maior frequência de cagA Epiya-C sítios de fosforilação em amostras de H. pylori de parentes de primeiro grau de câncer gástrico patients

maior frequência de cagA Epiya-C sítios de fosforilação em H. pylori
cepas de parentes de primeiro grau de pacientes com câncer gástrico
Abstract
Para avaliar a prevalência de mais virulentas de H. pylori
genótipos em familiares de pacientes com câncer gástrico e em pacientes sem história familiar de câncer gástrico.
Métodos
Nós avaliadas prospectivamente a prevalência da infecção por H. pylori
cepas mais virulentas em 60 familiares de pacientes com câncer gástrico, comparando os resultados com os obtidos a partir de 49 pacientes sem história familiar de câncer gástrico. H. pylori
i estatuto foi determinada pelo teste da urease, histologia e presença de H. pylori ure
A. O gene citotoxina associada (cag
A), a cag
A-Epiya e gene citotoxina vacuolar (vac
A) foram digitados por PCR e do cag
A digitação Epiya foi confirmada por sequenciação.
resultados
Os parentes com câncer gástrico foram significativos e de forma independente mais frequentemente colonizado por H. pylori
estirpes com maior número de segmentos CagA-Epiya-C (OR = 4,23, IC 95% = 1,53-11,69) e com os vac s1m1 mais virulentas
um genótipo (OR = 2,80, IC = 1,04-7,51 95%). maior número de segmentos Epiya-C foram associados com aumento da inflamação corpo gástrico, hiperplasia foveolar e atrofia. A infecção por vac s1m1
um genótipo foi associado com o aumento da gastrite antral e corpus.
Conclusões
demonstramos que parentes de pacientes com câncer gástrico são mais freqüentemente colonizado pelo H. pylori cag mais virulento
A e vac of a genótipos, que podem contribuir para aumentar o risco de câncer gástrico.
Palavras-chave
Helicobacter pylori
H. pylori o câncer gástrico
CagA-Epiya H. pylori /vac
a fundo

Helicobacter pylori, uma bactéria Gram-negativa que infecta o estômago de aproximadamente metade da população do mundo, está associada com o desenvolvimento de doenças gastroduodenais incluindo gástrica duodenal e úlcera péptica, adenocarcinoma gástrico distal e tecido linfóide associado à mucosa linfoma [1]. Estima-se que os indivíduos infectados com H. pylori
ter mais do que duas vezes maior risco de desenvolver cancro gástrico em comparação com os não-infectado [2], embora estudos japoneses pode sugerir que quase todo o cancro gástrico está relacionada com Helicobacter
[3]. Por apenas 1 a 5% do H. pylori pessoas
infectados desenvolvem câncer gástrico permanece desconhecida e parece depender da relação entre a genética do hospedeiro, ambientais e fatores de virulência da bactéria.
Vários estudos têm demonstrado um risco aumentado de desenvolvimento de câncer gástrico em familiares de pacientes com a doença [2, 4]. Da mesma forma, um aumento da prevalência de lesões gástricas pré-cancerosas tem sido observado em familiares de pacientes com câncer gástrico [5]. No entanto, os mecanismos moleculares pelos quais H. pylori
desencadeia o processo conducente à carcinoma gástrico permanecem largamente desconhecidos.
O mais investigado pylori
i virulência determinante, o cag-
PAI (gene citotoxina associada H. patogenicidade ilha), codifica um tipo de sistema de secreção IV (T4SS), que é responsável pela entrada de uma proteína efetora, CagA, em células hospedeiras gástricas epiteliais [6, 7]. Uma vez translocada, CagA localiza na superfície interna da membrana do plasma onde ele é fosforilada nos resíduos de tryrosine dentro motivos de fosforilação na região variável carboxi-terminal da proteína por vários membros das tirosina-cinases da família src. Uma vez fosforilada, CagA forma um complexo físico com SHP-2 fosfatase e dispara sinais celulares anormais, que aumentam o risco de células danificadas adquirir mudanças genéticas pré-cancerosas [8, 9].
