(contrôle interne) gènes étaient évaluée par RT-PCR en 20 lignes GC conjointement avec les 12 lignées de cellules cancéreuses dérivées d'autres organes (figure 1A). Nous avons alors orienté notre attention sur le CTSE
, car il exprime à la fois Kato-III et NUGC-4 dérivé de type sig GC, et aussi parce qu'il n'exprime MKN-7 et H-111-TC connu pour être originaire de l'adénocarcinome tubulaire bien différencié de l'estomac (type Bain1 GC, document de support S1).

pour d'autres gènes examinés, expression de CDH-1
( E- cadhérine
), signalé à être souvent déficient dans le type diffus GC Lauren [19], [32], [33], a été inopinément détectée dans les deux cellules de GC dérivés de type sig (figure 1A). Il était également inattendu que CDH-17
( LI-cadhérine), pensé pour être un gène marqueur intestinal [20], [26], [27], exprime dans presque tous les des lignées cellulaires de cancer de l'estomac, y compris sig type (figure 1A). Pour d'autres gènes de la famille de la cathepsine CTSD
a été signalé à être fortement exprimé dans le type diffus GC et aussi un paramètre pronostique pour les patients atteints de carcinome gastrique [23], [34], mais les résultats de RT-PCR a révélé que toutes les lignées cellulaires de cancer examinés aussi express CTSD
(figure 1A). CTSB
et CTSL
ont été signalés à être élevée dans le cancer gastrique [35] et en corrélation avec sa propriété maligne [36], mais l'expression spécifique d'aucun CTSB
ou CTSL
dans des lignées cellulaires dérivées de GC-sig type n'a pu être détectée (figure 1A). Dans l'ensemble, le profil d'expression de CTSE
semble être tout à fait différent des autres gènes de la famille de la cathepsine.

Nous avons ensuite évalué la relation entre l'expression CTSE et le type histologique de lignées cellulaires 20 GC. Sur la base de la surveillance détaillée des littératures décrites dans "histologiques type de cancer gastrique lignées cellulaires" de Document de support S1, 19 lignées de cellules GC peuvent être triées par Lauren et classification japonaise [3], [4], [5] (tableau 1) . Selon la classification de Lauren, 7 des 11 cellules GC dérivé de type diffus et 1 de 5 cellules GC dérivé de type intestinal expriment CTSE (tableau 1): gène CTSE de tendance à être exprimé dans le type diffus et déficient en type intestinal GC. Association entre l'expression CTSE et caractéristique histologique de malignité gastrique devient plus claire lorsque la classification plus précise japonaise est appliquée. Parmi les lignées cellulaires de type diffus GC, il est à noter que NUGC-4 et Kato-III provenaient-sig type GC expriment fortement CTSE, tandis que SH-10-TC et KE-97 provenaient de type muc GC sont déficients en CTSE expression. Pour les cellules dérivées du type à pièce GC, le type histologique la plus fréquente de cancer de l'estomac [3], l'expression CTSE est variée: MKN-45, CA-39, HuG1-PI, HuG1-N et AGS expriment fortement CTSE, alors que GCIY et HGC-27 sont déficientes dans l'expression CTSE. Au contraire, parmi les lignées cellulaires de type intestinal GC Lauren, à savoir Bain1 et tub2 de classification japonaise, MKN-7, H-111-TC, MKN-74, et AZ521 manquent expression CTSE, avec une seule exception du NCI-N87 montrant l'expression de CTSE évidente.

a partir de ces résultats, nous avons émis l'hypothèse que l'expression de CTSE est significativement corrélée avec le type histologique du cancer gastrique. Pour les autres types rares de lignées cellulaires de GC, MKN-1, ECC-10, et ECC-12 sont absolument déficientes dans l'expression CTSE (figure 1A, tableau 1).

Expression de cathepsine E (CTSE )
gènes est régulée Majorly au niveau de transcription

en utilisant le 13 gastrique, 5 colorectal et 2 autres lignées cellulaires du cancer, CTSE la production de protéine a été analysée par transfert de Western (figure 1B). 7 des 20 lignées cellulaires ont également été évalués par immunohistochimie (figure S1). Dans les analyses les l'expression de l'ARNm de CTSE et CTSE la production de protéines ont été la plupart du temps couplé, suggérant CTSE de l'expression est principalement régulée au niveau transcriptionnel. En outre, tout ou rien expression de CTSE montré en RT-PCR, western blot et immunohistochimie a suggéré que les cellules de cancer gastrique seraient clairement classés en deux catégories:. CTSE exprimant le type et le type CTSE déficient