Os motivos de fosforilação, definida como uma sequência de cinco amino ácidos (Glu-Pro-Ile-Tir-Ala), são classificados como Epiya-a, Epiya-B, C e Epiya-Epiya-D, de acordo com as sequências de aminoácidos que flanqueiam os motivos. proteínas CagA quase sempre possuem segmentos Epiya-A e -B, que são seguidos por ninguém, um, dois ou três segmentos C em cepas circulantes nos países ocidentais, ou um segmento D, tanto em amostras Ásia Oriental [10, 11]. Também tem sido demonstrado que a infecção com estirpes CagA tendo elevado número de segmentos Epiya-C dá um maior risco de lesões gástricas pré-cancerosas e cancro [12-15].
Outro fator de virulência de H. pylori é uma proteína
conhecido como citotoxina vacuolar a (VacA), o que provoca vacuolização citoplasmática em células epiteliais gástricas, aumentando a célula de plasma e a permeabilidade da membrana mitocondrial conduzindo a apoptose. A produção da citotoxina está associada com o CAG-PAI mas depende da VAC
um genótipo [16-18]. A VAC
A é um gene polimórfico com duas principais genótipos região sinal S1 e S2, e dois alelos diferentes em meados da região do gene nomeado m1 e m2. Infecção com estirpes que possuem o genótipo s1m1 tem sido associada com hypochlorhydria pré-cancerosa gástrica [17] e carcinoma gástrico [19].
Em um estudo recente realizado em Fortaleza, no nordeste do Brasil, em uma área de alta prevalência de câncer gástrico e H . pylori
, nosso grupo demonstrou uma alta prevalência de lesões, quer pangastrite ou pré-cancerosas em familiares de pacientes com câncer gástrico infectados com H. pylori
[20].
Além disso, Argent et al
. , (2008) observaram uma associação entre vac
um genótipo s1m1 do H. pylori
tensões e baixa secreção de ácido gástrico em parentes de primeiro grau de pacientes com câncer gástrico da Escócia [21]. Caso contrário, os autores não encontraram associações entre o estado e ou o número de tirosina fosforilada motivos e lesões gástricas em que a população positiva CagA.
Desde diferenças geográficas têm sido observadas entre os estudos que avaliaram associação entre H. pylori
fatores de virulência e doenças, o objetivo deste estudo transversal prospectivo foi avaliar os motivos CagA Epiya do H. pylori
estirpes em parentes de primeiro grau de pacientes com câncer gástrico, comparando os resultados com os obtidos a partir de um grupo de controle composto por indivíduos sem história familiar de câncer gástrico. Porque o genótipo s1m1 da vac
A H. pylori
foi visto para ser observada com maior frequência nas cepas de pacientes com câncer gástrico, também avaliamos o vac
A mosaicismo nas cepas.
Métodos
o estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética de Pesquisa da Universidade do Ceará, e o consentimento informado foi obtido de cada sujeito.
pacientes
Sessenta H. pylori
parentes de primeiro grau -positivas [42 fêmea; com idade média de 40,42 ± 11,80; (4 irmãos e 13 irmãs, com idade média 56,24 ± 11,80 anos, 14 filhos e 29 filhas; 34,51 anos ± 7,66 média)] de pacientes com câncer gástrico de acompanhamento ambulatorial no Hospital Walter Cantídio foram convidados a participar. O grupo controle foi composto por 49 (32 do sexo feminino, 43,20 anos ± 12,59 dizer) H. pylori
pacientes -positivas que simultaneamente submetidos a endoscopia digestiva alta para investigação da dispepsia, ao mesmo Hospital. Eles não tinham história familiar de câncer gástrico, e foram classe social combinado com o grupo de estudo. Pacientes com história de cirurgia gástrica, hemorragia gastrointestinal ativa, uso de esteróides, medicamentos imunossupressores, NSAIDs, inibidores da bomba de protões ou que foram tratados durante H. pylori
erradicação foram excluídos do estudo. Parentes e controles não foram incluídos se eles eram menores de 18 anos ou acima de 81 anos.
Coleção fragmento de biopsia
fragmentos gástricas foram obtidos durante a endoscopia de cinco locais diferentes, como recomendado pelo Sistema de Sydney Atualizado para a classificação de gastrite [22] . Além disso, dois fragmentos foram coletados a partir da mucosa antral para o teste rápido da urease e de DNA para investigar a presença de H. pylori
genes. A infecção por H. pylori
foi confirmado por resultados positivos em pelo menos dois testes, incluindo um teste da urease, análise histológica e a presença de ure
Um gene de H. pylori
.