Pour étudier la régulation de CTSE de gène, deux principaux médicaments épigénétiques, agent de déméthylation 5-aza-2'-désoxycytidine et inhibiteur d'histone déacétylase trichostatine A [37], ont été appliqués à cinq lignées de cellules GC (figure 1C) . Trois CTSE exprimant et deux lignées de cellules GC CTSE déficientes ont été traités, mais nous ne pouvions pas détecter tout changement de CTSE de la transcription (figure 1C). Pour la méthylation, nous avons également cherché des îlots CpG dans la région promotrice suggestive de gène CTSE de l'aide de deux sites humain: "http://www.uscnorris.com/cpgislands2/cpg.aspx" démontrant CpG île chercheur et " http://www.ncbi.nlm.nih.gov "soutenu par le national Center for Biotechnology information (NCBI). Les résultats des deux recherches ont suggéré que le promoteur humain gène CTSE de se caractérise par un faible pourcentage de dinucléotides CpG (55%) et aucune île CpG, qui sont compatibles avec nos résultats (Figure 1C).

En outre, nous avons évalué l'effet de quatre facteurs de transcription qui ont été rapportés pour réguler de nombreux gènes gastro-intestinaux: cdx2
[26], [27], gli
famille ( Gli1
et GH3
) [28], et sox2
[29]. Sous la transduction stable de cdx2
, Gli1
, GH3
et sox2
, cependant, nous ne pouvions pas détecter un changement évident de CTSE de l'expression (figure 1D). À l'heure actuelle, nous ne pouvions pas élucider le mécanisme réglementaire de CTSE de gène, qui devrait être résolu à l'avenir.

cathepsine E (CTSE) est nettement exprimée dans chevalière Carcinome de l'estomac

Pour valider la spéculation à partir des lignées de cellules GC (tableau 1, figure 1A), nous avons ensuite analysé l'expression CTSE dans des échantillons cliniques. Dans un premier temps, 51 échantillons GC-type sig chirurgicalement réséquées ont été évalués. Il est frappant, la coloration évidente de CTSE a été observée dans tous les 51 échantillons examinés et dans 50 des 51 cas, les cellules positives CTSE occupées plus de 90% des cellules cancéreuses de la tumeur (Tableau 2).

Ensuite, 67 spécimens chirurgicaux dérivés de cas GC autres que du type sig ont été analysés, ce qui présente différents modes d'expression CTSE (tableau 2). l'expression dans CTSE type por GC était manifestement plus élevé par rapport aux autres quatre types de GC, mais il est beaucoup plus faible que celle du type sig GC (voir le tableau 2). Prévalence de cellules positives CTSE dans tub1-, tub2-, papillaire et type muc GC est certainement plus bas, mais il est pas si faible que d'autres organes digestifs normaux (tableau 2). images immunocoloration typiques de CTSE dans six types de GC sont présentés dans la figure 2 (sig et Bain1) et Figure S2 (tub2, pap, por et muc).

Basé sur le résultat des prélèvements chirurgicaux, nous avons encore expression CTSE analyse de 84 échantillons de tumeurs gastriques endoscopically réséquées. Par rapport à chirurgicalement spécimens, l'histologie du tissu endoscopically réséqué est beaucoup plus homogène; il était prévu que de là, l'association entre l'expression CTSE et l'histologie du cancer gastrique pourrait être analysé plus précisément. Ils comprenaient 78 cas d'adénocarcinome de stade précoce (7 de type sig, 52 de type Bain1, 12 de type tub2, et 7 de type pap GC) et 6 cas d'adénome précancéreux (tableau 3). expression CTSE de SIG-, tub1-, tub2- et type pap GC dans les tissus endoscopically réséquées ressemble à ceux réséquées chirurgicalement avec une histologie correspondante (tableaux 2 et 3). Calculé CTSE expression scores (tableau 3) montrent clairement une tendance qui CTSE exprime certainement en sig type GC alors qu'elle tend à être déficient en GC tub1- et de type tub2. Il devrait être également noté que l'adénome gastrique, ce qui peut être considéré comme caractéristique histologique plus différenciée par rapport type Bain1 GC, a montré la carence la plus forte de CTSE (tableau 3).

CTSE est non seulement un indicateur de Signet -ring Carcinome de l'estomac, mais aussi un gastrique Différenciation Marker

pour examiner la répartition des CTSE dans l'intestin normal et l'estomac précancéreuse, immunocoloration de CTSE a également été appliquée à l'estomac non-cancéreux et d'autres organes de l'appareil digestif. Dans l'estomac sans atrophie et métaplasie intestinale, l'expression de CTSE est clairement observé dans les glandes fundiques et pyloriques de l'estomac (Figure S3D /S3A et S3E /S3B). glandes cardiaques de l'estomac expriment également CTSE, mais il est plutôt plus faible que l'expression dans les glandes fundiques ou pyloriques (Figure S3F /S3C). Contrastively, CTSE est rarement exprimée dans l'oesophage, du duodénum, ​​l'intestin grêle et le gros intestin (figure S4).

Nous avons évalué plus l'expression CTSE dans la muqueuse gastrique avec métaplasie intestinale, une affection précancéreuse bien connue de l'estomac [26 ], [29], [38]. Comme le montre la figure 3A, les glandes fundiques gastriques et les glandes métaplasiques intestinales présentent une coloration contrastive des CTSE. En règle générale, la métaplasie intestinale est classé en deux catégories: type mixte gastrique et intestinal (type incomplet) et le type uniquement intestinal (type complet) [29], [38]. Il est bien établi que l'ancien exprime à la fois MUC5AC (marqueur gastrique mucine) et MUC2 (marqueur intestinal mucine), alors que celui-ci exprime un pas MUC5AC mais MUC2 [29]. Dans les deux types de métaplasie intestinale dans l'estomac, nous avons confirmé que l'expression de CTSE est similaire à MUC5AC et opposée à MUC2 (figure 3B et 3C).

Pour évaluer l'association d'expression CTSE avec MUC5AC et MUC2 expression, leur immunocoloration a été statistiquement évaluée en utilisant endoscopically réséqué 84 tissus tumoraux gastriques (Tableau S2). La corrélation des analyses ont montré que l'expression CTSE est positivement associée avec le marqueur gastrique MUC5AC ( p
< 0,0001) et négativement avec le marqueur intestinal MUC2 ( p = 0,0019
). Synthétiquement, nous avons conclu que CTSE, comme MUC5AC, est l'un des marqueurs de différenciation gastriques.

Plus indifférencié Tubular adénocarcinome Tend à Arise de l'arrière-plan muqueux avec diminution de deux "gastrique" et "intestinale" Caractéristiques

Pour étudier l'étape d'initiation de la tumorigenèse gastrique, la muqueuse du cancer précoce et l'adénome de fond a également été évaluée, en utilisant 84 échantillons endoscopically réséquées. CTSE expression de la muqueuse gastrique non cancéreuse adjacente à une lésion de la tumeur a été évaluée, ainsi que MUC5AC et MUC2 (tableau 4). Pour la sig type GC, à la fois la lésion de tumeur et la muqueuse principalement montré une forte expression de CTSE et MUC5AC, alors que l'expression de MUC2 était très faible dans les deux d'entre eux (Tableau 4). expression des motifs similaires des trois marqueurs dans la tumeur et la muqueuse adjacente suggèrent que l'initiation du type sig GC reflète les caractéristiques de base des muqueuses, du point de vue de la différenciation "gastrique" et "intestinale". Autrement dit, de type sig GC avec des propriétés gastriques non-intestinaux se produit initialement à partir de la muqueuse de fond avec des caractéristiques non-intestinales et gastriques.

Pour adénome gastrique et adénocarcinome tubulaire (Bain1 /tub2 type GC), contrastively, les profils d'expression des trois marqueurs sont très intéressants (voir le tableau 4). tumeurs gastriques Plus indifférenciées ont tendance à augmenter l'expression des CTSE et MUC5AC dans les lésions tumorales (tub2 > Bain1 > adénome), mais diminuer l'expression de ces marqueurs gastriques dans la muqueuse de fond (tub2 < Bain1 < adénome). Ceux-ci suggèrent que plus indifférenciées (donc plus malignes) tumeurs gastriques aptes à montrer la propriété gastrique plus forte, alors qu'ils ont tendance à se produire à partir de la muqueuse de fond avec une diminution des caractéristiques gastriques. D'autre part, les tumeurs gastriques plus différenciées ont tendance à exprimer MUC2 dans les deux lésions tumorales et fond muqueuse (adénome > Bain1 > tub2). Ceci suggère que la différenciation intestinale de fond muqueuse gastrique conduit à des tumeurs gastriques intestinalement différenciés (donc moins malignes).