Histologia
endoscópica as amostras de biópsia da mucosa gástrica foram fixados em formalina a 10% e embebidos em cera de parafina, e 4-micrometros de secções foram coradas com hematoxilina-eosina para análise histológica de rotina. Gastrite foi classificada de acordo com o sistema de Sydney Atualizado. As amostras de mucosa gástrica, também foram coradas com Giemsa para a detecção de H. pylori.
Extracção do ADN O ADN
antral gástrica foi extraído utilizando o kit QIAmp (Qiagen, Hilden, Alemanha) de acordo com o fabricante do recomendações com modificações menores [23]. A concentração de ADN foi determinada por espectrofotometria utilizando NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Wilmington, NC) e armazenado a -20 ° C até à sua utilização.
A presença de H. pylori ure
específica
Um gene foi avaliada de acordo a metodologia reportada por Clayton et ai.
, [24]. O padrão
Tx30a H. pylori
estirpe foi usada como um controlo positivo, e uma estirpe de Escherichia coli
e água destilada foram ambos utilizados como controlos negativos.
O termociclador GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, Foster City, CA) foi usado para todas as reacções. Os produtos amplificados foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 2%, corado com brometo de etídio e analisados ​​em um transiluminador de luz ultravioleta.
Vac
A e cag
A detecção
amplificação por PCR da vac
Uma sequência de sinal e a região média foi realizada usando os oligonucleótidos iniciadores descritos por Atherton et ai
., [15]. As cepas foram inicialmente classificados como tipo S1 ou S2 e tipo m1 ou m2. Todos H. pylori
estirpes com S1 foram ainda caracterizados em S1A, s1b ou s1c [25, 26].
O cag of a gene foi amplificado por meio de dois anteriormente descritos conjunto de pares de primers [27, 28]. Uma estirpe de H. pylori
da nossa colecção (1010-1095), conhecido por ser vac
Um s1m1 e cag
A-positivo, foi utilizado como um controlo positivo, e o s2m2 vac Um
genótipo, cag
A-negativo padrão Tx30a H. pylori
tensão e água destilada foram ambos utilizados como controlos negativos. As H. pylori
estirpes foram consideradas CAG
A-positivo quando, pelo menos, uma das duas reacções foi positiva.
Amplificação da região variável 3 'do cag
Um
Para a amplificação por PCR da região variável de 3 'do cag
um gene (que contém as sequências Epiya), de 20 a 100 ng de ADN foram adicionados a uma solução tampão de polimerase de ADN de Taq a 1% (KCl 50 mM e Tris-HCl 10 mM, pH 8,0), MgCl 1,5 mM 2, 100 ^ M de cada desoxinucleótido, 1,0 U Platinum Taq ADN polimerase (Invitrogen, São Paulo, Brasil), e 10 pmol de cada iniciador, para um volume total da solução de 20 mL. Os iniciadores utilizados foram previamente descrito por Yamaoka et ai
. [29]. As condições de reacção foram: 95 ° C durante 5 minutos, seguido por 35 ciclos de 95 ° C durante 1 minuto, 50 ° C durante 1 minuto, e 72 ° C durante 1 minuto, terminando com 72 ° C durante 7 minutos. A reacção originou produtos de 500-850 pb como se segue: Epiya-AB: 500 pb; Epiya-ABC: 640 pb; Epiya-ABCC: 740 pb e Epiya-ABCCC: 850 pb (Figura 1). Figura 1 Eletroforese de amostras representativas com diferentes padrões CagA Epiya visto em familiares de pacientes com câncer gástrico e controles. As colunas 2, 3 e 5: Epiya-ABCC (740 pb); coluna 4: Epiya-ABCCC (850 pb); coluna 6: Epiya-ABC (640 pb) e Coluna 7: Epiya-AB (500 pb). Superior:. Alinhamento parcial da sequenciação dos aminoácidos das cepas CagA carboxi-terminal e uma estirpe de referência (H. pylori
26695)
Nós também utilizado o método descrito por Argent et al
. [30] para a amplificação por PCR da extremidade 3 'da região variável da cag
Um gene que contém as sequências Epiya, a fim de melhorar a exactidão dos resultados.