Pour type pap GC, expressions de CTSE, MUC5AC et MUC2 étaient considérablement forte à la fois la lésion tumorale et de la muqueuse, qui sont tout à fait différents des motifs d'expression du /de type tub2 de Bain1 GC (tableau 4) entourant. De type Pap GC est classé en type intestinal de Lauren avec /type tub2 Bain1 GC, mais nos analyses actuelles a suggéré que pap-type et /tub2 type Bain1 GC ne devraient pas traités dans la même catégorie, du point de vue gastrique et intestinale fonctionnalités. Dans nos précédents rapports analysant Brm
[3], un possible gène marqueur clé de la différenciation de l'intestin, l'expression de BRM gastrique adénocarcinome papillaire (pap) est tout à fait différent de l'adénocarcinome tubulaire de l'estomac (Bain1 et tub2). À l'heure actuelle, nous sommes convaincus que la différence histologique entre-type pap GC et /type tub2 Bain1 GC devrait être strictement reconnu.

Discussion

Rôles et règlement de la cathepsine E (CTSE) dans le estomac
humain

cathepsine E (CTSE), une protéase aspartique intracellulaire non lysosomale, est l'une des proteases de la famille de la cathepsine [39], [40]. Une autre protéase aspartique cathespin D (CTSD), un homologue de CTSE, constitue une importante activité protéolytique dans le composant lysosomale, mais les rôles fonctionnels des CTSE n'a pas été élucidé [24], [39]. Distribution des deux proteinases est tout à fait différent: CTSD est universellement existé dans les lysosomes de divers tissus (en accord avec le résultat de la figure 1A), alors que CTSE est principalement exprimé dans les cellules du système immunitaire telles que macropahges, des lymphocytes, des cellules dendritiques, etc. [39 ]. L'expression de CTSE dans l'estomac a également été rapportée [23], [24], bien que la fonction physiologique et pathologique CTSE gastrique est actuellement inconnu [39], [40]. Dans la présente étude évaluant jusqu'à 202 échantillons gastriques cliniques, nous avons montré clairement CTSE est à la fois le marqueur gastrique de différenciation et le marqueur de carcinome chevalière gastrique, mais la signification de l'expression CTSE gastrique reste incertain.

Pour analyser la relation d'expression CTSE et le potentiel tumorigène, on produit le vecteur retroviral à base de MuLV [26] portant CTSE
gène et transduits dans les gastriques lignées cellulaires cancéreuses CTSE déficientes: MKN-74, SH-10 -TC et MKN-1. Nous avons évalué la possibilité de modifier la production de mucine gastrique (figure S5) ou leurs modifications morphologiques, mais aucun changement n'a été observé. L'utilisation de ces lignées cellulaires établies, nous avons en outre effectué à la fois la formation de colonies dans la gélose molle [30] et induction de l'apoptose par le traitement de l'actinomycine D, la camptothécine et la staurosporine [41]. Cependant, nous avons pu détecter l'effet de l'expression CTSE ni sur la croissance indépendante de l'ancrage, ni la résistance à l'apoptose induite par le médicament (données non présentées)

Dans l'étude récente, CTSE a été signalé à avoir un certain potentiel anti-oncogène.: kawakubo et al.
démontré que CTSE induit spécifiquement arrêt de la croissance et de l'apoptose dans les lignées cellulaires du cancer de la prostate humain, en catalysant la libération protéolytique du ligand induisant l'apoptose lié au facteur de nécrose tumorale soluble (TRAIL) à partir de la surface de la cellule [42 ]. Cependant, les souris déficientes en CTSE n'a ni exposition phénotype prédisposée au cancer, ni présents troubles gastriques évidentes [43], [44], [45]. À l'heure actuelle, il est une question de conjecture si l'activité antitumorale déclarée de CTSE pourrait appliquer le cancer gastrique, y compris le carcinome chevalière. Avec sa régulation et la fonction physiologique mal connu, les effets de CTSE sur la différenciation gastrique et la tumorigenèse sont des problèmes fondamentaux qui doivent être résolus dans le futur.

Gastric cancérisation du point de vue de la propriété "gastrique" et "intestinale" d'arrière-plan

• PLOS ONE: acide rétinoïque-Activé Ndrg1a refoule Wnt /β-caténine de signalisation pour autoriser Xenopus Pancréas, Œsophage, estomac, duodénum et Spécifications
• PLOS ONE: postopératoires chimioradiothérapie Combiné avec épirubicine-Based Triplet chimiothérapie pour adénocarcinome localement avancé de l'estomac ou de la jonction gastro-oesophagien