A sequenciação da extremidade 3' da região variável de CAG
a
Um subconjunto de amostras foi selecionado aleatoriamente para a sequenciação, a fim de confirmar os resultados da PCR. Os produtos de PCR foram purificados com o Assistente de SV Gel e PCR Sistema Clean-up (Promega, Madison, MI) de acordo com as recomendações do fabricante. Os produtos purificados foram sequenciados utilizando um kit de sequenciação do ciclo BigDye Terminator v3.1 em ABI 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA). As sequências obtidas foram alinhadas usando o Programa da Assembléia Sequence CAP3 (disponível em: http:... //PBIL univ-lyon1 fr /cap3 php). Após o alinhamento, sequências de nucleótidos foram transformados em sequências de aminoácidos, usando o programa de blastx (disponível a partir de: http: //blast do NCBI NLM NIH gov /cgi explosão.....) E comparadas com sequências em depositados o GenBank (http: //www NCBI NLM nih gov /Genbank /....)
análise estatística
os dados foram analisados ​​com SPSS (Inc. Chicago, IL), versão. 17.0. O risco de parentes de carcinoma gástrico para ser infectado por cepas mais virulentas, com o aumento do número de motivos Epiya-C e vac s1m1
um genótipo, foi inicialmente avaliada em análise univariada. Para isso, cag of a estirpes foram estratificados em aqueles que possuem pelo menos um segmento Epiya-C e aqueles com mais de um segmento Epiya-C eo vac mais virulento
um genótipo s1m1 foi comparado com s1m2 mais s2m2. As variáveis ​​com uma p
-VALOR menos do que ou igual a 0,25 foram incluídas no modelo final de regressão logística, controlando-se as influências da idade e sexo. Odds Ratio (OR) e intervalos de confiança de 95% (IC) foram calculados. A aptidão modelo logístico foi avaliada com o teste de Hosmer-Lemeshow [31]. Associação de o número de segmentos Epiya-C e a presença de Vac of a genótipos virulentas com o grau de inflamação gástrica, a atrofia e a metaplasia intestinal foi feita pelo teste de Mann-Whitney de duas caudas. O nível de significância foi estabelecido em ap valor
≤0.05.
Resultado
A presença de H. pylori
ure específica
Um gene foi detectado na mucosa gástrica de todos os 109 indivíduos estudados.
CAG
de um estado dos pacientes
CAG
uma positividade foi observado nos fragmentos gástricas de 51 (85,00%) de 60 parentes cancro gástrico e naqueles a partir de 43 (87,76%) de 49 controlos , sem diferença entre os grupos (p = 0,68
; OR = 1,26, IC 95% = 0,37-4,40)
O número de segmentos Epiya-C
O padrão Epiya de todos cag
A. -positivas de ambos os parentes de pacientes com câncer gástrico e controles foram digitados com sucesso. A metodologia Yamaoka permitiu a detecção da infecção estirpe mista. A concordância entre os métodos utilizados foi de quase 100%. Os resultados foram confirmados por sequenciação da região variável de 3 'de cag
A em 30 produtos de PCR seleccionados aleatoriamente
quatro padrões de motivos Epiya foram encontrados:. AB, ABC, ABCC, e ABCCC. Não se observou qualquer motivo asiático Epiya-D. A distribuição dos genótipos Epiya é mostrado na Tabela 1 1.Table distribuição dos genótipos Epiya nas parentes cancro gástrico (n = 51) e controlos (n = 43) colonizada por uma cag estirpes A positivas
Epiya Genótipo
grupo n Controle (%)
parentes câncer gástrico
Irmãos n (%)
prole n (%)
EPIYA- AB
03 (7,0)
0
0
Epiya-ABC
32 (74,4)
09 (60,0)
20 (55,5)
Epiya-ABCC
07 (16,3)
04 (26,7)
12 (33,2)
Epiya-ABCCC
01 (2.3)
01 (6,7)
02 (5.6)
Epiya-ABC + ABCC
0
01 (6,7)
02 (5.6)
total
43 (100,0)
15 (100,0)
36 (100,0)
vac
a distribuição mosaicismo
a distribuição de vac of a genótipos é mostrada na Tabela 2. em 59 casos (54,13%), a vac
um genótipo foi s1m1, em 35 (32,11%) foi s1m2 e 6 (5,50%) s2m2. Em três (2,75%) casos duas vac of a genótipos foram observados e em seis (5,50%) foi detectada apenas a sequência de sinal (S1). DNA não foi suficiente para genótipo m alelo em cada quatro entre esses casos e em dois, m não foi tipificável. Em todos os casos com estirpes S1 foram genotipados como s1b, exceto em um caso que foi colonizada por S1A e s1b strains.Table 2 Distribuição das vac A alelos de amostras de H. pylori de familiares de pacientes com câncer gástrico (n = 55) e controle grupo (n = 48)
vac
A Genotypes1
Controle grupo n (%)
parentes câncer gástrico
Irmãos n (%)

Offspring n (%)
s1m1
23 (47,92)
10 (66,67)
26 (65.00)
s1m2
21 (43,75)
04 (26,67)
10 (25,00)
s2m2
03 (6,25)
01 (6,67)
02 (5,00)
Mixed2
01 (2,08)
0
02 (5,00)
total
48 (100)
15 (100)
40 (100)
1Only vac
um genótipo s1 foi identificada em 6 casos ( 1 controle, 2 irmãos e 3 filhotes de parentes com câncer gástrico); infecção 2Mixed por s1m1 e s2m2 ou s1m1 e s1m2 (dois casos).
A infecção pelo vac mais toxigênica
um genótipo (s1m1) foi mais frequentemente observada nos parentes com câncer gástrico (65,45%) do que nos controles ( 47,92%). Quando S e M alelos foram avaliadas individualmente, não foi observada diferença na frequência do alelo s1 entre os grupos, mas alelo m1 foi mais frequentemente observada nos parentes com câncer gástrico.
Associação entre o número de motivos Epiya-C eo vac
Um genótipo e história familiar de câncer gástrico s1m1
os parentes de pacientes com câncer gástrico foram significativamente e de forma independente mais frequentemente colonizado por H. pylori
estirpes com maior número segmentos CagA-Epiya-C e com a mais vac s1m1 virulenta
um genótipo mesmo após o ajuste para idade e sexo (Tabela 3) .table 3 covariáveis ​​associadas com câncer gástrico em parentes de primeiro grau de pacientes com câncer gástrico em comparação com indivíduos sem história familiar de câncer gástrico
variáveis ​​
A análise univariada
multivariada análise
p
OU
95% CI
p
Sexo
0,27
- -
- Idade
0,30
- -
- > 1 Epiya-C motivo
0,01
4,23
1,53-11,69
0,006
s1m1 vac
alelo
0,17
2,80
1,04-7,51
0,04
O teste de Hosmer-Lemeshow foi fit (8 graus de liberdade, p > 0,20, com 10 etapas)
Não foi observada diferença entre irmãos e filhos em relação à infecção por cepas que contêm um maior número de Epiya. motivos -C (p
= 0,98; OR = 1,20, IC 95% = 0,30-4,86) eo vac of a genótipos s1m1 vs. s1m2 e s2m2 (p
= 0,84; OR = 0,92, 95 Cl% = 0,22-3,97), como mostrado nas Tabelas 1 e 2.
associações entre o número de segmentos Epiya-C e VAC of a genótipos e alterações histológicas gástricas
os graus de gastrite corpus (p
= 0,04), a actividade antro (p
= 0,01) e a actividade corpus foram significativamente maiores no relativa de doentes com cancro gástrico do que no grupo de controlo.
Um maior número de segmentos Epiya-C foi associada com gástrica corpus inflamação (p
= 0,04), hiperplasia foveolar corpo gástrico (p
= 0,05) e atrofia corpo gástrico (p
= 0,05) nos familiares de pacientes com câncer gástrico.
Infecção pelo mais vac virulenta
um genótipo s1m1 foi associada com antral mais acentuada (p
= 0,03) e corpus (p
= 0,05) gastrite, quando ambos os grupos foram avaliadas em conjunto.
Discussão
H. pylori
é reconhecido como o fator de risco mais importante para câncer gástrico distal. Além disso, o aumento das taxas da doença em parentes de pontos câncer gástrico para sediar a genética e /ou participação dos mais H. pylori
cepas de virulência como fatores de risco.
Neste estudo, demonstramos que familiares de câncer gástrico os pacientes são mais frequentemente colonizados por H. pylori
estirpes com o vac mais virulento
um genótipo, s1m1, e por cepas CagA-positivas possuem um maior número de segmentos Epiya-C do que os H. pylori
cepas dos pacientes sem uma história familiar da doença.
Embora nenhum estudo anterior demonstrou que os parentes com câncer gástrico são mais frequentemente colonizados por H. pylori
cepas mais virulentas, infecção por vac
a s1m1 foi associado com baixa secreção de ácido gástrico, uma condição pré-cancerosa, em parentes de primeiro grau de pacientes com câncer gástrico escocês [21]. Caso contrário, não houve associação entre a secreção de ácido gástrico e o número de segmentos CagA Epiya-C foi observado pelos autores [21].
CagA é o primeiro oncoproteína bacteriana a ser identificados [32]. A proteína é entregue na célula epitelial gástrica através de um T4SS bacteriana e se localiza no interior da membrana da célula, onde é fosforilado por cinases da célula hospedeira. Após a fosforilação, o segmento Epiya-C interage com SHP-2 da fosfatase, uma oncoproteína bona fide que está associada a uma série de cancros humanos. Quanto maior o número de segmentos Epiya-C, maior a afinidade para SHP-2 que é necessária para uma activação de ERK total de via /MAPK.
Infecção com CagA estirpes que possuam maior número de segmentos Epiya-C tem sido associada com lesões gástricas pré-cancerosas e câncer gástrico em caucasianos [11-13, 30] e populações brasileiras [15]. o que é bem estabelecido que a infecção por H. pylori
é predominantemente adquirida na infância e que a infecção persiste frequentemente para a vida se não forem tratados. Os dados epidemiológicos e análise genética de H. pylori
estirpes demonstraram que as linhagens são geralmente adquiridos no seio da família. Na verdade, a mãe infectada e os irmãos infectados são os principais fatores de risco para a aquisição da infecção [33, 34] e métodos de impressão digital genética demonstraram homogeneidade genética na H. pylori
estirpes da família. Com base nestes resultados e os resultados do presente estudo, pode-se supor que parentes de primeiro grau de pacientes com câncer gástrico podem compartilhar mais virulentas de H. pylori
cepas que podem aumentar o risco de câncer gástrico.
Como mencionado acima, parentes de primeiro grau de pacientes com câncer gástrico também compartilham o mesmo ou similar fundo genético que pode aumentar o risco de câncer gástrico. Os polimorfismos em genes que codificam citocinas pró-inflamatórias, tais como a interleucina 1 beta (IL-1β), antagonista do receptor de interleucina-1 (IL1ra) e factor de necrose tumoral-alfa (TNF-α) são aceites como factores de risco de cancro gástrico, dependendo a região geográfica [35-39]. Também tem sido demonstrado que ter o aumento do número de genótipos pró-inflamatórias [36, 37], bem como uma infecção concomitante por mais virulentas estirpes de H. pylori
progressivamente aumenta o risco de lesões pré-cancerígenas e o cancro gástrico [39].
Conclusões
em conclusão, demonstramos que parentes de pacientes com câncer gástrico são mais freqüentemente colonizado pelo H. pylori cag mais virulento
a e vac of a genótipos, o que pode, além de genética humana predisposições, aumentar ainda mais o risco de cancro gástrico, proporcionando assim razões adicionais para entender melhor essas infecções e, talvez, o seu tratamento erradicante alvo.
Declarações
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Nacional de Ciências e Tecnologia em Biomedicina fazer Semiárido Brasileiro (INCT) e CNPq, Brasil. Estamos gratos ao Professor Barry J Marshall para a leitura crítica do manuscrito.
Os resultados do estudo foi apresentado como resumo na Digestive Disease Week, DDW 2011, Chicago Estados Unidos.
Autores 'original apresentada arquivos para imagens
abaixo estão os links para os arquivos enviados originais dos autores para imagens. 12876_2012_780_MOESM1_ESM.jpeg Autores 'arquivo original para a figura 1 Conflito de interesses
Os autores declaram não-confllict de interesse.
Autores' contribuições
DMMQ supervisionados trabalho de laboratório e analisados ​​os dados de escrita crítica e revisão de manuscritos., SAB realizada DNA extração, PCR e sequenciamento e análise estatística, GAR e AMCR, participou na implementação do estudo e escreveu o manuscrito, CISMS e MHB realizada extração de DNA, gestão de PCR e banco de dados, MBN, ABF e AMN participou na implementação do estudo , coleta de dados, gerenciamento de banco de dados e análise estatística. RLG e AAML realizada análise crítica dos dados e revisão do manuscrito. LLBCB participou na concepção, design, implementação, coordenação do estudo e contribuíram para manuscrito escrito escrita crítica e revisão. Todos os autores leram e aprovaram a versão final do manuscrito.

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